摘""要：異淀粉酶（isoamylase，ISA）催化α-1，6連接鍵水解，影響淀粉的分支結(jié)構(gòu)，促進(jìn)結(jié)晶化和顆粒形成。為了挖掘協(xié)同MeISA2影響木薯淀粉積累的新蛋白，本研究利用酵母雙雜交篩選MeISA2的互作蛋白。本研究構(gòu)建了pGBKT7-MeISA2誘餌蛋白載體，證明MeISA2不具有自激活活性，且對(duì)酵母細(xì)胞無毒害作用。通過酵母雙雜交篩選cDNA文庫，共獲得7個(gè)候選互作蛋白。通過點(diǎn)對(duì)點(diǎn)酵母雙雜交回轉(zhuǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了MeISA2與MePsbO1存在互作關(guān)系。MePsbO1屬于光系統(tǒng)II產(chǎn)氧增強(qiáng)蛋白（photosystem"II"oxygen-evolving"enhancer"protein，PsbO），該類蛋白可促進(jìn)光合作用電子傳遞過程的高效運(yùn)行。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MePsbO1與同屬大戟科的橡膠樹HbPsbO1的親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到90.12%，而與擬南芥AtPsbO1的相似性僅為77.71%。預(yù)測(cè)MePsbO1定位于葉綠體，且MePsbO1基因主要在葉片中表達(dá)。植物ISA參與葉片臨時(shí)性淀粉的合成，因此推測(cè)MePsbO1和MeISA2可能通過互作協(xié)同調(diào)控光合作用速率以及葉片臨時(shí)性淀粉的積累。本研究結(jié)果為MeISA2基因參與木薯源器官的光合產(chǎn)物積累和分配機(jī)制研究提供新線索。

關(guān)鍵詞：木薯；MeISA2；酵母雙雜交；MePsbO1中圖分類號(hào)：S533"""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Screening"of"Interacting"Proteins"of"Cassava"Isoamylase"MeISA2

GE"Yujian1，2，3，"FU"Dongqing1，2，3，"WANG"Xiangwen1，2，3，"SHEN"Chen2，3，4，"LI"Yuheng1，2，"YAO"Yuan2，3，"GENG"Mengting1，"LU"Xiaohua2，3*，"WANG"Yajie2，3*

1."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"2."Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Institute"for"Tropical"Agricultural"Resources"/"Key"Laboratory"for"Biology"and"Genetic"Resources"of"Tropical"Crops"of"Hainan"Province，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Sanya，"Hainan"572000，"China;"4."College"of"Plant"Science"and"Technology，"Huazhong"Agricultural"University，"Wuhan，"Hubei"430070，"China

Abstract："Isoamylase"（Isoamylase，"ISA）"catalyzes"the"hydrolysis"of"α-1，6"linkages，"thereby"affecting"the"branching"structure"of"starch"and"promoting"crystallization"and"granule"formation."The"study"utilized"yeast"two-hybrid"screening"to"identify"proteins"interacting"with"MeISA2"to"explore"new"proteins"that"may"interact"with"MeISA2"to"influence"cassava"starch"accumulation."A"bait"protein"vector"pGBKT7-MeISA2"was"constructed，"and"it"was"demonstrated"that"MeISA2"did"not"possess"autoactivation"activity"and"was"non-toxic"to"yeast"cells."Through"yeast"two-hybrid"screening"of"a"cDNA"library，"a"total"of"7"candidate"interacting"proteins"were"obtained."Point-to-point"yeast"two-hybrid"re-validation"experiments"confirmed"the"interaction"between"MeISA2"and"MePsbO1."MePsbO1"belongs"to"the"Photosystem"II"oxygen-evolving"enhancer"protein"（PsbO）"family，"which"facilitates"the"efficient"operation"of"the"photosynthetic"electron"transfer"process."Bioinformatics"analysis"revealed"that"MePsbO1"had"the"closest"phylogenetic"relationship"with"HbPsbO1"from"Hevea"brasiliensis，"a"member"of"the"Euphorbiaceae"family，"with"a"similarity"of"90.12%，"while"its"similarity"to"Arabidopsis"thaliana"AtPsbO1"was"only"77.71%."It"is"predicted"that"MePsbO1"is"localized"in"the"chloroplast，"and"the"MePsbO1"gene"is"predominantly"expressed"in"leaves."Plant"ISA"is"involved"in"the"synthesis"of"transient"leaf"starch，"thus"it"is"hypothesized"that"MePsbO1"and"MeISA2"may"interact"to"jointly"regulate"the"rate"of"photosynthesis"and"the"accumulation"of"transient"leaf"starch."The"results"study"would"provide"new"insights"into"the"mechanism"by"which"the"MeISA2"gene"participates"in"the"accumulation"and"distribution"of"photosynthetic"products"in"cassava"source"organs.

