中圖分類號：S794.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-923X（2025）07-0188-09

Identification and expression analysis of WRKY gene family in flower color formation in Camellia japonica

SONGZhixin12，F(xiàn)ANMenglong1，JIANGHong1，ZHANGYing1，LIXinlei1 （1.ResearchInstituteofbtropicalForestryineseAcademyofForestry，Hangzhou340o，Zhejang，ina 2.Nanjing ForestryUniversity，Nanjing21oo37，Jiangsu，China）

Abstract：【Objective】The WRKYgene familyplays animportantrolein theregulation of plant growthand development.Camelia japonicaisanimportantoamentalplantwithichfowercolors.ItisofgreatsignificancetoidentifyandanalyzetheWRKYgene familymembers inCamelia japonica petals withdiferentcolors.【Method】Basedonthe whole genome dataofCameliajaponica， theWRKYgenefamilywasidentifedandanalyzedbybioinformaticsmethods.Basedonthetranscriptomedatarelatedtocamellia flowercolor，teexpressionpateofCjWKYsindifentcoloedamellapealsasaalyed【Result】esultsindcatedtat 94 CjWRKYgenes were identified in the whole genomeand named CjWRKY1-CjWRKY94.The phylogenetic tree dividedthe strains intothregos（I，I）adgopIIwafurthvieditfiveubous（a，I-b-c，I-I-e）.ob contained twoWRKYdomains，whilegroupI andIImemberscontainedonlyone WRKYdomai.Atotalof10conservedmotifsand 5conserveddomainswereidentifed.TheCjWRKYsmembersinthesamesubgrouphadsimilarconservedmotifs，conserveddomains and genestructures.The CjWRKYs promoterregioncontained 38 elements forlightresponse，stressresponseandhormonerespose， includingMYBbindingsiteforregulatingfavonoidbiosynthesis.94CjWRKYswereunevenlydisrbutedon15chromosomes，and there were13 pairsoftandemduplication events.Collnearityanalysisshowed thatthere were72duplication events in94CjWRKYs genes，and the K_a/K_s valueof the duplication genes was less than1.There were 116 colinear gene pairs with Arabidopsis WRKY gene family.Amongthem，32CjWRKYs wereup-regulatedand6CjWRKYsweredown-regulated withthedeepeningofflowercolorof Cameliajaponica，whichsugestedthat CjWRKYs plaedanimportantroleinteregulationofanthocyanisyntesis.Itisspeclated thatCjWRKY48，CjWRKY53andCjWRKY6 positivelyregulateanthocyaninsynthesisbyinteracting withMYBtranscriptionfactors， therebyaffectingflowercolorofCameliajaponica.【Conclusion】94CjWRKYsgeneswereidentifedinthewholeCamellajaponica genome，andmostCjWRKYsareinvolvedinanthocyaninsynthesisandplayanimportantroleincolorformationofCameliajaponica.

Keywords：Camellia japonica;WRKYgene family;flowercolor;expressionanalysis

WRKY基因家族是高等植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與植物中大部分生理代謝過程，包括調(diào)控生長發(fā)育、參與脅迫響應(yīng)以及次生代謝物生物合成等[]。研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在花青昔合成過程中也具有重要的調(diào)控作用，可通過直接調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)或與其他轉(zhuǎn)錄因子互作影響花青苷的代謝過程[2]。WRKYs蛋白最重要的結(jié)構(gòu)特征是N端含有1個(gè)或2個(gè)由60個(gè)氨基酸組成的WRKY結(jié)構(gòu)域，其具有高度保守性，可以與順式作用元件W-box特異性結(jié)合來參與基因表達(dá)調(diào)控[3]。

山茶Camelliajaponica是中國十大傳統(tǒng)名花之一，花色豐富，主要為紅色、粉色、白色及復(fù)色，少數(shù)為黃色、黑紅色[4。山茶花色變異主要是由花青苷的成分與含量決定的，在不同山茶品種的花瓣中共檢測到7種矢車菊素類花青苷[5]?；ㄇ嘬沾x過程屬于類黃酮生物合成途徑，該過程涉及多種結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[。利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析，已在油茶Camelliaoleifera中篩選出CoWRKY7和CoWRKY22與花青素合成相關(guān)[，并在山茶中篩選出多個(gè)與花青苷合成相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子[8-9]，但對其在花青苷合成中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究對山茶中WRKY基因家族進(jìn)行鑒定，并對其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、在不同花色中的表達(dá)模式等方面進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步探究山茶WRKY基因家族在花青苷合成中的生物學(xué)功能提供參考，為山茶花色的遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

