中圖分類號(hào)：Q939 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-2367（2025）04-0132-09

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)定居有大量的瘤胃微生物，包括細(xì)菌、古菌、真菌、原生動(dòng)物和病毒等，其中的原生動(dòng)物主要是瘤胃纖毛蟲.瘤胃纖毛蟲廣泛存在于家養(yǎng)反芻動(dòng)物牛和羊的瘤胄中，其密度可達(dá) 10⁵～10⁶mL^-1 瘤胃液，占瘤胃內(nèi)微生物總生物量的50 ＼% [ 1 - 2 ] } .瘤胃纖毛蟲在穩(wěn)定瘤胃內(nèi)環(huán)境、降解植物纖維素、調(diào)控瘤胃微生物組成和與瘤胃原核生物互作產(chǎn)甲烷等方面發(fā)揮著重要作用[3-6].

瘤胃纖毛蟲的種類繁多，宿主瘤胃內(nèi)瘤胃纖毛蟲的物種組成和物種數(shù)目根據(jù)宿主的種類、飼喂條件、日糧組成和晝夜變化等發(fā)生變化 [7-9] .目前已報(bào)道多種不同宿主的瘤胃纖毛蟲類群超過(guò)42個(gè)屬多達(dá)250余種形態(tài)種（morphospecies）[10-1] .長(zhǎng)期以來(lái)，光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)觀察鑒定被廣泛認(rèn)為是研究瘤胃纖毛蟲物種多樣性和密度的金標(biāo)準(zhǔn)[11-12].然而，光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)觀察鑒定瘤胃纖毛蟲不僅煩瑣耗時(shí)，而且對(duì)分類學(xué)專業(yè)知識(shí)具有很強(qiáng)的依賴性，同時(shí)可能由于瘤胃纖毛蟲的多種形態(tài)種以及一些瘤胃纖毛蟲物種在采樣和處理過(guò)程中易發(fā)生裂解等原因而錯(cuò)估瘤胃纖毛蟲的類群和豐度.

隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的進(jìn)展，分子生物學(xué)研究方法在描述自然種群中微生物群落多樣性方面的應(yīng)用逐漸增多[13-15].高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)是一種快速發(fā)展的不依賴于培養(yǎng)而可全面反映未培養(yǎng)樣品中微生物的多樣性和組成特點(diǎn)的分子生物學(xué)技術(shù)，與傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)相比，HTS技術(shù)具有更高的測(cè)序速度、更低的堿基成本和更高的準(zhǔn)確性優(yōu)勢(shì)[16-17].近年來(lái)，HTS技術(shù)被廣泛應(yīng)用于揭示瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)中原核微生物的組成和群落多樣性[18-24].此外，利用 HTS技術(shù)還揭示了不同反芻動(dòng)物個(gè)體間瘤胃內(nèi)細(xì)菌群落的差異性[25].雖然末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）和18S rRNA基因焦磷酸測(cè)序等多種分子生物學(xué)方法也被用于研究瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)中真核微生物瘤胃纖毛蟲的物種多樣性[26-30]，但尚缺乏采用高通量測(cè)序技術(shù)全面揭示家養(yǎng)反芻動(dòng)物瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)中瘤胃真核微生物瘤胃纖毛蟲的物種多樣性和宿主個(gè)體間差異性的研究報(bào)道.

中國(guó)荷斯坦奶牛是世界上產(chǎn)奶量最高、飼養(yǎng)數(shù)量最多的奶牛品種，作為優(yōu)質(zhì)奶源在我國(guó)也具有廣闊的市場(chǎng)前景.本研究采用高通量的 18SrRNA 基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，研究了常見(jiàn)家養(yǎng)反芻動(dòng)物中國(guó)荷斯坦奶牛瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)中瘤胃纖毛蟲的物種多樣性及其在宿主個(gè)體間的差異性.在中國(guó)荷斯坦奶牛瘤胃中共鑒定到38個(gè)OTU，主要分布于10個(gè)瘤胃纖毛蟲的已知屬，其中內(nèi)毛屬是相對(duì)豐度最高的屬.飼喂條件相同的中國(guó)荷斯坦奶牛的不同宿主個(gè)體間，瘤胃纖毛蟲物種的豐富度和群落結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著差異，但物種均勻度略有差異.該研究工作將為瘤胃纖毛蟲的高通量測(cè)序分析和綜合分類學(xué)研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和固定