Keywords："cassava;"MeISA2;"yeast"two-hybrid;"MePsbO1

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.005

木薯（Manihot"esculenta"Crantz）是大戟科雙子葉植物，廣泛種植于非洲、美洲、亞洲等熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。木薯的主要營養(yǎng)器官是塊根，淀粉是塊根的主要成分，同時(shí)也是木薯生長(zhǎng)發(fā)育主要的營養(yǎng)來源[2]。木薯有耐貧瘠、抗旱和高產(chǎn)等種植特性，其塊根中的淀粉是理想的工業(yè)原料，且是全球10億人口的主要糧食作物[3]。木薯淀粉常用作增稠劑、穩(wěn)定劑和凝膠劑，適用于糕點(diǎn)、面包和無麩質(zhì)食品。紡織與造紙工業(yè)中，木薯淀粉用于提高纖維的強(qiáng)度和抗磨損能力，改進(jìn)紙張的表面光滑度和強(qiáng)度。

淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，木薯塊根中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量比例對(duì)木薯淀粉的品質(zhì)和食用口感具有重要影響[4]。淀粉脫支酶（debranching"enzyme，DBE）、可溶性淀粉合成酶（starch"synthases，SS）和淀粉分支酶（starch-"branching"enzymes，SBE）對(duì)支鏈淀粉的合成具有催化作用[5]。可溶性淀粉合成酶主要由可溶性淀粉合成酶Ⅰ（SSⅠ）、可溶性淀粉合成酶Ⅱ（SSⅡ-1、SSⅡ-2）、可溶性淀粉合成酶Ⅲ（SSⅢ-1、SSⅢ-2）、可溶性淀粉合成酶Ⅳ（SSⅣ）和可溶性淀粉合成酶Ⅴ（SSⅤ）組成，在生物淀粉合成中的支鏈淀粉合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，SS活性影響淀粉顆粒形態(tài)、結(jié)構(gòu)和理化特性；淀粉分支酶具有SBEⅠ、SBEⅡ和SBEⅢ三種類型，在淀粉生物合成中催化外部和內(nèi)部的α-1，6鍵轉(zhuǎn)化成α-1，4-線性葡聚糖，也是唯一作用于葡聚糖并通過α-1，6-糖苷鍵連接產(chǎn)生分支的酶[6]。淀粉脫支酶包括異淀粉酶（isoamylase，ISA）和普魯蘭酶（pullulanase），ISA在植物淀粉結(jié)構(gòu)的合成和數(shù)量上具有重要的作用，影響木薯支鏈淀粉和直鏈淀粉的比例[7]。