采集山茶‘玉丹’‘粉丹’‘赤丹’和‘金碧輝煌’的盛開期花瓣，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。試驗(yàn)材料均來源于山茶種質(zhì)資源圃。

1.2方法

1.2.1 CjWRKYs的全基因組鑒定

使用HMMER程序[0檢索了山茶基因組中的WRKY結(jié)構(gòu)域（PF03106），并通過Pfam保守域數(shù)據(jù)庫[1]和CDD數(shù)據(jù)庫[1]對鑒定的候選序列進(jìn)行篩選驗(yàn)證；通過 ExPASy[13]（https：//web.expasy.org/compute_pi/）對鑒定到的蛋白進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)（pI）分析；使用WoLFPSORT[14]（https：/www.genscript.com/wolf-psort.html）對基因的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。

1.2.2CjWRKYs的系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建、基因結(jié)構(gòu)、保守基序和啟動子分析

從TAIR網(wǎng)站[i5]下載擬南芥AtWRKYs蛋白序列，通過MEGA10.0軟件[對擬南芥和山茶WRKY蛋白序列進(jìn)行比對分析，并使用相鄰連接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，通過iTOL工具[]對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行美化。使用TBtools軟件[18]從山茶基因組注釋文件中提取了山茶WRKY基因的UTR和CDS序列。通過MEME程序[9]對CjWRKY蛋白的保守基序進(jìn)行分析，基序個(gè)數(shù)設(shè)置為10，最佳基序?qū)挾仍O(shè)置為 6～50 。為鑒定啟動子所包含的順式作用元件，用TBtools軟件提取CjWRKYs基因家族成員的上游 2 000bp 序列，通過PlantCare網(wǎng)站[20]對其啟動子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測分析。

1.2.3CjWRKYs的染色體定位與共線性分析

采用TBtools軟件提取山茶基因組中WRKY基因的位置信息，并繪制染色體分布圖。使用具有默認(rèn)參數(shù)的多重共線性掃描工具包（MCScanX）分析基因復(fù)制事件，對山茶WRKY基因家族進(jìn)行物種內(nèi)共線性分析。使用TBtools軟件對片段復(fù)制基因進(jìn)行 K_a/K_s 計(jì)算分析。

1.2.4CjWRKYs在不同花色山茶花瓣中的表達(dá)分析

采用TBtools軟件[18]從山茶不同花色轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取CjWRKY的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并繪制WRKY的表達(dá)圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 山茶WRKY基因家族的鑒定

在山茶基因組中共鑒定出94個(gè)WRKY候選基因，命名為 CjWRKYI～CjWRKY94 。通過對編碼序列（CDS）長度、蛋白質(zhì)序列長度、蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)（PI）等基因特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CjWRKY蛋白之間存在顯著差異。94個(gè)CjWRKY基因編碼蛋白的氨基酸數(shù)為 160～735 ，CjWRKY55蛋白長度最大，分子質(zhì)量為79.63kDa；相反，CjWRKY71最小，分子質(zhì)量僅為18.25kDa 。等電點(diǎn)為4.71（CjWRKY78） ～9.87 （CjWRKY79）， 57.4% CjWRKY蛋白為酸性蛋白（等電點(diǎn)小于7）。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，90個(gè)CjWRKYs定位在細(xì)胞核中，3個(gè)（CjWRKY9、CjWRKY29和CjWRKY31）定位在過氧化物酶體中，僅1個(gè)（CjWRKY85）定位于葉綠體中。

2.2 山茶WRKY基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

在擬南芥和山茶中構(gòu)建WRKY蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，將其分為I、Ⅱ和II類（圖1），Ⅱ類又分為I-a、I-b、II-c、II-d和I-e5個(gè)亞群。其中21個(gè)CjWRKY成員屬于I類，包含2個(gè)完整的WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)。II類包含60個(gè)CjWRKY成員，僅含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，其中II-a、II-d和II-e亞群鋅指結(jié)構(gòu)為 C-X₅-C₂₃-HXH 型，分別包含8、10和10個(gè)CjWRKY成員；II-b亞群鋅指結(jié)構(gòu)為 C-X₆-C₂₉-HXH 型，包含11個(gè)CjWRKY成員；II-c亞群鋅指結(jié)構(gòu)為 C-X₄-C₂₃-HXH 型，包含21個(gè)CjWRKY成員。III類包含13個(gè)CjWRKY成員，含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè) C₂HC 型鋅指結(jié)構(gòu)。

