關(guān)鍵詞：半夏（Pinelliaternata）；大豆花葉病毒；外殼蛋白；原核表達(dá)；多克隆抗體

中圖分類號(hào)： S432.4⁺1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2025）05-0080-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2025.05.012

Preparation of polyclonal antibody against coat protein of pinellia isolate of soybean mosaic virus

LI Xin-yun， ZHOU Yi，F(xiàn)ANG Shou-guo （Collegeof Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）

Abstract：Toestablish arapid detection methodforsoybean mosaic virus（SMV），the primary pathogencausing mosaic disease in Pi neliaternata，thecoatproteingeneofSMVwasamplifiedbyreversetranscription-polymerasechainreaction（RT-PCR），anditsro karyoticexpressionvectorwasconstructed.Thepurifiedfusion-expressd proteinwasusedasanantigen toimmuizerabbitsforthe preparation of polyclonal antibodies.The results showed that the prepared antiserum exhibited a titer of 1：102，400 as determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），a Western blot detection limit of 300ng for the antigen，and demonstrated strong specificity.

Key words：Pinellia ternata；soybean mosaic virus；coat protein；prokaryotic expression；polyclonal antibody

半夏（Pinelliaternata）為天南星科植物，以其塊莖入藥，主要有鎮(zhèn)咳止痰、鎮(zhèn)靜安眠等作用，并且其在對(duì)抗新型冠狀病毒肺炎中發(fā)揮了一定作用[2]。半夏廣泛分布于中國(guó)長(zhǎng)江流域以及東北、華北等地區(qū)，以省的荊半夏最為地道，《全國(guó)道地藥材生產(chǎn)基地建設(shè)規(guī)劃（2018—2025年）》更是在華中地區(qū)藥材產(chǎn)區(qū)要求大力發(fā)展荊半夏[3]。由于人們用藥的需求量不斷增加以及除草劑等農(nóng)藥對(duì)半夏生長(zhǎng)環(huán)境的影響，使得半夏需求量的增加與野外資源的減少之間的矛盾愈發(fā)突出[4]。半夏主要采用人工種植的方式，依靠無(wú)性繁殖[5，但是半夏感染病毒后其產(chǎn)量會(huì)大幅下降，且在無(wú)性繁殖過(guò)程中病毒會(huì)不斷積累[6]。研究發(fā)現(xiàn)感染半夏的病毒主要是大豆花葉病毒和黃瓜花葉病毒]。

大豆花葉病毒（Soybeanmosaicvirus，SMV）是馬鈴薯Y病毒屬成員，其主要寄主為大豆[8]。有研究者首次發(fā)現(xiàn)大豆花葉病毒能自然侵染半夏9]SMV的外殼蛋白（Coatprotein，CP）比較保守，且是該病毒惟一的結(jié)構(gòu)蛋白[10]。為有效降低SMV侵染半夏帶來(lái)的危害，急需可以快速、高效檢測(cè)病毒的技術(shù)。目前檢測(cè)病毒的方法有PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Polymerasechainreaction）法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[]。ELISA操作較為簡(jiǎn)單，可以快速、高效地對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體制備抗原，這一方式能夠有效提高抗原的濃度和純度，進(jìn)而使制備的抗體具有更高的效價(jià)和更強(qiáng)的特異性。本研究針對(duì)SMV外殼蛋白制備多克隆抗體，以期為SMV的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)和CP蛋白功能的進(jìn)一步研究提供一定的基礎(chǔ)

1 材料與方法

1.1材料

半夏植株采自省潛江市半夏種植基地;pET-28a、大腸桿菌BL21和馬鈴薯Y病毒的外殼蛋白（PVY-CP）均為本實(shí)驗(yàn)室保存;Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit）PrimeSTARMaxPremix（ 2× ）、T4DNALigase、BamHI、SalI均購(gòu)自Takara公司；IPTG（異丙基 -β -D-硫代半乳糖昔）購(gòu)自Biosharp公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自O(shè)megaBIO-TEK公司;雄性日式大耳兔購(gòu)自省荊州市動(dòng)物研究中心；ECL顯色液購(gòu)自普美生物有限公司；PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）購(gòu)自Millipore公司;ProteinMarker、HRP標(biāo)記的羊抗兔購(gòu)自ABclonal公司。