ISA專門催化支鏈淀粉、β-極限糊精和糖原中α-1，6連接鍵的水解，但無法水解普魯蘭[8]。植物有3種異淀粉酶亞型（ISA1、ISA2和ISA3），其中ISA1和ISA2在植物淀粉合成中具有重要影響。目前，在水稻、大麥、馬鈴薯、玉米作物中均被證明當(dāng)ISA基因缺失時(shí)，均會(huì)影響其淀粉顆粒的形成[9-11]。ISA1和ISA2負(fù)責(zé)去除支鏈淀粉合成中產(chǎn)生的支鏈，而ISA3則專門降解支鏈淀粉中的支鏈α-葡聚糖[12]。ISA1既能與自身形成同源復(fù)合物，又能與ISA2結(jié)合形成異源復(fù)合物，在異源復(fù)合物中ISA1起催化作用，ISA2由于其活性位點(diǎn)失去了所有3個(gè)催化殘基而成為非催化蛋白，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[13]。異淀粉酶處理木薯淀粉，可水解淀粉中的1，6-α-D-糖苷鍵，降解支鏈淀粉并釋放線性短鏈糖，這導(dǎo)致直鏈淀粉比率提高，同時(shí)生成更多的還原糖[14]。PANPETCH等[15]克隆了KU50木薯品種的MeISA1和MeISA2基因，原核表達(dá)其重組蛋白，證明MeISA1和MeISA2蛋白同時(shí)存在時(shí)才能具有出脫分支酶活性，并分析了其酶學(xué)特性。本研究克隆了我國木薯主栽品種SC8的MeISA2基因，通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選MeISA2的互作蛋白，以期為深入探討MeISA2在淀粉合成過程中的功能提供新的信息。

1""材料與方法

1.1""材料

植物材料為華南8號(hào)木薯（SC8）。酵母感受態(tài)AH109和大腸感受態(tài)DH5α均購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒"（MonSCRIPTTM"RTⅢ"All-in-One-Mix"With"dsDNase）和qRT-PCR試劑盒（ChemoHS"qPCR"Mix）購自武漢莫納公司；酵母雙雜交載體pGADT7、pGADT7-T、pGBKT7、pGBKT7-p53均由本實(shí)驗(yàn)室保存。；Prime STAR"HS（Premix）DNA"PolyMeras酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒和純化試劑盒購自O(shè)MEGA生物試劑公司；RNA提取試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司；X-α-gal酵母顯色底物購自北京索萊寶科技有限公司；酵母缺陷培養(yǎng)基和2×Rapid"Tap"MasterMix酶分別購自clontech公司和南京諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ購自賽默飛世爾科技公司。

1.2""方法

1.2.1""誘餌載體pGBKT7-MeISA2構(gòu)建及檢測(cè)""根據(jù)木薯基因組數(shù)據(jù)庫信息，設(shè)計(jì)MeISA2基因克隆引物（表1），以SC8木薯cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過1%凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化備用。將純化的MeISA2片段與酶切純化pGBKT7空載體（酶切位點(diǎn)EcoR"Ⅰ和BamH"Ⅰ）進(jìn)行同源重組。將同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌中，利用pGBKT7通用檢測(cè)引物（表1）進(jìn)行菌液PCR鑒定，篩選陽性菌液進(jìn)行Sanger測(cè)序，提取測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確的菌液中的重組質(zhì)粒，于–20"℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2""pGBKT7-MeISA2誘餌蛋白的毒性檢測(cè)""將pGBKT7空載和pGBKT7-MeISA2重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到AH109酵母感受態(tài)，涂布于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30"℃倒置培養(yǎng)2～3"d。挑取菌斑至含有2×Rapid"Master"Mix的PCR管中，使用BD檢測(cè)引物進(jìn)行菌斑PCR鑒定，篩選酵母陽性菌株。將篩選出的陽性pGBKT7空載酵母菌株和pGBKT7-MeISA2酵母菌株分別接種到SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30"℃培養(yǎng)至OD600=0.6。將酵母菌液按照1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10"000稀釋后，分別吸取5"μL點(diǎn)板于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30"℃倒置培養(yǎng)2～"3"d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.3""pGBKT7-MeISA2誘餌蛋白的自激活檢驗(yàn)""將pGADT7空載和pGBKT7-MeISA2重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到AH109酵母感受中，均勻涂布于SD/-Trp-Leu固體培養(yǎng)基上，30"℃培養(yǎng)2～3"d，挑取單菌落分別使用AD檢測(cè)-F/R、BD檢測(cè)-F/R進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選陽性菌株。將篩選的陽性菌株接種到SD/-Trp-Leu液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，分別吸取菌液5"μL點(diǎn)到SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal固體培養(yǎng)基上，將本實(shí)驗(yàn)室保存的pGBKT7-p53+pGADT7-T（陽性對(duì)照）和pGBKT7-lam+pGADT7-T（陰性對(duì)照）點(diǎn)板在上述固體培養(yǎng)基上，30"℃培養(yǎng)2～3"d，觀察酵母菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.4""MeISA2互作蛋白篩選""將30"μg"SC8木薯cDNA文庫質(zhì)粒與pGBKT7-MeISA2重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到AH109酵母感受態(tài)，并涂布于SD/-Trp-Leu-"His固體培養(yǎng)基，30"℃倒置培養(yǎng)2～3"d。挑取酵母菌斑在20"μL"0.9%"NaCl溶液中吸打混勻，吸取5"μL點(diǎn)板于SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)2～3"d，觀察酵母菌斑生長(zhǎng)情況。挑取培養(yǎng)基上變藍(lán)的菌斑，使用AD檢測(cè)-F/R進(jìn)行PCR檢測(cè)，Sanger測(cè)序，獲得候選互作蛋白信息。