本研究所進(jìn)行的瘤胃液采集實(shí)驗(yàn)經(jīng)江漢大學(xué)學(xué)術(shù)倫理審查委員會(huì)審查（編號(hào)：JHDXLL2020-002），符合相關(guān)法律法規(guī)以及相關(guān)倫理原則.在武漢市江夏區(qū)某農(nóng)場(chǎng)，選用3頭年齡在 3～5 歲之間、平均質(zhì)量為 （558± 14.6）kg 的健康三胎泌乳中期的中國(guó)荷斯坦奶牛，分別標(biāo)記為 AC1、AC2和AC3，進(jìn)行瘤胃液樣品采集.這些奶牛的飼喂方式和瘤胃液樣品的采集方法[7]與文獻(xiàn)[31]一致.每頭奶牛采集3份瘤胃液樣品，分別標(biāo)記為AC1.1、AC1.2、AC1.3、AC2.1、AC2.2、AC2.3、AC3.1、AC3.2和 AC3.3.采集的瘤胃液樣品立即存放在干冰中，運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室后保存在一 80°C ，備用于后續(xù)瘤胃微生物基因組DNA的提取.

1.2 DNA提取、18SrRNA基因擴(kuò)增和高通量測(cè)序

使用QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen）試劑盒提取瘤胃微生物基因組的 DNA，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行.采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（NanoDrop-ND100O）和質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的純度和濃度，提取質(zhì)量合格的DNA使用無(wú)菌水稀釋至 1ng/μL ，送至北京諾禾致源科技股份有限公司擴(kuò)增纖毛蟲18SrRNA基因的V5至V8可變區(qū)（約 500bp ）.參照前人報(bào)道[32]，瘤胃纖毛蟲18SrRNA基因特異性引物RP841F（ 5^′ -GACTAGGGATTGGARTGG- 3^′ ）和Reg 1302R （ 5^′ -AATTG-CAAAGATCTATCCC- ?3^′ ）用于擴(kuò)增纖毛蟲18SrRNA基因的V5至V8可變區(qū)，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為500bp^[27] .PCR反應(yīng)在 30μL 反應(yīng)體系中進(jìn)行，包括 High-Fidelity PCR Master Mix（NewEngland Biolabs） .0.2μmol/L 的正向和反向引物、 10ng 模板DNA和剩余體積的無(wú)酶無(wú)菌水.PCR反應(yīng)條件為： 98°C 預(yù)變性 1min，98^°C 變性 30s，50^°C 退火 30s，72^°C 延伸 30s ，最后 72°C 延伸 5min.PCR 產(chǎn)物采用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用GeneJETTMGel ExtractionKit（Thermo Scientific）純化擴(kuò)增產(chǎn)物.按照 Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns（Thermo Scientific）的說(shuō)明書生成測(cè)序文庫(kù)，使用Qubit Fluorometer（Thermo Scientific）評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量.最后，采用Ion S5^TM XL平臺(tái)對(duì)質(zhì)量合格文庫(kù)進(jìn)行 400～600 bp讀長(zhǎng)的單端測(cè)序.

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序獲得的Fastq格式的原始數(shù)據(jù)（raw data）采用Cutadapt[33]過(guò)濾去除低質(zhì)量序列和使用UCHIME算法[34]去除嵌合體序列，得到有效數(shù)據(jù)（clean data）用于后續(xù)分析.使用Uparse（v7.0.1001）軟件[35]進(jìn)行序列比對(duì)分析，按 97% 的序列相似性進(jìn)行歸并和OTU劃分.OTU的豐度信息采用與序列最少的樣品相對(duì)應(yīng)的序列數(shù)目為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化.每個(gè)OTU中豐度最高的序列被選取作為該OTU的代表序列，根據(jù)每個(gè)OTU在每個(gè)樣本中的序列數(shù)目，構(gòu)建OTU在每個(gè)樣本中豐度的矩陣文件.獲得的OTU分別與 PR² 數(shù)據(jù)庫(kù)（theprotist ribosomal reference database，原生動(dòng)物核糖體參考數(shù)據(jù)庫(kù)）（v4.12.O）[36]和 SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)（SSURefNR99138）[37]進(jìn)行比對(duì)，對(duì)OTU代表序列進(jìn)行物種分類.比較參考上述兩個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU的分類結(jié)果，采用注釋序列較多的參考數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果用于后續(xù)分析.

