【特約主持人】解新芳：西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院教授，獲國家級青年人才項目

【主持人按語】癌癥嚴(yán)重威脅全球公共衛(wèi)生，肺癌與結(jié)直腸癌作為常見惡性腫瘤，其高致死率凸顯早期診斷的關(guān)鍵意義.當(dāng)下迫切需要探尋高靈敏、高特異且無創(chuàng)或微創(chuàng)的診斷標(biāo)志物.外泌體攜帶豐富生物分子參與腫瘤進程，在肺癌研究中，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體蛋白可區(qū)分患者與健康人群，部分蛋白與肺癌進展緊密相連；而在結(jié)直腸癌領(lǐng)域，非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)揭示血漿蛋白質(zhì)糖基化修飾差異可有效鑒別兩者，特定糖蛋白的糖肽表達(dá)與疾病進展顯著相關(guān).本專欄聚焦此類研究，剖析腫瘤早期診斷新路徑，為癌癥防治提供科學(xué)依據(jù).

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種極具威脅的胃腸道惡性腫瘤.在全球范圍內(nèi)，CRC 的發(fā)病率位居第三（占發(fā)病總數(shù)的 10.2% ），死亡率排名第二（占死亡總數(shù)的 9.4% ）[1].據(jù)統(tǒng)計，預(yù)計到2030年，結(jié)直腸癌的患病人數(shù)將達(dá)到220萬例，死亡人數(shù)將達(dá)到110萬例[2.流行病學(xué)調(diào)查研究表明，結(jié)直腸癌的發(fā)病率隨著年齡的增長而逐漸升高，同時還受到家族史、炎癥性腸病、吸煙、過度飲酒、肥胖和糖尿病等多種因素的影響[3.結(jié)直腸癌從良性腺瘤病變（息肉）發(fā)展成癌癥需要十多年的時間[4].在結(jié)直腸癌患者中，原位結(jié)直腸癌（I期）的5年相對生存率高達(dá) 90% ，而轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（V期）的5年相對生存率僅為 10%^[5] ，因此早期診斷對于提高患者生存率和降低腫瘤轉(zhuǎn)移率至關(guān)重要.目前，結(jié)直腸癌的診斷方法主要包括結(jié)腸鏡檢查[6、膠囊內(nèi)窺鏡[7]、CT掃描[6]、糞便隱血檢測（FOBT）[8]以及癌胚抗原（CEA）和碳水化合物抗原199（CA19-9）[9]等血清標(biāo)志物檢測.盡管結(jié)腸鏡檢查被認(rèn)為是診斷結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，具備較高的準(zhǔn)確性，但由于其侵入性較強，患者的接受度有限[10].目前其余檢測方法在靈敏度和特異性等方面仍有不足，不能滿足臨床診斷需求.因此，迫切需要建立更微創(chuàng)、高靈敏度和高特異性的診斷方法，提高結(jié)直腸癌的早期診斷率和治療成功率.

生物標(biāo)志物是存在于血液、尿液和腦脊液等體液或組織中的一種生物分子，能夠反映腫瘤疾病在特定時間內(nèi)的生理狀態(tài)和疾病進程的變化[].癌癥生物標(biāo)志物涵蓋了多種生化分子，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)以及代謝產(chǎn)物等，在癌癥的風(fēng)險評估、早期診斷、精準(zhǔn)預(yù)后和治療效果評價等方面發(fā)揮著重要作用[12].糖基化修飾是細(xì)胞表面和分泌蛋白上的一種常見且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的翻譯后修飾類型，在多種生物過程中都起到至關(guān)重要的調(diào)控作用.例如，它不僅幫助蛋白質(zhì)實現(xiàn)正確的折疊以確保其功能，還涉及細(xì)胞的附著、移動、信號傳遞以及在免疫過程中的識別等關(guān)鍵的生物過程[13].在腫瘤發(fā)展過程中，糖基化修飾經(jīng)常發(fā)生異常變化，導(dǎo)致腫瘤惡性特征的出現(xiàn)，如細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等[14].DOHERTY等[15]研究表明，結(jié)直腸癌患者在不同的癌癥階段其血漿N-糖基化修飾具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異.與健康人群相比，結(jié)直腸癌患者血液中核心巖藻糖類的雙觸角糖F（6）A2G2和F（6）A2G2S（6）1顯著降低（ ?Plt;0.000 9 ）.PARK等[16已證明膜錨定蛋白質(zhì)受體上的 α 2，6- 聯(lián)結(jié)的唾液酸修飾能夠調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力.總體而言，蛋白質(zhì)糖基化修飾的研究對結(jié)直腸癌早期診斷具有重要意義，有望為開發(fā)更加準(zhǔn)確、靈敏的腫瘤早期診斷方法提供新的途徑.