1.2.5""候選互作蛋白的酵母雙雜交回轉(zhuǎn)驗(yàn)證""根據(jù)候選互作蛋白信息搜索木薯基因庫數(shù)據(jù)，獲得候選蛋白的CDS序列。設(shè)計(jì)帶有同源重組接頭的特異性引物（表1），以SC8木薯cDNA為模板擴(kuò)增候選蛋白基因編碼區(qū)。通過同源重組技術(shù)將候選互作蛋白克隆到pGADT7空載載體上。將pGBKT7-MeISA2誘餌蛋白載體與含有候選蛋白基因的pGADT7載體分別共轉(zhuǎn)到AH109酵母感受態(tài)，并點(diǎn)板到SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-"Ade、SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal固體培養(yǎng)基上，30"℃倒置培養(yǎng)2～3"d，觀察酵母生長(zhǎng)情況。

1.2.6""MePsbO1基因在木薯各組織的表達(dá)分析""利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)完成的SC8木薯的體胚、愈傷、韌皮部、木質(zhì)部、須根、莖、嫩葉、成熟葉的轉(zhuǎn)錄組信息分析互作蛋白基因在木薯各組織或器官的表達(dá)情況。

2""結(jié)果與分析

2.1""pGBKT7-MeISA2誘餌蛋白載體的構(gòu)建

以SC8木薯的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增MeISA2基因的CDS區(qū)，凝膠電泳檢測(cè)顯示獲得約2600"bp的條帶，且條帶明亮單一（圖1），符合預(yù)期的MeISA2基因長(zhǎng)度（2652"bp）。純化PCR產(chǎn)物，通過同源重組技術(shù)將MeISA2基因克隆到pGBKT7載體上。PCR篩選陽性菌落，測(cè)序，提取序列比對(duì)正確的pGBKT7-MeISA2誘餌載體質(zhì)粒備用。

2.2""MeISA2誘餌蛋白的毒性檢測(cè)

將構(gòu)建成功的pGBKT7-MeISA2誘餌載體與pGBKT7空載分別轉(zhuǎn)到AH109酵母感受態(tài)中，PCR鑒定陽性菌株。梯度稀釋后點(diǎn)板于SD/-Trp固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)果顯示，含有pGBKT7-"MeISA2和pGBKT7的酵母菌株生長(zhǎng)情況類似（圖2），表明pGBKT7-MeISA2表達(dá)蛋白不具有毒性，酵母菌株能正常生長(zhǎng)。

2.3""MeISA2誘餌蛋白的自激活檢測(cè)