采用QIIME（quantitative insights into microbial ecology）軟件（v1.9.1）[38]進(jìn)行了 α 多樣性和 β 多樣性分析，并利用R軟件（v2.15.3）進(jìn)行結(jié)果展示. a 多樣性分析計(jì)算了 Observed species、Chaol、abundance-based coverage estimator（ACE）、goods_coverage、Shannon 和 Simpson 等指數(shù).β 多樣性分析采用QIIME 軟件（v1.9.1）計(jì)算了加權(quán)和非加權(quán) UniFrac 指數(shù).在R軟件（v2.15.3）中，使用WGCNA包、stat 包和ggplot2 包進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA），并使用相似性分析（ANOSIM）[39]檢驗(yàn)個(gè)體之間的差異顯著性.

1.4瘤胃纖毛蟲的顯微觀察和計(jì)數(shù)

AC1、AC2 和AC3三頭牛的瘤胃液樣品用甲基綠-福爾馬林溶液固定后，在光學(xué)顯微鏡（美國(guó) NEX-COPE NE610）下觀察和計(jì)數(shù)各樣品中瘤胃纖毛蟲的種屬組成，具體的固定方法和瘤胃纖毛蟲種屬組成計(jì)數(shù)的方法與前期研究一致[7].

2結(jié)果

2.1 測(cè)序深度、覆蓋率和生物信息學(xué)分析總結(jié)

本研究從3頭中國(guó)荷斯坦奶牛的9個(gè)樣品中共獲得了721 264條原始序列.經(jīng)過(guò)質(zhì)量過(guò)濾后，獲得了721250條有效序列，序列平均長(zhǎng)度為 （476.7±0.47） bp.基于序列一致性為 97% 的原則對(duì)所有有效序列進(jìn)行OTU聚類，共獲得38個(gè)OTU，每個(gè)樣品的OTU數(shù)量平均為32個(gè)，其中樣品 AC2.3和 AC3.2包含的OTU數(shù)最少為30個(gè)，樣品AC2.1包含的OTU數(shù)最多為36個(gè)（圖1）.

比較參考 PR² 數(shù)據(jù)庫(kù)和 SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)的OTU的分類結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，參考兩個(gè)不同的公共數(shù)據(jù)庫(kù)分配給界（Kingdom）、門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）分類階元的序列數(shù)量幾乎相同;然而，在科尤其是在屬（Genus）和種（Species）分類階元時(shí)，參考 SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)比參考PR2數(shù)據(jù)庫(kù)注釋了更多的序列（圖2）.因此，本研究后續(xù)分析中采用參考 SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果進(jìn)行OTU的分類.AC1、AC2 和AC33頭奶牛的樣品共享34個(gè)OTUs.與此同時(shí)，AC2個(gè)體樣品具有4個(gè)獨(dú)特的OTUs.稀釋曲線呈現(xiàn)了OTUs中序列的數(shù)目與瘤胃纖毛蟲物種豐富度之間的關(guān)系，在本研究的測(cè)序深度下，每個(gè)樣品的稀釋曲線都從起始的陡峭的斜率到最終均趨于平緩，表明本研究的測(cè)序深度足以識(shí)別每個(gè)樣品中的微生物.

（a）參考PR2數(shù)據(jù)庫(kù)，（b）參考SILVA數(shù)據(jù)庫(kù).界（Kingdom）、門（Phylum）、綱（Class）和目（Order）這4個(gè)分類階元被注釋到的測(cè)序序列數(shù)目幾乎一致，圖中它們的柱子重疊，僅列出科屬種水平的序列數(shù)目作為代表.