血液的動態(tài)變化能夠敏銳地反映患者疾病的病理生理狀態(tài)，提供從時間和空間上監(jiān)測疾病進展的獨特視角.血液檢測已經(jīng)融入常規(guī)生化檢測，其獨特之處在于穩(wěn)定性良好、無創(chuàng)性、易獲取性和長期保存等優(yōu)點.然而，CEA和CA19-9雖已被用作結(jié)直腸癌檢測和治療監(jiān)測的血液標(biāo)志物，但它們的敏感性僅為 40%～ 70% ，特異性也僅為 73%～90%^[17] .因此，為了提升結(jié)直腸癌診斷的準(zhǔn)確性，亟須探索更加精確的候選生物標(biāo)志物.綜上，本研究基于超高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)，對結(jié)直腸癌患者的血漿樣本進行了系統(tǒng)性的蛋白質(zhì)糖基化修飾組研究，深入探索結(jié)直腸癌患者血漿中糖基化修飾的異常改變，篩選具有高靈敏度、強特異性且易于篩查檢測的候選糖基化修飾生物標(biāo)志物，為結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后篩查提供分子病理學(xué)支持.

1 材料與方法

1.1 實驗材料、儀器和研究對象

結(jié)直腸癌血漿糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究所用實驗材料和儀器見附錄表S1.結(jié)直腸癌患者和健康人的血漿樣本均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院提供，本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批，所有參與本項研究的受試者均簽署書面知情同意書.

1.2 糖蛋白質(zhì)組分析的樣品制備

使用PierceTMTOP14試劑盒（賽默飛世爾科技）去除血漿高豐度蛋白，取 10μL 血漿樣品，采用試劑盒去除其前14 種高豐度蛋白質(zhì).用過濾器輔助樣品制備方案（filter-aided sample preparation，F(xiàn)ASP）酶切樣品蛋白[18-19].首先，將已去除高豐度蛋白樣品轉(zhuǎn)移到 30kDa 超濾管中并離心 15min. 加人尿素溶液 （8mol/L 尿素溶解在 0.1mol/L Tris-HCl 中， pH8.5AA 離心洗滌，加人 10mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）混勻后置于37^°C 恒溫箱中孵育 4h.12000r/min 離心 15min 除廢液，加入 50mmol/L 碘乙酰胺（IAA）混勻后室溫避光孵育 0.5h. 離心后再加入 10mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）室溫避光放置 15min，12 000r/min 離心.分別加人尿素溶液和 50mmol/L 碳酸氫銨（ABC）洗滌，重復(fù)3次.更換超濾管套管，加入 50mmol/L ABC 和 20μg （20胰蛋白酶進行蛋白酶切， 恒溫箱中孵育 ^16h 反應(yīng)結(jié)束后離心收集肽段，依次加入水、 .50mmol/L ABC洗滌超濾管，離心收集洗脫液.使用 SpeedVac真空干燥離心機（Eppendorf）完全干燥肽段，回收肽段儲存在-80^°C ，用于糖肽富集.