為了驗(yàn)證誘餌蛋白MeISA2是否具有自激活能力，將pGBKT7-MeISA2誘餌載體與pGADT7空載共轉(zhuǎn)AH109酵母菌株進(jìn)行自激活檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，pGBKT7-p53+pGADT7-T（陽性對(duì)照）和pGBKT7-lam+pGADT7-T（陰性對(duì)照）酵母菌株和陽性菌株均能在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)；而在SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-"Leu-His-Ade+X-α-gal培養(yǎng)基上只有陽性對(duì)照酵母菌株能正常生長(zhǎng)，且在SD/-Trp-Leu-His-Ade+"X-α-gal培養(yǎng)基上變藍(lán)；含有pGBKT7-MeISA2質(zhì)粒的菌株和陰性對(duì)照菌株均不能生長(zhǎng)（圖3）。此結(jié)果表明MeISA2誘餌蛋白無自激活能力。

2.4""MeISA2互作蛋白篩選

使用實(shí)驗(yàn)室保存的SC8"cDNA文庫質(zhì)粒篩選MeISA2的互作蛋白，在SD/-Trp-Leu-His-Ade+"X-α-gal培養(yǎng)基上共獲得7個(gè)變藍(lán)的酵母菌斑，表明7個(gè)變藍(lán)的酵母菌斑所表達(dá)的蛋白可能與MeISA2蛋白存在互作關(guān)系。對(duì)變藍(lán)菌斑進(jìn)行PCR檢測(cè)并進(jìn)行Sanger測(cè)序，通過NCBI網(wǎng)站序列比對(duì)共獲得7個(gè)候選蛋白信息（表2）。

2.5""MeISA2與候選蛋白點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證候選蛋白是否與MeISA2蛋白存在互作關(guān)系，將上述7個(gè)含有候選蛋白基因的pGADT7載體分別與pGBKT7-MeISA2誘餌載體共轉(zhuǎn)到AH109酵母菌株。將酵母菌株點(diǎn)到SD/-"Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-Leu-His-"Ade+X-α-gal固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結(jié)果顯示，所有酵母菌株均能在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而含pGBKT7-MeISA2誘餌載體、pGADT7-MePsbO1載體的酵母菌和pGBKT7-p53+pGADT7-T（陽性對(duì)照）在SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-Leu-His-"Ade+X-α-gal固體培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，且在SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-α-gal固體培養(yǎng)基上變藍(lán)（圖4）。此結(jié)果表明MePsbO1與MeISA2存在互作關(guān)系。

2.6""MePsbO1基因的生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，MePsbO1基因開放閱讀框長(zhǎng)度為1005"bp，由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成（圖5），編碼334個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為35"397.84"Da。其中，亮氨酸丙氨酸（Ala）和蘇氨酸（Thr）的數(shù)量最多，均為33個(gè)氨基酸，"占總量的9.3%；色氨酸（Trp）的含量最低，只有1個(gè)，僅占0.3%。有38個(gè)帶負(fù)電荷的Asp和Glu殘基，以及36個(gè)帶正電荷的Arg和Lys殘基，理論等電點(diǎn)（pI）為5.57，表明MePsbO1是一種酸性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)MePsbO1定位于葉綠體。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，MePsbO1與橡膠樹的HbPsbO1親緣關(guān)系最近，與擬南芥AtPsbO1的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖6）。蛋白的多序列結(jié)果比對(duì)顯示，MePsbO1和HbPsbO1的相似性為90.12%，與AtPsbO1的相似性僅為77.71%（圖7）。

2.7""MePsbO1基因在木薯組織器官的表達(dá)分析

分析SC8木薯品種各組織器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探究MePsbO1基因表達(dá)的模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MePsbO1基因在木薯嫩葉中的表達(dá)量最高，其次是成熟葉，在莖中也具有較高的表達(dá)量，但是在體胚、愈傷、塊根韌皮部、塊根木質(zhì)部、須根中的表達(dá)量極低（圖8）。此表達(dá)模式符合植物PsbO1基因參與葉片光合作用的功能特征。

