Optimization of the Method for Simultaneous Determination of Three Mycotoxins in Cereals by Liquid ChromatographyMass Spectrometry

LU Feng （Liaoning Provincial Food and Materials Reserve Affairs Service Center （Liaoning Provincial Grain Inspection and Testing Center）， Shenyang 110033， China）

Abstract： In this study， a method for simultaneous determination of mycotoxins in major cereals by liquid chromatography-mass spectrometry was optimized.This method can achieve complete separation of three mycotoxins， aflatoxin B₁， deoxynivalenol， and zearalenone，within 25min . The spike recovery rate was increased by more than 2% while maintaining analytical precision （relative standard deviation of 0.036% to 0.089% ）and correlation coeficient greater than O.999.This method has high accuracy and sensitivity while ensuring analysis speed， and is highly practical for the determination of mycotoxins in cereals.

Keywords： cereals; mycotoxins; liquid chromatography-massspectrometry; method optimization

谷物作為人們飲食中的重要組成部分，其安全性和質(zhì)量直接關(guān)系到人們的健康。然而，谷物在生長、收獲、儲(chǔ)存和加工過程中，容易受到各種真菌的污染，進(jìn)而產(chǎn)生真菌毒素。這些真菌毒素不僅對人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，還會(huì)影響谷物的品質(zhì)和市場流通。谷物中常見的真菌毒素包括黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等，具有肝毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性、致畸性和致癌性等多種生物毒性。長期攝入含有真菌毒素的谷物，不僅會(huì)增加肝癌、腎癌等惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，還可能對兒童生長發(fā)育造成不良影響，導(dǎo)致其免疫力下降等。因此，對谷物中的真菌毒素進(jìn)行準(zhǔn)確、快速測定顯得尤為重要。在眾多測定方法中，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）以其高靈敏度、高分辨率和高選擇性的優(yōu)勢，成為當(dāng)前真菌毒素測定的主流方法之一。該方法將液相色譜的高效分離能力與質(zhì)譜的強(qiáng)大定性定量功能有機(jī)結(jié)合，具備以下優(yōu)勢：檢測靈敏度極高，能有效識別谷物中痕量真菌毒素，確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性；能夠同時(shí)分離和測定多種真菌毒素，即使在復(fù)雜基質(zhì)中也能獲得清晰的色譜圖，從而提高測定效率和準(zhǔn)確性，降低誤判和漏判風(fēng)險(xiǎn)；

質(zhì)譜的高選擇性使得LC-MS/MS能夠準(zhǔn)確識別目標(biāo)化合物，排除干擾物質(zhì)的影響，特別適用于谷物中多種真菌毒素的同時(shí)測定；樣品處理相對簡便，不需要復(fù)雜的提取和凈化步驟，降低了測定成本，提高了測定效率，具備較高的實(shí)驗(yàn)室推廣價(jià)值。

本文參考《糧油檢驗(yàn)主要谷物中16種真菌毒素的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（LS/T6133—2018）標(biāo)準(zhǔn)，對樣品制備過程和儀器條件進(jìn)行了優(yōu)化。在樣品前處理方面，延長了樣品提取和離心的時(shí)間；在儀器條件方面，則從色譜柱長度、流動(dòng)相比例、質(zhì)譜掃描電壓、氣體流速和加熱溫度等多個(gè)維度進(jìn)行了優(yōu)化。通過線性關(guān)系、精密度實(shí)驗(yàn)、加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)等對比分析，驗(yàn)證了優(yōu)化方法的可行性與優(yōu)勢。

1材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

LC-MS-8045質(zhì)譜儀、LC-40Dxs液相色譜儀，日本島津；CF16RN離心機(jī)，日本天美；BIOFUGEStratos離心機(jī)，美國賽默飛；VortexGenius3.0漩渦混合器，德國IKA；T18勻漿機(jī)，德國 IKA 。

1.2材料與試劑

玉米，明山糧庫J5號庫；黃曲霉毒素 ΔB₁ （MSL023-2）， 100μg?mL^-1 ；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（BWQ8875-2016）， 1000μg?mL^-1 ；玉米赤霉烯酮（BWQ8670-2016）， 1000μg?mL^-1 ；乙腈（CAS：75-05-8）、甲醇（CAS：67-56-1）、乙酸（CAS：64-19-7）、乙酸銨（CAS：631-61-8），色譜純。

1.3儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：RestekRaptor C₁₈ （ 100mm×2.1mm ， 2.7μm ）；流動(dòng)相：A相為5mmol?L^-1 乙酸銨 +1% 乙酸水溶液，B相為甲醇；進(jìn)樣體積： 3μL ；柱溫： 40°C ；流速： 0.3mL?min^-1 洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表 1^[1-2] 專

