中圖分類號：S641.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2025）07-157-09

Effects of Rumex dentatus enzymes pretreatment on physiological and biochemical characteristics of pepper seedlings under heat stress

LI Jinling'，LI Baixue'，WANG Yichao'，YAO Xiang'，MA Yongbin2，DU Qingjie'，WANG Hu¹ ，WANG Xueting'，LIJuanqi'，WANGJiqing'，LIMeng'，XIAOHuaijuan'

（1.CollgeoureuualUitoaii Zhengzhou450041，Henan，China）

Abstract：Toexplore theroleofplant enzymes inheatdamage，the pepper variety Haoyoumingyue wasusedas the experimental material，andfive treatmentsweresetup： Usingclean waterasthecontrol（CK），and Rumexdentatusenzymes werediluted50-fold（T50），100-fold（T100），20-fold（T200），and40-fold（T400），respectively.Whenthetwootyledons of the pepper seedlings were fully expanded，the Rumex dentatus enzyme treatment was carried out.After 21 days， the seedlings were transferred to a high-temperature environment of 45^°C for 3 days.By measuring the physiological indicatorssuchasMDAand H₂O₂ content，the activityof three antioxidant enzymes（SOD，POD，and CAT），and the expressionlevelsofheat-stress-relatedgenes intheleavesofpepperseedlingsafterrootappication，theeffectsofRumex dentatus enzymeson the physiologicaland biochemical characteristicsof pepper seedlings under heatstress were clarified.Theresultsshowedthatcomparedwith CK，theT10Otreatmentcouldeffectively increasetherelative watercontent and the activityofSODand CAT in pepperseedlings under heat stress，and at the same time，it also reduced the POD activity，thecontentofMDA， H₂O₂ and proline，and theproduction rateof O₂^- .Theresults of fluorescence quantitative PCR indicated that the Rumex dentatus enzyme treatment enhancedthe tolerance of pepper seedlings to heat stress byregulatingthe expressionlevelsofantioxidant-relatedgenesCaPOD，CaSOD，CaCATandheat-stres-relatedgenesCaHsfA2，CaHSP16.4，CaHSP70.1，CaWRKY55.Inconclusion，the exogenous Rumexdentatus enzyme treatmentcanalleviate thedamage causedbyheat stress to pepper seedlings，andthe effectof the Rumex dentatus enzyme diluted 10o-fold is the best.

Vwords：Pepper;Heat stress;Rumex dentatus enzymes;Physiological and biochemical characteristic

隨著全球氣候變暖，熱害已成為影響植物生長和作物產量的最大限制因素之一。熱脅迫對植物的損害貫穿整個生長發(fā)育周期。在萌發(fā)階段，高溫脅迫會導致種子的胚芽長度和根尖數(shù)量顯著減少[1]。營養(yǎng)生長過程中，熱脅迫會引起細胞膜系統(tǒng)損傷、葉綠素合成速率下降和葉片氣孔導度顯著降低，光合速率下降，影響植株株高、葉面積，嚴重時可能導致植株萎蔫甚至死亡2。生殖生長期，熱脅迫會引發(fā)花粉敗育、花粉管生長異常，雌蕊細胞中活性氧（ROS）過量堆積，誘導雌蕊細胞程序性死亡[3]。為應對熱脅迫，植物會激活自身的防御系統(tǒng)，一方面通過超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等關鍵酶清除ROS，減輕膜脂過氧化損害4；另一方面通過滲透調節(jié)作用維持細胞膜完整性5。陳艷等發(fā)現(xiàn)，熱脅迫會提高番茄幼苗的脯氨酸、過氧化氫 （H₂O₂） 、超氧陰離子（ O₂^-? ）和丙二醛（MDA）含量，同時誘導熱脅迫相關基因（SIHsfA1a、SIHsfA1b、SIHSP70、SIHSP9O）和抗氧化酶相關基因（SIPOD、SICAT、SIAPX的表達。季萌楠等研究發(fā)現(xiàn)， 40^°C 的持續(xù)高溫提高了辣椒葉片中滲透調節(jié)物質含量、抗氧化酶活性，并且誘導熱脅迫相關基因（CaWRKY19、CaWRKY55、CaWRKY40）的表達。申夢吟凹研究發(fā)現(xiàn)，熱脅迫下甜椒葉片SOD、POD、CAT活性均呈先上升后下降的趨勢，MDA含量隨熱脅迫時間的增加持續(xù)升高，甜椒產量顯著降低。這些研究共同印證了熱害對植物生理和分子層面均會造成嚴重損傷，威脅作物生產。