3""討論

異淀粉酶參與淀粉顆粒的形成和降解[16]。在馬鈴薯的研究中發(fā)現(xiàn)，ISA1和ISA2結(jié)合形成異二聚酶參與淀粉的合成[17]。ISA1和ISA2除了能結(jié)合形成異多聚體，ISA1還能形成有活性的同源多聚酶復(fù)合物[13]，ISA2則是非催化亞基，多種植物證明ISA2蛋白活性位點(diǎn)有氨基酸的替換[11]。研究發(fā)現(xiàn)ISA3與ISA1、ISA2形成的多聚體未存在密切關(guān)聯(lián)，認(rèn)為ISA3是以單體或與其他蛋白結(jié)合發(fā)揮作用[17]。與野生型相比，擬南芥AtISA1、AtISA2和雙突變體淀粉含量的積累減少，但可溶性葡萄糖增加[18]。單子葉植物玉米中發(fā)現(xiàn)在ISA1和ISA2突變體中，ISA1突變導(dǎo)致支鏈淀粉的合成產(chǎn)生了顯著變化，而在ISA2突變體對(duì)支鏈淀粉的合成影響不大[19]。由此推測(cè)ISA1和ISA2是雙子葉植物中ISA活性所需要的，但在單子植物中，ISA2不是ISA活性所必需的。

植物光系統(tǒng)II（PSII）的外周蛋白是與PSII膜內(nèi)核心復(fù)合體相連的蛋白質(zhì)，主要位于類囊體腔的一側(cè)，在氧氣進(jìn)化復(fù)合物（oxygen"evolving"complex，"OEC）的功能和PSII的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，主要的外周蛋白包括PsbO、PsbP、PsbQ，其中PsbO是33"kDa錳穩(wěn)定蛋白（manganese-"stabilizing"protein，"MSP），是PSII中最主要的外周蛋白[20]。PsbO在光系統(tǒng)Ⅱ捕捉并利用光能將水分子分解成氧氣、質(zhì)子和電子的過程中起輔助和強(qiáng)化作用，促進(jìn)光合作用電子傳遞過程的高效運(yùn)行[21]。PsbO還具有多種輔助功能，包括鈣結(jié)合、錳穩(wěn)定結(jié)合，以及與GTP結(jié)合相關(guān)的PSII反應(yīng)中心D1亞基的GTP依賴性降解，PsbO可結(jié)合GTP，并催化GTP水解[22]。擬南芥存在2種PsbO蛋白：AtPsbO1和AtPsbO2[23]。AtPsbO1缺失突變體（psbo1）的光系統(tǒng)Ⅱ功能受損，表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩、葉片淺綠、對(duì)光失活更敏感以及D1蛋白周轉(zhuǎn)速率加快[24]。

本研究通過酵母雙雜交篩選獲得MeISA2的互作蛋白MePsbO1，該蛋白與同屬大戟科的橡膠樹HbPsbO1的親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到90.12%，而與擬南芥AtPsbO1的相似性僅為77.71%。預(yù)測(cè)MePsbO1定位于葉綠體，且MePsbO1基因主要在葉片中表達(dá)，推測(cè)該基因在木薯光合作用中具有重要作用。葉綠體是臨時(shí)性淀粉合成的主要場(chǎng)所，光合作用固定的碳水化合物可以淀粉的形式貯存在葉綠體中[25]。ISA在植物葉片臨時(shí)性淀粉的合成中起到關(guān)鍵作用，通過調(diào)節(jié)淀粉的分支結(jié)構(gòu)，促進(jìn)結(jié)晶化和顆粒形成[26]。因此推測(cè)，MePsbO和MeISA2可能通過互作協(xié)同調(diào)控光合作用速率以及葉片臨時(shí)性淀粉的積累，影響木薯源器官的光合產(chǎn)物積累和分配。本課題組在后續(xù)研究中將通過雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)、熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究MePsbO1和MeISA2的互作機(jī)理，采用過表達(dá)和基因編輯明確它們?cè)谀臼砼R時(shí)性淀粉合成過程的關(guān)系及作用。

參考文獻(xiàn)

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