利用已開發(fā)的HILIC方法[20]富集完整糖肽.首先，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1% 三氟乙酸（TFA）溶液活化Ve-nusil HILIC（5μm，10nm） 填料，重復(fù)3次.加人體積分?jǐn)?shù) 80% 乙腈/體積分?jǐn)?shù) 0.2% TFA溶液平衡填料，重復(fù)3次.回收肽段用體積分?jǐn)?shù) 80% 乙腈/ 0.2% TFA溶液溶解，加入已活化平衡的HILIC填料，置于室溫旋轉(zhuǎn)混合儀上孵育 2h. 將混合物轉(zhuǎn)移到裝有C8膜的Tip 柱中，離心后再吸取管底離心液加人Tip 柱中離心.

加人體積分?jǐn)?shù) 80% 乙腈/體積分?jǐn)?shù) 0.2% TFA溶液洗滌除去未結(jié)合肽段.更換離心管，加入體積分?jǐn)?shù) 0.1% TFA 溶液洗脫收集糖肽，重復(fù)操作 3次.使用 SpeedVac 真空干燥離心機（Eppendorf）熱干糖肽，儲存在一 80°C 用于LC-MS/MS分析.

1.3 LC-MS/MS質(zhì)譜檢測分析

糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析，使用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）儀器，包括納米電噴霧離子源的EASY-nLC 1200 液相色譜系統(tǒng)和 Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技）.加入A液溶解糖肽（A 液：體積分?jǐn)?shù)0.1% 甲酸;B液：體積分?jǐn)?shù) 80% 乙腈/體積分?jǐn)?shù) 0.1% 甲酸），使用NanoDropOneC分光光度計（賽默飛世爾科技）在 205nm 的吸光度下測定糖肽濃度，如前所述[21].

取 1μg 的糖肽加載到直徑 100μm ，長度 30cm 色譜柱中 （1.9μm ReproSil-Pur C18-AQ;Dr. Maisch）.采用 90min 梯度洗脫糖肽，流速為 600nL/min. 梯度組成： 0～8min，5%～10%B;8～68min，10%～22% B;68～82min ， 22%～32% B； 82～88min ， 32%～90% B和 88～90min，90% B.質(zhì)譜設(shè)置參數(shù)如下：Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質(zhì)譜儀設(shè)置采用OT-OT模式；一級質(zhì)譜掃描的 AGC 目標(biāo)值為 400 000;掃描的質(zhì)量范圍 8002000m/z ；分辨率為120000；離子最大注入時間為 100ms. 二級質(zhì)譜掃描AGC目標(biāo)值為50 000；分辨率為15000，離子最大注入時間為 250ms ，使用高能碰撞解離（HCD）對26電荷的母離子進行碎裂，階梯碰撞能量為 20% ， 30% 和 40% ；動態(tài)排除時間為 15s ，質(zhì)量數(shù)據(jù)由XCalibur進行實時采集.

1.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

使用人類 Swiss-Prot蛋白庫（版本 20220329，20 376個序列）通過 pGlyco[22]和 PANDA 軟件分析完整糖肽原始質(zhì)譜文件.修飾包括 Carbamidomethylation（C）、Acetyl（Protein N-term）、Deamidation（N）和 Oxi-dation（M）.通過將“N\"改為\"J\"來修飾N-糖基化序列.母離子質(zhì)量偏差（mass tolerance）為士 =0.000 4% ，子離子質(zhì)量偏差（peptidetolerance）為 ±0.002 0% ，允許2個漏切位點.完整糖肽鑒定的質(zhì)量控制方法設(shè)置為FDR小于 1% ，其他設(shè)置參數(shù)選擇默認(rèn)值.

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析使用Perseus[23]完成.N-糖肽的顯著性閾值設(shè)置為 Plt;0.05 ，兩者的倍數(shù)變化 ≥|1.2| .采用Benjamini-Hochberg（BH）程序進行多次測試校正.篩選出的差異基因，使用ClusterProfiler 4.0^[24] 做GO（gene ontology）和 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析.使用 String 進行蛋白互作分析（PPI）[25]，PPI網(wǎng)絡(luò)使用 Catoscape優(yōu)化，關(guān)鍵基因使用cytoHubba插件篩選.