植物酵素是一種以植物為原料，添加或不添加輔料，經(jīng)過微生物厭氧發(fā)酵得到的具有特定生物活性的物質8。因其含有酶、礦物質、維生素及次生代謝產物等多種有益成分，且綠色環(huán)保，故在農業(yè)生產上具有很大的應用潛力。目前，植物酵素在土壤改良、植物促生、抗病等領域研究較多。例如，植物酵素營養(yǎng)液可通過促進有益微生物繁殖，優(yōu)化土壤微生物結構，改善土壤微生態(tài)環(huán)境理化性質，提高作物對土壤養(yǎng)分的有效吸收[]。樊宇婷等研究發(fā)現(xiàn)水培小白菜中添加稀釋500倍的桑葉酵素對小白菜的提質增效有顯著效果?？道实萚用稀釋200倍的酵素液肥澆灌土壤，可以改善設施甜瓜連作障礙，有效提高了甜瓜產量和品質。李辰瓊等[13]對黑麥草施用稀釋600倍的寄云酵素液肥，顯著提高了黑麥草的產量，增強其抗銹病能力。上述結果表明植物酵素在克服土壤連作障礙、提高作物產量品質、減輕生物脅迫方面均有積極作用，但關于植物酵素對非生物脅迫緩解效應的研究仍為空白。

辣椒（CapsicumannuumL.）屬于茄科辣椒屬，原產于中南美洲熱帶雨林地區(qū)，喜溫，但對溫度較為敏感，環(huán)境溫度超過 32^°C 即可產生熱害，造成減產和果實品質下降。齒果酸模酵素作為一種新型植物酵素，前期已被證實能顯著促進小白菜生物量積累，其作用機制可能涉及促進養(yǎng)分吸收、增強抗氧化能力及調控基因表達等多重途徑[14]。本研究擬通過不同濃度齒果酸模酵素預處理，分析其對熱脅迫下辣椒幼苗葉片中抗氧化酶活性、滲透調節(jié)物質含量及相關基因表達的影響，揭示植物酵素調控植物耐熱性的生理作用機制，為辣椒高效安全生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1材料

試驗所用辣椒品種為好優(yōu)名越，購于成都好特園藝有限公司；齒果酸模酵素母液由河南農業(yè)大學園藝學院設施蔬菜栽培課題組提供。

1.2試驗設計

試驗于2024年3一10月在河南農業(yè)大學園藝學院設施蔬菜栽培實驗室進行。選取形態(tài)飽滿、大小均一的辣椒種子，置于 55^°C 恒溫水浴浸種20min ，室溫浸泡6h后，濾紙吸干表面水分，均勻平鋪于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)血中，加入適量蒸餾水保持濕度，置于人工氣候箱中（溫度 28^°C 相對濕度 70% ）暗培養(yǎng)催芽。待種子露白后，播于72孔穴盤中。參考吳少博4的方法進行齒果酸模酵素的制備和保存。齒果酸模酵素設置4個濃度梯度：稀釋50倍（T50）、稀釋100倍（T100）、稀釋200倍（T200）、稀釋400倍（T400），以清水為對照（CK），共5個處理。待辣椒幼苗2片子葉完全展開時，用齒果酸模酵素澆灌植株根部，每間隔2d澆1次，其間不補充其他水分。21d后，即幼苗長至4～5真葉期，移至溫度為 45^°C 、光照強度為 30 000lx 、光周期為 16h/8h 、相對濕度為 70% 的光照培養(yǎng)箱中進行熱脅迫，處理時間為 3d 。本試驗為完全隨機試驗，每個處理3次重復，每個重復15株。

熱處理0d、1d、3d時，分別觀察辣椒表型并拍照記錄。熱處理0d和3d時，采集葉片用于葉片相對含水量、活性氧（ROS）及抗氧化酶等相關指標的測定；熱處理1d時，采集葉片進行二氨基聯(lián)苯胺（di-aminobenzidine，DAB）、硝基藍四氮唑（nitroblue tet-razolium，NBT）染色以了解熱脅迫下辣椒植株 O₂^-? 、H₂O₂ 的積累程度，并取熱處理0h和6h的葉片提取RNA，用于抗氧化酶相關基因和熱脅迫相關基因表達量的測定。