（2）質(zhì)譜條件。氮?dú)庾黛F化氣和干燥氣，流速分別為 3.0L?min^-1 和 10L?min^-1 ；氬氣作碰撞氣；空氣作加熱氣，流速為 10L?min^-1 ；電噴霧離子源，正負(fù)離子同時(shí)掃描；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MultipleReactionMonitoring，MRM）；離子源接口電壓：+4.5 、 -3.5kV ；脫溶劑管溫度： 250‰ ；接口溫度：300^°C ；加熱模塊溫度： 450°C ；延遲時(shí)間： 1ms ：駐留時(shí)間： 10ms^[3] 號

1.4樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取 5g （精確至 0.01g ）玉米均質(zhì)樣品，置于 50mL 離心管中，加人 20mL 提取液（乙腈-水-乙酸 =70：29：1 ，體積比）渦旋提取 40min ，然后在 6000rmin^-1 轉(zhuǎn)速下離心 15min 。準(zhǔn)確吸取 500μL 上清液，置于 1.5mL 離心管中，并加入 500μL 水渦旋混勻，在低于 10% 的溫度下以 12 000r?min^-1 轉(zhuǎn)速離心 15min ，最后將上清液過 0.2μm 聚四氟乙烯濾膜，備測[4-5]

1.5標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別吸取 1mL 黃曲霉毒素 B₁ Σ₁（Σ₁₀₀Σ_μg?mL^-1 ）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 （ 1 000μg?mL^-1 ）、玉米赤霉烯酮（ 1 000μg?mL^-1 ）至 10mL 容量瓶中，用標(biāo)準(zhǔn)曲線溶劑（乙腈-水-乙酸 =35 64.5 0.5 ，體積比）定容，配制成濃度分別為10、100、 100μg?mL^-1 的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別吸取100、1500、 200μL 的3種單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液至 10mL 容量瓶中，用標(biāo)準(zhǔn)曲線溶劑定容，配成濃度分別為0.1、15.0、 2.0μg?mL^-1 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別吸取25、50、100、250、500μL 和 1000μL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至 10mL 容量瓶，用標(biāo)準(zhǔn)曲線溶劑定容，配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.6穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)的添加

準(zhǔn)確吸取 180μL1.4 制備的樣品溶液或1.5配制的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于 400μL 玻璃內(nèi)插管中，再加入20μL 穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合工作液（濃度分別為0.01、2.00、 0.20μg?mL^-1 ）渦旋混勻，上機(jī)待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

優(yōu)化前后3種真菌毒素的色譜圖見圖1、圖2、圖3，校準(zhǔn)曲線的線性方程與相關(guān)系數(shù)對比見表2。通過對比發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后色譜峰的峰形較好，其中黃曲霉毒素 ΔB₁ 的色譜峰尤其明顯；優(yōu)化后的相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，其中黃曲霉毒素 ΔB₁ 的相關(guān)系數(shù)更是從優(yōu)化前的0.9968762提升到 0.9997206 。

2.2精密度實(shí)驗(yàn)

將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級稀釋成濃度分別為0.25、37.50、 5.00μg?L^-1 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，取 125μL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白玉米基質(zhì)中，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各真菌毒素色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RelativeStandardDeviation，RSD）。由表3可知，優(yōu)化前、后精密度實(shí)驗(yàn)的RSD均小于 10% ，符合實(shí)驗(yàn)要求；但優(yōu)化后的方法在一定程度上降低了RSD值，顯示出更佳的重復(fù)性。

2.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級稀釋至濃度分別為0.25、37.50、 5.00μg?L^-1 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將 2000μL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白玉米樣品中，按1.4方法進(jìn)行樣品處理，所得加標(biāo)回收率見表4。可以看出，優(yōu)化前后3種真菌毒素的加標(biāo)回收率均高于 90% ，符合方法準(zhǔn)確度要求。值得注意的是，方法優(yōu)化后，各真菌毒素的回收率均提高 2% 以上，表明其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性均有所提升，檢測效果更佳。

3結(jié)論

本文對黃曲霉毒素 ΔB₁ 、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮3種真菌毒素的已有測定方法進(jìn)行了優(yōu)化。在保證校準(zhǔn)曲線具有良好線性關(guān)系的基礎(chǔ)上，方法的精密度和準(zhǔn)確度均達(dá)到較高水平。同時(shí)，加標(biāo)回收率提高 2% 以上，表明該優(yōu)化方法在檢測谷物中上述3種真菌毒素方面具有更優(yōu)的適用性和可靠性。

參考文獻(xiàn)

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