2 結(jié)果

2.1蛋白質(zhì)糖基化修飾組質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集與數(shù)據(jù)解析

本研究運用超高分辨質(zhì)譜技術(shù)，針對5例結(jié)直腸癌患者和5例健康人的血漿樣本，進行了糖基化修飾組的系統(tǒng)性質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，研究技術(shù)路線如圖1所示.

首先，借助 PierceTM TOP 14 試劑盒，有效去除了血漿中14 種高豐度蛋白質(zhì)，減少可能對后續(xù)分析造成干擾的因素.然后，采用FASP肽段酶切方案，成功獲取了肽段序列.隨后，利用HILIC糖肽富集方案，完成糖基化修飾肽段富集，有效提高了糖基化修飾肽段的檢測靈敏度.最后，基于Orbitrap Fusion Lumos 質(zhì)譜儀器，完成了肽段信息的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，并通過pGlyco 和 Panda軟件完成了質(zhì)譜數(shù)據(jù)的定性與定量分析.通過數(shù)據(jù)解析，本研究在10例樣本中共鑒定出2175條完整N-糖肽，平均鑒定數(shù)為1959條，涉及161個糖蛋白質(zhì)（附錄圖S1（a））、475種N-聚糖和245個N-糖基化修飾位點（附錄圖S1（b））.

2.2蛋白質(zhì)糖基化修飾組的細(xì)胞定位與功能

通過細(xì)胞定位的富集分析，本研究鑒定到具有糖基化修飾的血漿蛋白質(zhì)主要聚焦在28個細(xì)胞組成模塊內(nèi).這些模塊進一步歸納為7個網(wǎng)絡(luò)模塊，它們主要定位于囊泡腔、膜攻擊復(fù)合物、血小板致密顆粒、血漿脂蛋白顆粒、細(xì)胞外基質(zhì)、三級顆粒、特定顆粒腔等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如圖2（a）所示.生物學(xué)過程的富集分析結(jié)果表明，所鑒定的血漿糖蛋白質(zhì)主要集中于209個信號通路中，并被整合為18個相似的網(wǎng)絡(luò)模塊.這些模塊主要與補體激活、血管重塑、趨化反應(yīng)、纖維蛋白凝塊生成、纖維蛋白溶解、血管新生、酶原的激活、血液凝固、吞噬機制、肽酶活性、血漿脂蛋白顆粒的重塑以及細(xì)胞外基質(zhì)成分的分泌等生物學(xué)過程有關(guān)，如圖2（b）所示.

2.3 結(jié)直腸癌血漿的差異表達(dá)糖基化肽段

為了系統(tǒng)地篩查結(jié)直腸癌血漿中差異表達(dá)的糖基化肽段，對結(jié)直腸癌患者與健康人的血漿蛋白質(zhì)糖基化修飾進行了對比分析，并采用 t -檢驗作為主要評估工具.與健康人群相比，結(jié)直腸癌患者的血漿中鑒定出152條差異表達(dá)的完整N-糖肽，其中63條呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢和88條呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢，如圖3（a）和3（c）所示.利用無監(jiān)督的主成分分析（PCA），第一主成分表征了 60.3% 的完整N-糖肽變量，第二主成分表征了 9.2% 的完整N-糖肽變量，如圖3（b）所示.基于差異表達(dá)的完整N-糖肽，本研究在第一主成分和第二主成分上能夠有效區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康人群.結(jié)果表明，血漿中的糖基化修飾水平變化可以作為結(jié)直腸癌早期診斷的有效指標(biāo).