2.2 多樣性分析

表1總結(jié)了反映每個(gè)樣品中瘤胃纖毛蟲豐富度和均勻度的 α 多樣性的度量指數(shù).每個(gè)樣品的goods_coverage均為 100% ，表明9個(gè)不同樣品的測(cè)序深度都是準(zhǔn)確且可比較的，測(cè)序覆蓋度均已飽和.Observedspecies、Chaol、ACE 和 goods_coverage 指數(shù)被用來(lái)評(píng)估瘤胃纖毛蟲物種的豐富度，Simpson 和 Shannon 指數(shù)被用來(lái)評(píng)估瘤胃纖毛蟲物種的均勻度.表2和表3展示了3個(gè)個(gè)體樣品的 α 多樣性指數(shù)及比較分析結(jié)果，Observed species、Chaol、ACE 和 goods coverage指數(shù)在 3個(gè)個(gè)體之間沒(méi)有顯著差異，表明不同個(gè)體宿主的瘤胃纖毛蟲物種的豐富度沒(méi)有顯著差異.AC1和 AC2之間的 Simpson 和 Shannon 指數(shù)沒(méi)有顯著差異，表明它們之間的物種均勻度沒(méi)有顯著差異;AC1 和 AC2 的 Simpson 和 Shannon 指數(shù)顯著高于 AC3 對(duì)應(yīng)的指數(shù)，表明 AC1 和 AC2個(gè)體間的不同OTUs比AC3個(gè)體的OTUs分布更均勻.

為比較不同個(gè)體間瘤胃纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)的差異性，基于加權(quán)和未加權(quán)的UniFrac 距離矩陣進(jìn)行了PCoA 和ANOSIM相似性分析.PCoA結(jié)果顯示，3個(gè)個(gè)體的9個(gè)樣本的數(shù)據(jù)沒(méi)有顯著差異，來(lái)自不同個(gè)體的樣本聚集在一起（附錄圖S1）.ANOSIM相似性分析結(jié)果（表4）表明，AC1、AC2和AC3個(gè)體之間的瘤胃纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著差異.這些結(jié)果表明，相同飼喂條件下圈養(yǎng)在同一牧場(chǎng)的奶牛不同個(gè)體樣品間的瘤胃纖毛蟲的群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著性差異，

2.3 瘤胃纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)

圖3展示了基于高通量測(cè)序技術(shù)分析的瘤胃纖毛蟲群落在屬和種分類水平的組成和結(jié)構(gòu)（圖3（a）和圖3（b））以及采用光學(xué)顯微鏡觀察鑒定的瘤胃纖毛蟲屬水平的豐度分布（圖3（c））.在屬分類水平，所有樣品中共鑒定出10個(gè)已知屬，各樣品中瘤胃纖毛蟲屬水平的群落組成見(jiàn)圖3（a），其中內(nèi)毛屬（Entodinium）的相對(duì)豐度最高，占 30.55% ，頭毛屬（Ophryoscolex）、雙毛屬（Diplodinium）、多甲屬（Polyplastron）和單甲屬（Eremoplastron）的相對(duì)豐度分別為 29.34%.11.67%.9.33% 和 8.85% ，其他5個(gè)屬厚毛屬（Dasytricha）、后毛屬（Metadinium）、等毛屬（Isotricha）、雙甲屬（Diploplastron）和 Blepharocorys，它們的相對(duì)豐度均小于5% .此外，還有未分類的其他屬.在3個(gè)不同個(gè)體樣品中，AC1和AC2個(gè)體中最主要的屬是內(nèi)毛屬，其次是頭毛屬;而在AC3個(gè)體中，頭毛屬是最主要的屬，其次是內(nèi)毛屬（圖3（a））.在種水平，僅注釋到7個(gè)已知的物種（圖3（b）），表明在SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)中仍有大量瘤胃纖毛蟲的 18SrDNA 序列未知.采用光學(xué)顯微鏡觀察鑒定計(jì)數(shù)3個(gè)個(gè)體樣品中瘤胃纖毛蟲各屬的組成，結(jié)果AC1、AC2和AC3個(gè)體樣品中分別鑒定到9個(gè)、12 個(gè)和10個(gè)屬的瘤胃纖毛蟲，顯微鏡觀察鑒定到的12個(gè)屬包括了基于高通量測(cè)序分析鑒定的9個(gè)屬，顯微鏡觀察中發(fā)現(xiàn)但在高通量測(cè)序分析中未鑒定到的3個(gè)屬為低豐度的真雙毛屬（Eudiplodinium）、硬甲屬（Ostrcodinium）和前毛屬（Epidinium）.采用兩種不同的研究方法均發(fā)現(xiàn)內(nèi)毛屬是中國(guó)荷斯坦奶牛瘤胃內(nèi)豐度最高的屬（圖3（c））.以上結(jié)果表明采用高通量測(cè)序方法和光學(xué)顯微鏡觀察法均能較好地鑒定出樣品中常見(jiàn)的瘤胃纖毛蟲物種，但對(duì)于豐度較低的物種，高通量測(cè)序方法可能會(huì)產(chǎn)生假陰性.