1.3 項目測定方法

1.3.1葉片相對含水量（relativewatercontent，RWC）的測定參考常菲菲等[15的方法進行葉片相對含水量的測定，選取自上而下第3片功能葉稱量鮮質量，將葉片完全浸沒于盛有蒸餾水的玻璃培養(yǎng)皿中，室溫 25^°C 浸泡6h至葉片達到完全飽和狀態(tài)。取出后用濾紙吸除葉片表面游離水分，立即測定飽和鮮質量。隨后將樣品置于 72^°C 烘箱中連續(xù)烘干 48h 至恒質量，測定干質量。

1.3.2細胞組織化學染色與生理生化指標的測定參考Liu等的方法對辣椒葉片進行DAB和NBT染色。參考張海波等的方法測定葉片中丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性；采用芘三酮法測定脯氨酸含量，采用四氯化鈦法測定 H₂O₂ 含量，采用羥胺氧化法測定超氧陰離子 產生速率[18]。

1.3.3總RNA提取及實時熒光定量PCR分析使用Trizol試劑盒（TaKaRa）提取辣椒葉片總RNA，使用反轉錄試劑盒All-in-OneScriptRTpremix（withdsDNase）進行反轉錄，得到cDNA產物。用 將其質量濃度稀釋至 200ng?μL^-1 ，根據(jù)SYBRPremixExTaqII試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，以CaUBI為內參基因，采用 2^-ΔΔct 閾值比較法計算基因相對.

2.5不同濃度齒果酸模酵素預處理對辣椒幼苗熱脅迫相關基因表達量的影響

為了進一步從分子水平上探討根施齒果酸模酵素對辣椒幼苗抵抗熱脅迫的調控機制，通過qRT-PCR測定辣椒葉片中熱脅迫相關基因CaHs-fA2、CaHSP16.4、CaHSP70.1、CaWRKY55的相對表達量。由圖7-A～D可知，熱脅迫可誘導各處理辣椒幼苗葉片中 CaHsfA2、CaHSP16.4、CaHSP70.1、CaWRKY55上調表達，其中，T100處理的4個基因相對表達量均最高，與CK相比，分別顯著增加了635.5、89.7、20.1、13.4倍，增加幅度均最大。結果表明齒果酸模酵素預處理可通過提高辣椒幼苗葉片中熱脅迫相關基因的表達量，來增強辣椒幼苗的耐熱性，其中T100處理的效果最好。

3 討論與結論

溫度是調控植物生理過程的關鍵因素之一，對辣椒的生長發(fā)育有深刻的影響，極端高溫使辣椒的細胞結構遭到破壞，生理代謝紊亂，嚴重時導致辣椒葉片萎蔫甚至死亡[9]。葉片相對含水量在一定程度上反映了植物的保水能力，高溫脅迫下，葉片相對含水量通常會下降，而下降幅度較小的植株通常表現(xiàn)出較強的抗高溫能力[20]。在細胞失水初期，為使細胞膨壓維持在一定水平，細胞內會積累大量的脯氨酸以降低細胞水勢[2]，保護細胞滲透平衡和亞細胞結構穩(wěn)定[22]。但脯氨酸積累超過一定閾值后會出現(xiàn)明顯的毒害作用，導致呼吸鏈電子超載、外滲，產生大量ROS，對蛋白質等生物大分子的結構造成損傷[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與熱處理前相比，熱處理3d后，CK辣椒幼苗出現(xiàn)嚴重的受害癥狀，RWC顯著降低，脯氨酸含量顯著升高，而經(jīng)齒果酸模酵素預處理的辣椒幼苗受害程度明顯減輕，其中，T100處理辣椒幼苗的受害程度最輕，RWC和脯氨酸含量無明顯變化。P5CS基因負責編碼植物體內脯氨酸合成的關鍵限速酶[2，調控谷氨酸還原為谷氨酸半醛，隨后谷氨酸半醛轉化為P5C中間體，并由P5C還原酶（P5CR）進一步還原為脯氨酸，該基因表達量上調可直接導致游離脯氨酸含量增加[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱處理3d后CK中CaP5CS的相對表達量最高，而齒果酸模酵素預處理辣椒幼苗葉片中CaP5CS的相對表達量均較CK顯著降低，其中T100處理CaP5CS的相對表達量最低。因此，推測齒果酸模酵素可能通過增強細胞膜穩(wěn)定性，下調脯氨酸合成關鍵限速酶基因CaP5CS的表達，從而有效減少脯氨酸等滲透調節(jié)物質的積累，抑制水分的流失。常菲菲等發(fā)現(xiàn)，GA、BA通過提高番茄幼苗的相對含水量，提高番茄幼苗對高溫的耐受性。鄭衛(wèi)國等2研究證實，外源 CaCl₂ 可使月季脯氨酸含量降低，RWC升高。上述結果與本研究T100處理的結果一致。值得關注的是，高濃度或低濃度的酵素預處理對提高辣椒幼苗耐熱性效果不佳，推測稀釋50倍齒果酸模酵素處理可能因活性物質過載引發(fā)代謝壓力，而稀釋400倍齒果酸模酵素處理則因有效成分不足難以發(fā)揮調控作用。