2.4差異N-糖肽的功能注釋

利用ClusterProfiler軟件，針對差異表達(dá)的完整N-糖肽展開功能富集分析，其中主要參照基因本體（GO）和KEGG的信號通路.分析結(jié)果表明，差異表達(dá)的完整N-糖肽在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，顯著富集在細(xì)胞外基質(zhì)（collagen-containing extracellular matrix）、囊泡腔（vesicle lumen）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（endoplasmic reticulum lumen）等結(jié)構(gòu)上.差異表達(dá)N-糖肽主要參與了硫化合物結(jié)合（sulfur compound binding）、糖胺聚糖結(jié)合（glycosaminoglycan binding）、肝素結(jié)合（heparin binding）、酶抑制劑活性（enzyme inhibitor activity）和內(nèi)肽酶抑制劑活性（endopeptidaseinhibitor activity）等分子功能.此外，差異表達(dá)的完整 N-糖肽還參與了體液免疫反應(yīng)（humoral immune re-sponse）、凝血的負(fù)調(diào)節(jié)（negative regulation of coagulation）、內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)（negative regulation ofendopeptidase activity）、纖溶（fibrinolysis）和補體激活（complement activation）等生物學(xué)過程（圖4（a））.在KEGG 信號通路中，差異表達(dá)的完整 N-糖肽主要參與了補體和凝血級聯(lián)（complement and coagulation cas-cades）肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)（regulation of actin cytoskeleton）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuro-active ligand-receptor interaction）、膽固醇代謝（cholesterol metabolism）和 ECM受體相互作用（ECM-re-ceptor interaction）等信號通路（圖 4（b））.其中，膽固醇代謝和ECM受體等信號通路已明確報道與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系[26].

2.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析及候選標(biāo)志物篩選

采用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析方法，進一步對差異表達(dá)完整N-糖肽的蛋白相關(guān)性進行深入分析，擬獲得具有代表性的糖基化修飾候選生物標(biāo)志物.基于Cytoscape軟件，采用cytoHubba 插件對蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）進行了系統(tǒng)性分析，篩查獲得了1O個具有代表性的候選生物標(biāo)志物，主要包括KNG1、F2、FGB、HRG、APOH、APOB、ORM2、AHSG、ORM1 和 SERPIND1等糖蛋白質(zhì)（圖5（a，b）.相對于健康人群而言，結(jié)直腸癌患者 FGB蛋白質(zhì)的完整 N-糖肽GTAGNALMDGASQLMGEN394R_HexNAc5Hex4，AH-SG蛋白質(zhì)的完整N-糖肽KVCQDCPLLAPLN156DTR_HexNAc3Hex7Fuc2，ORM1蛋白質(zhì)的完整N-糖肽NEEYN56K_HexNAc6Hex5NeuAc2Fuc3等表達(dá)量顯著上調(diào)；KNG1蛋白質(zhì)的完整N-糖肽LNAENN294ATFYFK_HexNAc6Hex10，ORM2 蛋白質(zhì)的完整 N-糖肽 QN88QCFYJSSYLNVQR_Hex-NAc6Hex5NeuAc3，APOH蛋白質(zhì)的N-糖肽 LGN253WSAMPSCK_HexNAc7Hex4NeuAc1等表達(dá)量顯著下調(diào)，如圖5（c）所示.此外，研究系統(tǒng)分析了FGB蛋白質(zhì)的完整N-糖肽GTAGNALMDGASQLMGEN394R_HexNAc5Hex4的質(zhì)譜圖，并進行標(biāo)注，證明了質(zhì)譜分析結(jié)果的可靠性，如附錄圖S2所示.

