摘""要：硫氧還蛋白通過催化硫醇-二硫鍵交換反應(yīng)調(diào)節(jié)靶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。前期研究證實(shí)橡膠樹y型硫氧還蛋白HbTRXy2具有很強(qiáng)的抗氧化功能。為探究HbTRXy2調(diào)控抗氧化性的分子機(jī)制，本研究構(gòu)建橡膠樹酵母雙雜交文庫(kù)及HbTRXy2誘餌載體pGBKT7-HbTRXy2，并通過酵母雙雜交篩選與HbTRXy2互作的蛋白。結(jié)果顯示：本研究構(gòu)建的次級(jí)文庫(kù)重組率為100%，插入片段平均長(zhǎng)度大于1000"bp，庫(kù)容量為3.80×"106"CFU/mL；經(jīng)檢測(cè)，誘餌載體pGBKT7-HbTRXy2在酵母中無毒性和自激活活性，可用于酵母雙雜交篩選；采用共轉(zhuǎn)化法從構(gòu)建的文庫(kù)中篩選到與HbTRXy2互作的蛋白24個(gè)。生物信息學(xué)分析表明，這些候選互作蛋白的功能涉及氧化還原、逆境脅迫響應(yīng)、ATP結(jié)合與代謝、卡爾文循環(huán)、單碳代謝、碳固定、蛋氨酸生物合成、脂質(zhì)A生物合成、金屬離子結(jié)合或轉(zhuǎn)運(yùn)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞體積調(diào)控、磷酸根離子穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)折疊等。本研究結(jié)果為深入解析HbTRXy2在橡膠樹中的功能及其作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹；硫氧還蛋白；酵母雙雜交；酵母文庫(kù)構(gòu)建；互作蛋白中圖分類號(hào)：S794.1""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Construction"of"Yeast"Two-Hybrid"Library"of"Hevea"brasiliensis"and"Screening"of"HbTRXy2"Interacting"Proteins

WU"Shuang1，2，"LU"Ruilin1，"HE"Qiguang1，"YUAN"Kun1，"HU"Yiyu1，"WANG"Zhenhui1，"LIU"Jinping2，"LIU"Hui1*

1."Rubber"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Genetic"Resources"of"Rubber"Tree，"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"State"Key"Laboratory"Incubation"Base"for"Cultivation"amp;"Physiology"of"Tropical"Crops，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China

Abstract："Thioredoxins"play"critical"roles"in"the"maintenance"of"cellular"redox"homeostasis"by"regulating"the"structure"and"function"of"the"target"proteins"through"catalyzingnbsp;thiol-disulfide"exchange"reactions."Previous"research"has"confirmed"that"the"y-type"thioredoxin"HbTRXy2"of"rubber"tree"（Hevea"brasiliensis）"has"a"strong"antioxidant"function."To"investigate"the"molecular"mechanism"of"HbTRXy2"in"enhancing"antioxidant"defense，"a"yeast"two-hybrid"library"of"rubber"tree"and"the"bait"vector"pGBKT7-HbTRXy2"for"HbTRXy2"were"constructed，"and"the"interacting"proteins"of"HbTRXy2"were"identified"via"yeast"two-hybrid"in"this"study."The"results"indicated"that"the"secondary"library"constructed"in"this"study"had"a"recombination"rate"of"100%，"an"average"length"of"inserted"fragments"greater"than"1000"bp，"and"a"capacity"of"approximately"3.80×106"CFU/mL."It"was"identified"that"the"bait"vector"has"no"toxicity"and"self-activating"activity"in"yeast"and"could"be"used"for"yeast"two-hybrid"screening."After"testing，"it"was"found"that"the"bait"vector"had"no"toxicity"and"self-activating"activity"in"yeast"and"could"be"used"for"yeast"two-hybrid"screening."Using"the"co-transformation"method，"24"proteins"interacting"with"HbTRXy2"were"screened"from"the"constructed"library."Bioinformatics"analysis"revealed"that"the"functions"of"the"candidate"interacting"proteins"encompassed"redox"processes，"stress"responses，"ATP"binding"and"metabolism，"Calvin"cycle，"single-carbon"metabolism，"carbon"fixation，"methionine"biosynthesis，"lipid"A"biosynthesis，"metal"ion"binding"or"transport，"transmembrane"transport，"cell"volume"regulation，"phosphate"ion"homeostasis，"protein"phosphorylation，"protein"folding，"etc."The"results"would"lay"the"foundation"for"further"revealing"the"function"and"mechanism"of"HbTRXy2"in"rubber"tree.