3討論

瘤胃纖毛蟲是反芻動(dòng)物瘤胃中最主要的真核微生物原生動(dòng)物.瘤胃纖毛蟲難以被分離和體外維持培養(yǎng)[40]，導(dǎo)致收集瘤胃纖毛蟲物種信息十分困難.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，18SrRNA基因已成為從環(huán)境樣品中檢測(cè)未培養(yǎng)真核生物的重要標(biāo)記基因.本研究中，我們采用不依賴于培養(yǎng)的高通量的18SrRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，分析了中國(guó)荷斯坦奶牛瘤胃纖毛蟲物種的多樣性和宿主不同個(gè)體間瘤胃纖毛蟲物種的差異.

采用高通量測(cè)序技術(shù)，在3頭牛的9個(gè)樣品中，共檢測(cè)到38個(gè)瘤胃纖毛蟲的OTUs，其中有34個(gè)OTUs在3個(gè)個(gè)體樣品中共享，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于以前[19，24]在反芻動(dòng)物瘤胃中使用16SrRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序鑒定到的瘤胃細(xì)菌OTUs的數(shù)量[25].本研究中瘤胃纖毛蟲群落的 α 多樣性指數(shù)，包括Chaol、ACE、Shannon 和Observedspecies等指數(shù)，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于以前報(bào)道的瘤胃細(xì)菌群落對(duì)應(yīng)的指數(shù)[18，24].所有這些結(jié)果表明，在使用高通量測(cè)序方法時(shí)，瘤胃細(xì)菌的多樣性和豐度也明顯高于反芻動(dòng)物瘤胃中的瘤胃纖毛蟲的多樣性和豐度.相比較于前期基于分子生物學(xué)方法研究的瘤胃纖毛蟲物種多樣性的結(jié)果，本研究使用高通量測(cè)序技術(shù)獲得的瘤胃纖毛蟲的OTUs數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以傳統(tǒng)測(cè)序方法報(bào)道的牛瘤胃纖毛蟲的數(shù)量[29-30]，表明傳統(tǒng)的測(cè)序方法可能低估了瘤胃纖毛蟲的多樣性.此外，本研究中奶牛瘤胃纖毛蟲物種的Shannon 指數(shù)明顯高于使用 T-RELP方法研究的牛瘤胃纖毛蟲物種的 Shannon指數(shù)[26]，表明高通量測(cè)序分析明顯優(yōu)于T-RELP方法來(lái)揭示瘤胃纖毛蟲物種多樣性的全貌.

注：“Others”代表無(wú)對(duì)應(yīng)分類類群.參考SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有樣品的OTUs在（a）屬水平和（b）種水平水平進(jìn)行分類；（c）光學(xué)顯微鏡觀察鑒定3個(gè)個(gè)體樣品的瘤胃纖毛蟲在屬水平上的相對(duì)豐度.