2.3 山茶WRKY基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

CjWRKY家族的保守基序、保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖2所示。CjWRKY蛋白中的保守基序?yàn)?0個(gè)，其中Motifl為WRKYGQK保守序列，Motif2為C2H2鋅指結(jié)構(gòu)基序，這兩個(gè)基序存在于大多數(shù)CjWRKY蛋白中，具有高度保守性。Motif3也是WRKY保守結(jié)構(gòu)域，但僅存在于GroupI中。同一分組中Motif類型及其分布具有很高的相似性，其中IIb亞族保守基序數(shù)量最多，含有 7～8 個(gè)Motif，并且II-a和II-b亞族中都存在Motif5；Group II、Group II-e 和 Group II-d 的Motif組成和分布相似，除Motif1和Motif2外，大多數(shù)CjWRKY成員只含有Motif8，少數(shù)成員含有Motif9。

在94個(gè)CjWRKY蛋白中，89個(gè)成員含有WRKY結(jié)構(gòu)域，5個(gè)含有WRKYsuperfamily結(jié)構(gòu)域；除CjWRKY21 和CjWRKY24 外，GroupII-d亞族所有成員都含有Plant_zn_clust結(jié)構(gòu)域；除此之外，GroupII-b亞族中CjWRKY53和CjWRKY17含有bZIP superfamily結(jié)構(gòu)域，CjWRKY14含有1個(gè) 結(jié)構(gòu)域。對基因編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)分析表明，同組間基因外顯子結(jié)構(gòu)相似性較高。GroupI、Group II-a 和Group II-b 中外顯子數(shù)量較多，為 4～6 個(gè)；Group III、GroupI-e 和 Group II-d 中， 除CjWRKY36、CjWRKY72和CjWRKY84外，其他成員均含有3個(gè)外顯子。

2.4 山茶WRKY基因的啟動子順式作用元件分析

對CjWRKYs的順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果表明其啟動子區(qū)域主要含有激素、環(huán)境脅迫、光響應(yīng)等相關(guān)作用元件38種（圖3）。94個(gè)CjWRKYs中最多的是光響應(yīng)和激素響應(yīng)元件，激素響應(yīng)元件主要包括生長素、茉莉酸、脫落酸、水楊酸及赤霉素。此外，CjWRKY基因家族成員中還含有4種MYB結(jié)合位點(diǎn)，與光反應(yīng)、響應(yīng)干旱脅迫及類黃酮生物合成相關(guān)。94個(gè)CjWRKYs中，61個(gè)含有干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)元件，32個(gè)含有光響應(yīng)MYB結(jié)合位點(diǎn)，4個(gè)含有參與類黃酮生物合成基因調(diào)控的MYB結(jié)合位點(diǎn)，分別為CjWRKY25、CjWRKY48、CjWRKY53及CjWRKY66。大多數(shù)CjWRKYs都含有1個(gè)或多個(gè)激素、脅迫等作用元件，表明CjWRKYs能夠參與多種反應(yīng)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)過程，包括調(diào)控山茶花色形成等，在山茶生長發(fā)育過程中具有重要作用。

2.5 山茶WRKY基因的染色體定位及共線性分析

山茶WRKY基因家族在染色體上的分布位置分析見圖4，結(jié)果表明94個(gè)CjWRKYs不均勻分布于15條染色體上。0號、1號、7號和9號染色體分布較多，有 9～14 個(gè)CjWRKY基因，而6號染色體上只有CjWRKY47。此外，還發(fā)現(xiàn)可能存在

13對CjWRKY基因的串聯(lián)重復(fù)事件。

共線性分析表明，94個(gè)CjWRKYs基因中共鑒定出72個(gè)片段復(fù)制事件（圖5），CjWRKY基因家族在山茶基因組上存在明顯復(fù)制關(guān)系。對CjWRKY基因家族中的片段復(fù)制基因進(jìn)行 K_a/K_s 計(jì)算，分析表明其 K_a/K_s 值均小于1，據(jù)此推斷山茶WRKY基因家族在進(jìn)化過程中通過純化選擇消滅了有害突變位點(diǎn)。對山茶和擬南芥的WRKY基因進(jìn)行共線性分析（圖6），發(fā)現(xiàn)共有116個(gè)共線基因?qū)Α?/p>