3討論

目前，在結(jié)直腸癌的早期診斷中，CEA是應(yīng)用最廣泛的血漿生物標(biāo)志物.此外，還有CA19-9、CA242、CA50、CA74-2和TIMP-1等生物標(biāo)志物，但其敏感性和特異性表現(xiàn)都不佳[9].此外，現(xiàn)行的臨床篩查手段包括糞便隱血檢測、結(jié)腸鏡、膠囊內(nèi)窺鏡及CT掃描等[6-7]，但由于某些篩查方法可能帶來的風(fēng)險或不適，尋找無創(chuàng)或更為敏感和特異的生物標(biāo)志物顯得尤為重要.本研究利用非標(biāo)記的糖基化修飾蛋白質(zhì)組分析技術(shù)成功鑒定了152條與結(jié)直腸癌有關(guān)的差異表達(dá)N-糖肽，涉及47種糖蛋白.其中63條N-糖肽呈現(xiàn)上調(diào)，而88條呈現(xiàn)下調(diào).基于以上發(fā)現(xiàn)，篩選出了10種可能作為結(jié)直腸癌血漿生物標(biāo)志物的候選蛋白質(zhì)多肽，包括KNG1、F2、FGB、HRG、APOH、APOB、ORM2、AHSG、ORM1 和 SERPIND1 等.APOB 和 HRG 蛋白質(zhì)及其糖基化修飾的差異表達(dá)已被文獻(xiàn)報道與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān).APOB主要負(fù)責(zé)脂質(zhì)的運輸，研究發(fā)現(xiàn)處于不同階段的結(jié)直腸癌患者，其血漿中的APOB蛋白表達(dá)量均有顯著增高，且其糖基化修飾異常與結(jié)直腸癌的異常增生相關(guān)[27]，APOB可能是結(jié)直腸癌術(shù)后預(yù)后評估的有效生物標(biāo)志物[28].另外，富含組氨酸的糖蛋白（histidine-rich glycoprotein，HRG）已被確認(rèn)為一種有效抑制腫瘤血管生成的物質(zhì)，它可以顯著減少腫瘤細(xì)胞的遷移、血管新生和生長[29].研究顯示，結(jié)直腸癌或腺癌患者的糖基化修飾存在異常變化，其中唾液酸和巖藻糖基化水平顯著上升，這暗示血液 HRG蛋白的 N-糖肽有望成為結(jié)直腸癌的潛在生物標(biāo)志物[30].

此外，AHSG、APOH、FGB、KNG1、ORM1、ORM2、THRB 蛋白質(zhì)差異表達(dá)被發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌有關(guān).α -2-HS-糖蛋白（alpha-2-HS-glycoprotein，AHSG）已被報道參與人類的大腦發(fā)育、骨代謝調(diào)節(jié)[31]、胰島素抑制[2]、結(jié)直腸癌的遷移和侵襲[33等許多正常和病理過程.通過對健康人和結(jié)直腸癌患者的血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析，AHSG可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)病機制，并可作為潛在的血清學(xué)診斷的生物標(biāo)志物[34].同時，CHOI等[35]使用同種分析方法發(fā)現(xiàn)AHSG具有預(yù)測腺瘤向癌進展的診斷潛力.MA等[36]分析了血清樣本的蛋白質(zhì)和代謝物譜，發(fā)現(xiàn)APOH可作為生物標(biāo)志物，并驗證了它對結(jié)直腸癌診斷的潛力.纖維蛋白原由三對多肽鏈組成，分別命名為 α，β 和 γ ，這些鏈分別由 FGA，F(xiàn)GB（fibrinogen beta chain）和FGG 編碼.纖維蛋白原主要參與凝血、炎癥和血管生成.研究發(fā)現(xiàn)FGB在結(jié)直腸癌血漿中的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，提示 FGB可作為結(jié)直腸癌患者早期診斷和了解腫瘤發(fā)生的血漿潛在生物標(biāo)志物[37].另外，YANG 等[38]發(fā)現(xiàn)FGB作為肝轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的診斷和治療生物標(biāo)志物起著關(guān)鍵作用.激肽原1（kininogen-1）在凝血過程中發(fā)揮重要作用，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成[39].已有研究發(fā)現(xiàn)KNG1在早期結(jié)直腸癌患者血清中的異常表達(dá)，表明該蛋白可能是早期檢測的潛在生物標(biāo)志物[40].ORM1（alpha-1-acid glycoprotein）和 ORM2（alpha-2-acid glyco-protein）都屬于急性期蛋白，炎癥反應(yīng)時含量增加.KASAHARA 等[41]發(fā)現(xiàn)ORM1對結(jié)直腸癌患者總生存期（OS）有顯著貢獻(xiàn)，提示ORM1可能是與OS密切相關(guān)的因素之一.GAO等[42」采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿ORM2水平，多因素分析表明，血漿ORM2是Ⅱ期結(jié)直腸癌患者總體和腫瘤特異性生存的獨立預(yù)后因素 （Plt;0.05） .在此之前，ZHANG等[43通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，證明了ORM2可作為結(jié)直腸癌診斷的潛在生物標(biāo)志物.凝血酶原（THRB）是凝血機制的重要組成部分.已明確報道凝血酶原在結(jié)腸腺癌的進展中發(fā)揮著廣泛的作用，THRB既促進原發(fā)腫瘤的生長，也促進循環(huán)腫瘤細(xì)胞形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的潛力[44].