Keywords："rubber"tree;"thioredoxin;"yeast"two"hybrid;"yeast"library"construction;"interacting"protein

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.001

硫氧還蛋白（thioredoxins，TRXs）是一類多基因家族編碼的低分子量的氧化還原酶，含有高度保守的WC（G/P）PC基序，可通過催化硫醇-二硫鍵交換反應(yīng)調(diào)節(jié)靶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，在維持植物細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1-4]。根據(jù)蛋白氨基酸序列同源性和亞細(xì)胞定位的不同，植物TRXs被劃分為8種類型：h、f、m、o、s、x、y和z[2，"4]。其中，h型TRXs定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等多種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中[3-4]，o型TRXs定位于線粒體或細(xì)胞核中，s型TRXs定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而f、m、x、y和z型TRXs定位于質(zhì)體中。研究表明，質(zhì)體TRXs在葉綠體光合作用和脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，且不同類型的質(zhì)體TRXs行使不同的功能[5-7]。x和y型TRXs具有抗氧化功能，f和m型TRXs主要參與光合碳代謝的調(diào)節(jié)，而z型TRXs的作用似乎僅限于質(zhì)體基因表達(dá)的調(diào)控[3，"8]。

擬南芥含有2個(gè)y型TRXs：AtTRXy1和AtTRXy2[9]。體外生化試驗(yàn)表明，AtTRXy1和AtTRXy2是過氧化物酶Prx"Q、甲硫氨酸亞砜還原酶MSR"B2等抗氧化酶的還原底物[9-10]。AtTRXy1還是質(zhì)體葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PDH1的有效激活劑[11]，AtTRXy2是單脫氫抗壞血酸還原酶MDHAR6的激活劑[1]。在正常條件下，atrxy1和atrxy2突變體及其雙突變體植株生長(zhǎng)發(fā)育與野生型相似，但對(duì)干旱的敏感性增加[1]；強(qiáng)光條件下，atrxy2突變體及atrxy1"atrxy2雙突變體較野生型生長(zhǎng)減緩，葉綠素含量降低[10]。OKEGAWA等[12]研究證實(shí)，y型TRXs通過調(diào)節(jié)光系統(tǒng)I（PSI）受體側(cè)的氧化還原平衡在光合作用中發(fā)揮重要作用。此外，y型TRXs在調(diào)控種子在干旱或氧化脅迫下的發(fā)芽勢(shì)中起著重要作用，但這種功能的行使并不歸因于其抗氧化作用，而是通過調(diào)節(jié)植物激素實(shí)現(xiàn)[13]。

橡膠樹（Hevea"brasiliensis）是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)林木，其產(chǎn)生的膠乳是重要戰(zhàn)略物資和工業(yè)原料天然橡膠的主要來源。劉輝等[14]從橡膠樹中克隆了1個(gè)y型TRX基因HbTRXy2，發(fā)現(xiàn)干旱、低溫、鹽以及氧化脅迫處理均能上調(diào)該基因的表達(dá)，并利用酵母表達(dá)系統(tǒng)證實(shí)HbTRXy2具有很強(qiáng)的抗氧化功能。為解析HbTRXy2調(diào)控抗氧化性的分子機(jī)制，本研究構(gòu)建橡膠樹非生物脅迫誘導(dǎo)的酵母雙雜交文庫(kù)，并通過酵母雙雜交技術(shù)鑒定與HbTRXy2互作的蛋白。研究結(jié)果將為進(jìn)一步揭示HbTRXy2調(diào)控抗氧化性的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