2.6 山茶WRKY基因在不同花色山茶品種中的表達(dá)模式分析

分析94個(gè)CjWRKYs基因在不同山茶花色品種中的表達(dá)模式（圖7），發(fā)現(xiàn)87個(gè)CjWRKY基因不同顏色的山茶花瓣中的表達(dá)量存在差異。其中，隨著山茶花瓣顏色的加深，32個(gè)CjWRKY基因在不同程度上表達(dá)上調(diào)，這些基因主要分布于Group I、Group II-a、Group II-b、Group II-c 和GroupIII，其中GroupII-b亞群和GroupIII中約73% 和 62% 的基因都表達(dá)上調(diào)。6個(gè)CjWRKY基因在隨著花色加深不同程度上表達(dá)下調(diào)，其中，CjWRKY67屬于GroupI，CjWRKY63屬于GroupI-b，CjWRKY7 和 CjWRKY37屬于Group II-c，CjWRKY50 和CjWRKY75屬于GroupIII，表明GroupII-b和GroupIII成員在山茶花色形成中具有重要意義。此外，CjWRKY48、CjWRKY53以及CjWRKY66啟動子區(qū)域含有與類黃酮合成相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)，并隨著山茶花色加深上調(diào)表達(dá)，表明CjWRKY48、CjWRKY53和CjWRKY66可能通過與MYB轉(zhuǎn)錄因子互作調(diào)控花青苷合成，進(jìn)而影響山茶花色。

3討論

本研究從山茶基因組中鑒定到94個(gè)CjWRKYs成員，數(shù)量明顯多于擬南芥（74個(gè)）[2、茶C.sinensis（50個(gè)）[21]、梔子Gardeniajasminoides（47個(gè)）[22]、桔梗 Platycodon grandiflorus （42個(gè)）[23]，少于甘菊Chrysanthemum lavandulifolium（138個(gè)）[24]，與同屬植物油茶C.oleifera（90個(gè)）接近[25]。不同物種間WRKY基因家族成員數(shù)量各不相同，山茶與油茶中相對較多，推測與WRKY基因家族在進(jìn)化過程中存在復(fù)制事件有關(guān)[2]。根據(jù)山茶和擬南芥的系統(tǒng)進(jìn)化樹，將WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族劃分為I、II、Ⅲ類，其中Ⅱ類又分為5個(gè)亞族（Ia ～ IIe）。同一亞族中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有與擬南芥相似的保守基序和結(jié)構(gòu)域，只在個(gè)別CjWRKY蛋白中發(fā)現(xiàn)bZIP-superfamily和Plant-zn-clust結(jié)構(gòu)域，表明CjWRKY在進(jìn)化過程中只有少部分發(fā)生變異，具有相對保守性，這與油茶、山蒼子Litseacubeba等物種中的WRKY基因家族一致[27-29]。不同山茶花色的CjWRKYs表達(dá)譜中，GroupII-b 和GroupIII中的大多數(shù)CjWRKYs成員都隨著花色加深上調(diào)表達(dá)，并且系統(tǒng)發(fā)育樹表明這兩個(gè)亞族具有相近的發(fā)育關(guān)系，推測這兩個(gè)亞族的CjWRKYs成員具有相似的生物學(xué)功能，在山茶花瓣花青苷合成中具有重要作用。本研究對WRKY基因在山茶中的共線性關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CjWRKY基因家族存在明顯的重復(fù)現(xiàn)象，發(fā)生了基因組加倍，推測是山茶在進(jìn)化過程中發(fā)生過染色體加倍所致，類似現(xiàn)象在香樟Cinnamomumcamphora[30和金銀花Lonicerajaponica[31中也有發(fā)現(xiàn)?；蚪M加倍可能導(dǎo)致參與花青苷途徑的關(guān)鍵基因發(fā)生復(fù)制，新復(fù)制的基因有可能發(fā)生亞功能化和新功能化，使花青苷生物合成途徑的調(diào)控更加精細(xì)[32]；基因組加倍后的劑量效應(yīng)、對表達(dá)量的調(diào)節(jié)、代謝途徑的冗余以及表觀遺傳修飾等都可能會影響花青苷的合成與積累[3-34；除此之外，某些植物的花色變異與基因組加倍有關(guān)[35]。