在植物生理穩(wěn)態(tài)下，ROS的生成與清除維持著動態(tài)平衡，該平衡體系在非生物脅迫響應中具有關鍵作用。當遭遇高溫、干旱等環(huán)境脅迫時植物體內ROS代謝會發(fā)生直接或間接的改變，如果不能及時清除ROS，ROS會使細胞內生物大分子氧化，破壞生物膜的完整性。SOD、POD、CAT作為細胞中主要的抗氧化酶，可通過清除ROS自由基維持細胞膜的完整性，是植物抗逆性的重要指標[2。其中，SOD可特異性清除細胞中多余的 O₂^-? ，CAT負責分解H₂O₂^[28] ，而POD兼具ROS生成和清除的雙重功能[29]。本試驗結果顯示，熱處理3d后，CK辣椒幼苗葉片中CAT、SOD的活性顯著降低，POD活性顯著升高。而齒果酸模酵素預處理顯著降低了這3種抗氧化酶活性的變化幅度，其中，T100處理的

CAT、POD活性無顯著變化，SOD活性顯著升高。值得注意的是，短期高溫（6h）可誘導各處理辣椒葉片中 CaSOD，CaCAT 基因表達上調，但熱處理3d后，與熱處理前相比兩者酶活性下降（T100處理SOD活性除外），這與草莓高溫脅迫下SOD活性變化規(guī)律一致[3，熱處理顯著提高了CaPOD的相對表達量及POD活性（T100處理除外），而齒果酸模酵素通過降低熱處理后POD活性（與CK比）進而抑制ROS的生成，該現(xiàn)象與 a. -亞麻酸調控辣椒鹽堿脅迫的抗氧化響應模式相似[3]。綜上，齒果酸模酵素可通過維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，有效緩解ROS積累引發(fā)的氧化損傷，從而增強辣椒對熱脅迫的適應性，其中T100處理的效果最好。

HsfA2在植物耐熱性形成中起關鍵作用，辣椒CaHsfA2基因已被證實受熱脅迫顯著誘導，其異源表達可提高擬南芥和煙草的耐熱性[32-33]。作為分子伴侶的熱激蛋白（HSPs）通過維持蛋白質穩(wěn)態(tài)增強耐熱能力，編碼熱激蛋白的基因的表達水平與植物耐熱性呈顯著正相關34]。熱處理6h后，CK辣椒幼苗葉片中CaHsfA2、CaHSP70.1的相對表達量無顯著變化，CaHSP16.4、CaWRKY55的相對表達量顯著增加。經(jīng)齒果酸模酵素預處理的辣椒幼苗葉片中CaHsfA2、CaHSP16.4、CaHSP70.1的相對表達量顯著增加，且在熱脅迫下呈現(xiàn)濃度依賴性特征，其中，

T100處理的增加幅度顯著高于其他處理，且可顯著提高CaWRKY55的相對表達量，這與Liang等[5關于HSPs響應熱脅迫的動態(tài)規(guī)律具有一致性，表明適宜濃度的齒果酸模酵素可有效增強分子伴侶系統(tǒng)的應激響應能力。同時，CaWRKY55的快速誘導特征與二氫卟吩鐵調控辣椒抗逆性的WRKY轉錄因子表達模式相吻合，印證了WRKY家族在脅迫信號轉導中的瞬時響應特征[35]。研究結果表明，齒果酸模酵素可能通過協(xié)同調控CaHsfA2、CaHSPs及CaWRKY55等關鍵基因的表達網(wǎng)絡，激活下游滲透調節(jié)物質合成及抗氧化酶系統(tǒng)，進而修復高溫引起的代謝紊亂。

綜上所述，根施齒果酸模酵素通過維持葉片水分平衡、提高抗氧化酶SOD和CAT活性，降低POD活性、減輕高溫誘導的膜脂過氧化損傷、激活耐熱相關基因表達來增強辣椒耐熱性，其中齒果酸模酵素稀釋100倍的作用效果最佳。本研究為設施辣椒熱脅迫的防控提供了生態(tài)且安全的策略，為新型生物源抗逆制劑的研發(fā)提供了理論支撐。

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