綜上，本研究系統(tǒng)地鑒定了蛋白質(zhì)糖基化修飾在結(jié)直腸癌患者血液中的差異表達(dá)模式，與早期關(guān)于結(jié)直腸癌的研究結(jié)果高度吻合，進一步驗證了血漿蛋白質(zhì)糖基化修飾組學(xué)方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性.除了之前報道的生物標(biāo)志物外，我們還鑒定了SERPIND1作為新的結(jié)直腸癌潛在生物標(biāo)志物.SERPINDl是一種糖蛋白及蛋白酶抑制劑，具有抑制凝血酶的活性，并與肝素、硫酸皮膚素及其他內(nèi)源性糖胺聚糖發(fā)生相互作用[45].鑒于本研究的樣本量有限，為進一步確定 AHSG、APOH、FGB、KNG1、ORM1、ORM2、THRB 和 SER-PIND1與結(jié)直腸癌的相關(guān)性，未來將在更大的樣本隊列中進行驗證研究.同時，為確保所篩選生物標(biāo)志物的精確性和穩(wěn)健性，后續(xù)研究還需進行相關(guān)生物學(xué)功能驗證實驗，進一步揭示其在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中的分子角色和生物學(xué)意義.

附錄見電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.08.11.0002）.

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Zhao Yangl ，Zeng Jiaming ^1，2 ，Zhao Jiawei3，Meng Bo2 （1.Center for Advanced Measurement Science，National Institute of Metrology，Beijing looo29，China; 2. College of Chemical Engineering，Shenyang University of Chemical Technology，Shenyang 10142， China；3.College of Life Sciences，China Jiliang University，Hangzhou 31oo18，China）

Abstract： Colorectalcancer isone of the most common malignant tumors worldwide，and its mortality risk is closely re lated tothe stageof earlydiagnosis.Toimprove patientprognosisand reduce mortality，identifying efective biomarkers for earlydiagnosisofcolorectalcanceriscrucial.Inthisstudy，label-freequantitativeglycoproteomics technologywasaiedto conductacomprehensiveanalysisof theglycosylationpaterns inplasma samplesfromcolorectalcancer patientsand healthyindividuals.Asaresult，152 diferential integratedN-glycopeptideswithupregulatedor downregulatedexpressionspecificto colorectalcancerpatients wereidentified，efectivelydistingushingbetweenhealthyindividualsandpatients.Furtheranalysis revealed that the specific expresionof integrated N-glycopeptides from proteins like KNG1，THRB，F(xiàn)GB，APOH，ORM2， AHSG，ORM1，and SERPINDl significantlycorrelates with the progressonofcolorectalcancer，offering substantialdata support for early disease diagnosis and screening.

Keywords： colorectal cancer; plasma; proteome; glycosylation modification; LC-MS/MS