采用高通量測(cè)序技術(shù)在3個(gè)個(gè)體樣品中共檢測(cè)到10個(gè)屬的瘤胃纖毛蟲，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了一些未知屬，表明在中國(guó)荷斯坦奶牛的瘤胃中可能還存在一些未知的瘤胃纖毛蟲，或者有些瘤胃纖毛蟲的18S rDNA 序列尚未收錄在SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)中.前人研究采用光學(xué)顯微鏡觀察鑒定，在中國(guó)陜西的5頭荷斯坦奶牛宿主中鑒定到 6～11 個(gè)屬的瘤胃纖毛蟲[41]，在加拿大的4頭荷斯坦奶牛宿主中鑒定到5個(gè)屬的瘤胃纖毛蟲[42]，在日本的125頭荷斯坦奶牛中共鑒定到15個(gè)屬的瘤胃纖毛蟲[43]，但其中的Oligoisotricha、Eodinium 和Microcetus 屬目前已認(rèn)為是非有效屬[1]，因此，前人報(bào)道的荷斯坦奶牛宿主個(gè)體瘤胃內(nèi)纖毛蟲的屬分布為 5～ 12 個(gè)不等.本研究高通量測(cè)序獲得的3個(gè)荷斯坦奶牛宿主瘤胃內(nèi)的十屬纖毛蟲除 Blepharocorys外，其他9屬都包含在前人報(bào)道的屬中，表明高通量測(cè)序技術(shù)能夠快速鑒定樣品中瘤胃纖毛蟲的物種多樣性.

此外，本研究通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察鑒定，在3個(gè)個(gè)體的混合樣品中共鑒定到12個(gè)屬的瘤胃纖毛蟲（圖 3（c））.比較高通量測(cè)序方法和光學(xué)顯微鏡觀察方法檢測(cè)到的瘤胃纖毛蟲屬的差異，發(fā)現(xiàn)真雙毛屬（Eud-iplodinium）、硬甲屬（Ostrcodinium）和前毛屬（Epidinium）的代表物種在顯微觀察中被觀察到，但在參考

SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析的OTUs中未被注釋到（圖3（a）和圖3（c））.然而，比較高通量測(cè)序數(shù)據(jù)參考SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)和參考 PR² 數(shù)據(jù)庫(kù)的OTUs的分類結(jié)果，發(fā)現(xiàn)OTU11在參考 PR² 數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)被分類為真雙毛屬，但在參考 SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)被分類為后毛屬（附錄表 S1）.類似地，OTU4、OTU27和OTU31在參考 PR² 數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)被分類為硬甲屬，但在參考SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)被分類為多甲屬（附錄表S1）.因此，光學(xué)顯微鏡觀察到但未被高通量測(cè)序分析檢測(cè)到的不一致的屬可能是SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)中已有瘤胃纖毛蟲序列的不準(zhǔn)確的分類注釋導(dǎo)致的.已有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毛屬是中國(guó)黃牛和韓國(guó)奶牛瘤胃中最優(yōu)勢(shì)的原生動(dòng)物[29-30].不同飼養(yǎng)條件下，牛瘤胃中內(nèi)毛屬纖毛蟲的比例為 60.0% 至 97.3%^[29] .本研究中，采用高通量測(cè)序分析和光學(xué)顯微鏡觀察兩種不同的研究方法都發(fā)現(xiàn)內(nèi)毛屬是中國(guó)荷斯坦奶牛瘤胃中最優(yōu)勢(shì)的類群.然而，在高通量測(cè)序分析中內(nèi)毛屬的相對(duì)豐度為 30.55% ，而顯微觀察中內(nèi)毛屬的豐度高達(dá)約 90.00% .同一瘤胃液樣品，當(dāng)采用不同的研究方法時(shí)，其中內(nèi)毛屬的豐度差異明顯，這可能是PCR擴(kuò)增偏好于特定種類瘤胃纖毛蟲或不同種類瘤胃纖毛蟲的rRNA基因拷貝數(shù)變異的結(jié)果，與前人報(bào)道的結(jié)果相一致[27].此外，高通量測(cè)序數(shù)據(jù)參考 PR² 數(shù)據(jù)庫(kù)和 SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)注釋時(shí)，許多序列未被分類（圖2），還有一些序列被分類為“其他\"屬，表明當(dāng)前公共數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的有限的瘤胃纖毛蟲 18SrRNA 基因序列，也可能導(dǎo)致光學(xué)顯微鏡觀察和基于 基因分析的瘤胃纖毛蟲種類不一致性.此外，一些OTUs分別參考 PR² 數(shù)據(jù)庫(kù)和SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)的分類命名不一致（附錄表S1），表明在使用高通量測(cè)序分析方法分析反芻動(dòng)物瘤胃中的瘤胃纖毛蟲物種多樣性和不同個(gè)體間的變異性時(shí)，公共數(shù)據(jù)庫(kù)中瘤胃纖毛蟲18S rRNA基因序列的準(zhǔn)確分類命名至關(guān)重要.因此，開(kāi)發(fā)一種可靠的高通量測(cè)序方法來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的光學(xué)顯微鏡觀察以解讀反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)瘤胃纖毛蟲物種多樣性目前具有挑戰(zhàn)性，進(jìn)一步補(bǔ)充和準(zhǔn)確注釋18SrRNA基因參考數(shù)據(jù)庫(kù)中的瘤胃纖毛蟲18SrRNA基因序列是必需的.