1.2 方法

1.2.1大豆花葉病毒半夏分離物外殼蛋白原核表達(dá)載體pET-28a-CP的構(gòu)建根據(jù)NCBI中SMV外殼蛋白（CP）基因序列設(shè)計(jì)特異性引物， -CGGGATCCTCAGGGAAGGAGACAGGC- ?3^′ ： R：5^′ -AC-GCGTCGACTTACTGTGGTGGGCCCATCCCC -3^′ （下劃線為BamHI和 SalI 酶切位點(diǎn)），由深圳華大基因科技有限公司合成。采用Trizol法提取半夏感病葉片中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)按照說(shuō)明書操作（其中將隨機(jī)引物替換為R引物），PCR反應(yīng)使用PrimeSTARMaxPremix（ 2× ，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。擴(kuò)增產(chǎn)物用 BamHI/SalI 酶切后，經(jīng)凝膠電泳后切膠回收酶切片段。用T4DNA連接酶將酶切片段克隆人質(zhì)粒 pE-28a（+） 的 BamHI/SalI 酶切位點(diǎn)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，再挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，將序列正確的質(zhì)粒命名為pET-28a-CP。

1.2.2pET-28a-CP的原核表達(dá)及可溶性分析將pET-28a-CP菌液按 1：100 比例加入 100mL 含卡那霉素的液態(tài)LB培養(yǎng)基中， 37°200r/min 培養(yǎng)3h 左右，直至 OD_600nm 為0.6＼～0.8，然后加入終濃度為0.2mmol/L 的IPTG，于 25c200r/min 過(guò)夜培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)后 6000r/min 離心 5min ，收集菌體。向細(xì)菌沉淀中加人 10mL 細(xì)胞裂解液，混勻后冰浴，再用超聲細(xì)胞破碎儀處理 10min ，取 1mL 破碎樣品于6000r/min 離心 5min 后，收集上清液和沉淀。在上清液和沉淀中分別加入 1×PBS 緩沖液（磷酸緩沖鹽溶液）重懸菌體，之后再加入 5× 蛋白上樣緩沖液，沸水中煮 10min ，于 12 000r/min 離心 5min ，收集樣品。將樣品進(jìn)行 12% SDS-PAGE電泳后，用考馬斯亮藍(lán)染色，以此檢測(cè)蛋白表達(dá)量并判斷蛋白的可溶性。1.2.3pET-28a-CP融合蛋白的純化將破碎后的菌體沉淀用BindingBuffer（ 8mol/L 尿素、 .100mmol/L Na₂HPO₄?100mmol/LTris 重懸后用 0.22μm 的無(wú)菌濾膜過(guò)濾，濾液通過(guò)Ni-NTA柱純化重組蛋白。對(duì)純化的蛋白進(jìn)行透析復(fù)性后經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)處理得到粉末狀的蛋白，收集后置于 -80^°C 保存。

1.2.4多克隆抗體制備及效價(jià)分析用純化的融合蛋白 （2μg） 作為抗原溶于PBS，與弗氏完全佐劑1：1（體積比）混合，充分乳化后皮下多點(diǎn)注射雄性日式大耳兔，經(jīng)過(guò)4次免疫后，采血收集抗血清。采用間接ELISA對(duì)抗血清進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。

1.2.5多克隆抗體的靈敏度和特異性檢測(cè)將 1mg 蛋白粉溶于 1mL PBS，倍比稀釋（體積比），分別取10μL 樣品，以 1：5000 （體積比）的抗血清為一抗，通過(guò)Westernblot方法檢測(cè)抗血清的靈敏度。分別取 1mg 感病和健康半夏葉片，研磨后加人 1mL 加樣緩沖液，煮沸 15min 后冰浴 5min ，離心后取上清液;分別取 20μg 純化的SMV-和PVY-CP，以1：5000的抗血清為一抗，采用Westernblot方法檢測(cè)抗血清的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1SMV半夏分離物CP基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建及序列分析

提取感病半夏葉片的總RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增SMV-CP基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) BamHI/SalI 酶切后，將膠回收的酶切片段克隆入 pET-28a（+） 質(zhì)粒的BamHI/SalI 酶切位點(diǎn)，構(gòu)建SMV-CP的原核表達(dá)載體 pET-28a-CP ，并對(duì)其進(jìn)行雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證（圖1），顯示載體構(gòu)建成功。序列分析顯示，SMV-CP基因由846個(gè)核苷酸組成，推測(cè)編碼一個(gè)由282個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量約為 31.5kDa 的蛋白。