植物類黃酮合成途徑主要包括黃酮、黃酮醇和花青苷合成等8個(gè)分支和4個(gè)重要的中間代謝物（查爾酮、黃酮、二氫黃酮醇和原花青素）[3]。其中由黃酮在 F3H催化下合成的二氫黃酮醇是類黃酮合成途徑的重要分支，是黃酮醇、花青素和原花青素的共同前體[37]，被F3'H、F3'5'H和DFR催化流向不同分支途徑，F(xiàn)3H、F3'5H活性的強(qiáng)弱和DFR對底物的選擇性等因素共同導(dǎo)致了花青素組成的改變[38]。已有研究表明，擬南芥中WRKY33作為磷依賴性因子，通過直接或間接調(diào)節(jié)DFR基因的表達(dá)，負(fù)調(diào)控花青素的合成[39]；獼猴桃Actinidia spp.中WRKY44可激活 F3^′H 和 F3^′5^′H 基因的啟動子，在愈傷組織中過表達(dá)WRKY44可提高原花青素的水平[40]；在蘋果Malus × domestica中，MdWRKY40可以與MdANS的啟動子結(jié)合，但過表達(dá)MdWRKY40并不影響MdANS的表達(dá)和花青素的含量，而會減弱MdMYB111對花青素合成的抑制作用[41]。本研究通過分析不同顏色的山茶花瓣中CjWRKYs的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)隨著花瓣顏色的加深，32個(gè)CjWRKY基因在不同程度上表達(dá)上調(diào)，6個(gè)CjWRKY基因不同程度上表達(dá)下調(diào)，推測這些CjWRKY基因通過直接或間接調(diào)控花青苷合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因參與花青苷的合成。

梨Pyrus中PpWRKY44與PpMYB10結(jié)合[42]以及蘋果中MdWRKY72、MdWRKY75和MdMYB1結(jié)合[43-44]，均能激活下游花青苷合成結(jié)構(gòu)基因，進(jìn)而促進(jìn)花青苷積累；而擬南芥中AtWRKY41可通過調(diào)節(jié)AtMYB11和AtMYBD抑制花青苷合成[45]。本研究順式作用元件預(yù)測分析表明CjWRKY25、CjWRKY48、CjWRKY53以及CjWRKY66啟動子區(qū)域存在參與類黃酮生物合成基因調(diào)控的MYB結(jié)合位點(diǎn)，推測存在MYB轉(zhuǎn)錄因子激活或抑制其表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游類黃酮生物合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因。結(jié)合CjWRKYs在不同花色品種中的表達(dá)模式分析，CjWRKY48、CjWRKY53以及CjWRKY66隨著花色加深上調(diào)表達(dá)，可能正調(diào)控相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，促進(jìn)山茶花瓣花青素積累。

大量研究證實(shí)，非生物脅迫以及激素響應(yīng)都會影響植物花青素生物合成與積累。例如，低溫可促進(jìn)蘋果、茶樹等植物的花青素積累[46-47]，而抑制草莓Fragariaspp.果實(shí)的花青素積累[48]。除此之外，茉莉酸、乙烯和赤霉素等植物激素也能夠調(diào)控蘋果花青素合成[49-50]。WRKY基因家族在非生物脅迫以及激素響應(yīng)中具有重要作用，例如研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)梅花Prunusmume中PmWRKY57可提高擬南芥耐寒性[51]，紫穗槐Amorpha fruticosa中AfWRKY20響應(yīng)干旱脅迫誘導(dǎo)的ABA信號傳導(dǎo)[52]。本研究也發(fā)現(xiàn)CjWRKY基因家族啟動子區(qū)域也存在大量光響應(yīng)、低溫響應(yīng)、干旱響應(yīng)及激素響應(yīng)元件，推測WRKY轉(zhuǎn)錄因子也可通過環(huán)境及激素響應(yīng)途徑影響植物花青苷合成。

本研究對山茶全基因組中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了鑒定和不同花色表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)CjWRKY基因可能參與山茶花青苷生物合成并發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步挖掘山茶花青苷合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子提供參考，但缺少CjWRKY蛋白互作和基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，其在花青苷合成過程中的下游靶基因和互作蛋白尚不清楚。此外，本研究推測CjWRKY48、CjWRKY53以及CjWRKY66可與MYB轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生互作正調(diào)控山茶花瓣花青苷合成，后續(xù)可通過基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化、互作驗(yàn)證等試驗(yàn)，明確基因功能及互作關(guān)系，進(jìn)一步篩選和探討關(guān)鍵CjWRKY基因在山茶花青苷合成中的分子機(jī)制。

4結(jié)論

在山茶全基因組范圍內(nèi)共鑒定到94個(gè)CjWRKYs家族成員，系統(tǒng)發(fā)育樹將其分為7個(gè)亞群，同一亞群具有相似的基因結(jié)構(gòu)。啟動子區(qū)域含有參與類黃酮生物合成基因調(diào)控的MYB結(jié)合位點(diǎn)，在山茶不同花色花瓣的表達(dá)存在差異，在山茶花青苷合成中發(fā)揮重要作用，調(diào)控山茶花色形成。

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[本文編校：吳毅]