選取健康、一致的橡膠樹熱研7-33-97組培苗（移栽培養(yǎng)約8個(gè)月）進(jìn)行氧化和低溫脅迫處理。氧化脅迫處理采用20"mmol/L的H2O2溶液，處理時(shí)將溶液噴施于植株所有的葉片。低溫處理在4"℃、16"h光照/8"h黑暗的人工氣候箱中進(jìn)行。在處理24"h時(shí)，采集脅迫處理以及未處理植株的葉片。選擇種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)六隊(duì)的熱研7-33-97健康和割面干涸（割面干涸率在70%左右）植株（樹齡16"a），采集膠乳樣品。同時(shí)，選擇健康植株，涂施1.5%乙烯利，并于處理24"h時(shí)采集膠乳樣品。上述葉片和膠乳采集后液氮凍存，用于總RNA提取。

1.2""方法

1.2.1""酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建""（1）總RNA提取和mRNA的分離純化。采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取葉片和膠乳總RNA，具體提取方法參照試劑盒說明書。使用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop"2000超微量分光光度計(jì)（Thermo"Scientific）檢測(cè)RNA的完整性、純度和濃度。采用Oligotex"mRNA"Midi"Kit（Qiagen）分離純化mRNA，并通過凝膠電泳檢測(cè)分離純化mRNA的質(zhì)量。

（2）初級(jí)文庫(kù)構(gòu)建。cDNA第一鏈和第二鏈的合成參照CloneMiner"II"cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（Invitrogen）。將重組接頭連接到cDNA末端，并通過固定分級(jí)柱進(jìn)行分級(jí)分離。參照Invitrogen公司Gateway"BP"Clonase"II"Enzyme"Mix試劑盒說明書，通過BP重組反應(yīng)將分級(jí)分離獲得的cDNA重組至pDONR222載體上。采用電擊轉(zhuǎn)化的方法，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B菌株，獲得初級(jí)文庫(kù)菌。將50"μL"100倍稀釋的初級(jí)文庫(kù)菌涂布于含50"μg/mL卡那霉素的LB平板上，37"℃培養(yǎng)過夜，統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)出的單克隆數(shù)，并計(jì)算初級(jí)文庫(kù)的庫(kù)容量（CFU·mL–1）和總克隆數(shù)（CFU）。隨機(jī)挑取單克隆24個(gè)，采用M13-F（5′-GTAA AACGACGGCCAG-3′）和M13-R（5′-CAGGAA ACAGCTATGAC-3′）引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。PCR采用EasyTaq"DNA"Polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司），具體反應(yīng)體系和程序參照其說明書。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

（3）次級(jí)文庫(kù)構(gòu)建。抽提初級(jí)文庫(kù)和pG ADT7-DEST載體的質(zhì)粒，參照Gateway"LR"Clonase"II"Enzyme"mix試劑盒（Invitrogen）說明書將二者進(jìn)行LR重組，并通過電擊轉(zhuǎn)化法將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B菌株，獲得次級(jí)文庫(kù)菌。將50"μL"100倍稀釋的次級(jí)文庫(kù)菌涂布于含100"μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37"℃培養(yǎng)過夜，統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)出的單克隆數(shù)，并計(jì)算次級(jí)文庫(kù)的庫(kù)容量（CFU/mL）和總克隆數(shù)（CFU）。隨機(jī)挑取單克隆24個(gè)，采用T7-F（5′-TAATA CGACTCACTATAGGGC-3′）AD-R（5′-AGAT GGTGCACGATGCACAG-3′）引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。PCR采用EasyTaq"DNA"Polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司），具體反應(yīng)體系和程序參照其說明書。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。抽提次級(jí)文庫(kù)菌質(zhì)粒，并檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。