2.2 SMV-CP的原核表達(dá)

pET-28a-CP轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌株BL21后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白大小為 ，符合預(yù)期（預(yù)測(cè)的融合蛋白約為 36kDa （圖2）。

2.3pET-28a-CP融合蛋白的可溶性分析及純化

對(duì)融合蛋白進(jìn)行可溶性分析，發(fā)現(xiàn)融合蛋白主

A.SMV半夏分離物CP基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè);B.pET-28a-CP的BamHI/SalI酶切產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)； 泳道1-3.陽(yáng)性克隆;泳道4.pET-28a （+） ;M.蛋白Marker

要以包涵體的形式存在（圖3）。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)蛋白條帶單一（圖3）。之后進(jìn)行透析、真空冷凍干燥得到蛋白粉，置于 -80^°C 保存。

M.蛋白Marker;1.BL21;2.BL21+IPTG;3.pET-28a;4.pET-28a+IPTG; 5.pET-28a-CP;6.pET-28a-CP+IPTG

M.蛋白Marker；1.上清液；2.沉淀；3.純化蛋白

2.4多克隆抗體的制備與效價(jià)分析

將純化的蛋白作為抗原，對(duì)日式大耳兔進(jìn)行免疫，采血后獲取多克隆抗體。隨后，以該多克隆抗體作為一抗，開展ELISA效價(jià)檢測(cè)。根據(jù)陽(yáng)性血清與

陰性血清在 OD_450nm 波長(zhǎng)下的吸光度比值，當(dāng)該比值大于或等于2.0時(shí)，可判定為陽(yáng)性結(jié)果。分析結(jié)果（圖4）表明，多克隆抗體的效價(jià)為 1：102 400 。

2.5 多克隆抗體靈敏度和特異性檢測(cè)

以 1mg/mL 的純化蛋白作為起始濃度，按照1：2進(jìn)行倍比稀釋，每個(gè)樣品分別取 10μL 進(jìn)行Westernblot檢測(cè)。結(jié)果（圖5）顯示，多克隆抗體最低可以檢測(cè)到 300ng 的抗原。分別提取健康半夏和感病半夏葉片的總蛋白，采用Westernblot方法檢測(cè)。結(jié)果表明，在健康葉片中沒有信號(hào)，而在 10μg/mL 感病葉片中仍可檢測(cè)到正確條帶且背景干凈（圖6A）。而抗血清不與純化的PVY-CP發(fā)生特異性反應(yīng)（圖6B），說(shuō)明制備的多克隆抗體具有較好的特異性。

3 討論

半夏具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值[，而半夏被病毒侵染后，其產(chǎn)量與品質(zhì)大幅下降，無(wú)法滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)半夏的需求，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。病毒的快速檢測(cè)是防控病毒病的關(guān)鍵措施，為建立半夏中大豆花葉病毒的快速檢測(cè)方法，通過(guò)構(gòu)建大豆花葉病毒半夏分離株的病毒外殼蛋白基因的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)人大腸桿菌BL21后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白，用重組蛋白作為抗原制備多克隆抗體進(jìn)行病毒檢測(cè)對(duì)后期的防治至關(guān)重要。本研究制備的多克隆抗體效價(jià)高達(dá)1：102400（圖2），且靈敏度高，特異性強(qiáng)（圖5、圖6），可用于建立ELISA檢測(cè)體系，快速、高效地檢測(cè)半夏繁殖材料的帶毒情況。本試驗(yàn)結(jié)果將為半夏繁殖材料中SMV的檢測(cè)提供方法和技術(shù)，也為SMV的早期防控提供理論支持。

參考文獻(xiàn)：

[1]朱曉春，夏振江，沈慶紅，等.半夏炮制方法及其現(xiàn)代研究進(jìn) 展［J].上海中醫(yī)藥雜志，2023，57（7）：81-87.

[2]LUO WK，DINGRQ，GUO XH，et al. Clinical data mining reveals Gancao-Banxia as a potential herbal pair against moderate COVID