采用高通量測(cè)序技術(shù)，前人研究報(bào)道[19]在相同飼料條件下喂養(yǎng)的奶?；蛲晦r(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)的家養(yǎng)牦牛的瘤胃細(xì)菌群落可能存在顯著差異[25].為了解析同一農(nóng)場(chǎng)相同飼喂條件下中國(guó)荷斯坦奶牛不同個(gè)體樣品的瘤胃纖毛蟲的多樣性和個(gè)體間的差異，我們比較了3個(gè)不同個(gè)體瘤胃液樣品的瘤胃纖毛蟲群落的 α 多樣性指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體樣品間瘤胃纖毛蟲物種的豐富度沒(méi)有顯著差異，AC1和AC2個(gè)體之間瘤胃纖毛蟲物種的均勻度也沒(méi)有差異，但AC1或 AC2個(gè)體與AC3個(gè)體之間瘤胃纖毛蟲物種的均勻度略有差異.此外，PCoA和 ANOSIM相似性分析結(jié)果顯示，3個(gè)個(gè)體樣品的瘤胃纖毛蟲的群落結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著差異.因此，考慮到不同個(gè)體之間的均勻度差異較小，進(jìn)一步研究可能需要使用更多的來(lái)自同一農(nóng)場(chǎng)相同飼喂條件下不同個(gè)體的樣本，以全面評(píng)估中國(guó)荷斯坦奶牛個(gè)體間瘤胃纖毛蟲的變異性.

附錄見(jiàn)電子版（DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2024.06.13.0001）.

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High-throughput sequencing deciphering diversity and individual variability of rumen ciliate protozoa in Chinese Holstein dairy cows

HeJinyingl，Xu Qinhuil，Wang Yujia’，Jiang Yixi'，Huang Yifei1，Li Man1，Xiong Jie2，F(xiàn)eng Jinmeil .DepartmentofPathogenicBiology，SchoolofMedicine，JianghanUniversity，Wuhan430o56，China；2.InstituteofHydrobiology State Key Laboratoryof Freshwater Ecology and Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430o72，China）

Abstract：Rumen ciliates，the dominant protozoa in rumen，are integral part of the rumen eco-system and important to therumenecosystem andtheir host animal physiology.However，the fullspectrum of rumen ciliatecommunity diversityand individualvariabilityindomesticatedruminant rumen is stillelusive.Here，using18SrRNAgene high-throughputsequencing technique，wedecipheredtherumen ciliatecommunitydiversityand individual variabilityin Chinese Holsteindairycowrumen. Thespecialprimersetof theciliate18SrRNAgene wereused.Atotalof721250highqualityefectivesequences wereobtained after sequence filtering and chimera removal，and 38 operational taxonomic units（OTUs）were obtained at 97% sequence identity.The diferences inalpha diversity indices，including Chaol，ACE，Shannon，and Simpson indices，among samplesfrom diferent individualswerenotstatisticallysignificant.Taxonomyasignmentsrevealedthatthe identifiedOTUsweresigned totheLitostomatea classTrichostomatia subclassAtthegenus level，ten genera were assigned，of which Entodinium is the most predominantone，andafewunclasifiedandunidentifiedrumen ciliates werealsodetected.No significant diferentofrumenciliatecommunitydiversityamong diferentindividualsfedonthesamedietonthesamefarm，whilelitleevenesdifference was found between different individuals.This work would provideareferencebasis for further studyonmetagenome analyses and integrated taxonomy of rumen ciliates in the future.

Keywords： rumen ciliates; protozoa; diversity;18S rRNA gene sequencing; taxonomy