1.2.2""HbTRXy2誘餌載體的構(gòu)建、毒性及自激活活性分析""（1）構(gòu)建HbTRXy2誘餌載體。根據(jù)HbTRXy2全長(zhǎng)序列（XM_021825437.1）設(shè)計(jì)基因克隆的引物，并添加Nco"Ⅰ和Sal"Ⅰ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。正向引物HbTRXy2-F：5′-TACCAT GGCTATGGCGATTTCTTCTCTCTCG-3′，反向引物HbTRXy2-R：5′-ACGTCGACACC TCAACTA TTGCTTCACTTGC-3′。以橡膠樹熱研7-33-97葉片cDNA為模板，采用TransStart"FastPfu"DNA"Polymerase（北京全式金生物），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。切膠回收目標(biāo)片段，與pEASY-Blunt"Simple"Cloning"Vector連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)菌落PCR篩選，送3個(gè)陽性單克隆到公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的陽性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，采用Plasmid"Mini"Kit"I（OMEGA）提取質(zhì)粒并進(jìn)行Nco"Ⅰ和Sal"Ⅰ雙酶切，回收目標(biāo)片段。抽提酵母表達(dá)載體pGBKT7質(zhì)粒，Nco"Ⅰ和Sal"Ⅰ雙酶切，回收大片段。采用T4"DNA"Ligase（Thermo"Scientific）將HbTRXy2基因與pGBKT7載體連接，獲得誘餌載體pGBKT 7-HbTRXy2。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，菌落PCR篩選陽性克隆，并抽提其質(zhì)粒。

（2）誘餌載體毒性和自激活檢測(cè)。通過PEG/LiAc法將pGBKT7-HbTRXy2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2HGold，挑選單克隆3個(gè)，參照酵母質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA）說明書提取質(zhì)粒。使用EasyTaq"DNA"Polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行PCR鑒定，引物采用T7-F和HbTRXy2-R。以pGBKT7-HbTRXy2質(zhì)粒作為陽性對(duì)照。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

將實(shí)驗(yàn)室保存的Y2HGold[pGBKT7]（空載體對(duì)照，CK）、Y2HGold[pGBKT7-53+pGADT7-T]（陽性對(duì)照，CK+）、Y2HGold[pGBKT7-Lam+"pGADT7-T]（陰性對(duì)照，CK–）以及Y2HGold"[pGBKT7-HbTRXy2]酵母菌劃線活化。挑單克隆，30"℃，200"r/min培養(yǎng)24"h，分別劃線于SD/-Trp/"X-α-Gal/AbA、SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp平板上。30"℃培養(yǎng)3"d，觀察比較各酵母菌的生長(zhǎng)差異。

1.2.3""HbTRXy2互作蛋白的篩選及功能注釋""Y2H"Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備參照Yeastmaker"Yeast"Transformation"System"2"User"Manual（Clontech）。將10"μg酵母文庫(kù)質(zhì)粒、5"μg"pGBKT7-HbTRXy2質(zhì)粒與20"μL預(yù)變性的Carrier"DNA共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化菌液涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基上，30"℃培養(yǎng)5"d，進(jìn)行初篩。將初篩平板上長(zhǎng)出的約2"mm的單克隆轉(zhuǎn)接至含有SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/"AbA的平板上，30"℃培養(yǎng)5"d，進(jìn)一步進(jìn)行高嚴(yán)謹(jǐn)度篩選。采用Matchmaker"Insert"Check"PCR"Mix"2（Clontech）對(duì)生長(zhǎng)出的藍(lán)色單克隆進(jìn)行酵母菌落PCR，PCR體系和擴(kuò)增程序參照其說明書。取PCR產(chǎn)物5"μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選擴(kuò)增出單一條帶的，將其PCR產(chǎn)物送至海南楠山生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)HeveaDB（http：//hevea.catas.cn/"home/index）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih."gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast分析，獲取互作蛋白基因的ID及功能注釋等信息。

2""結(jié)果與分析

2.1""總RNA的提取及mRNA的分離

提取經(jīng)低溫、H2O2處理和無處理的橡膠樹組培苗葉片以及健康、割面干涸和乙烯利處理橡膠樹膠乳的總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳以及微量分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，結(jié)果顯示，各RNA樣本A260/280值介于1.8～2.1之間，28S、18S和5S"rRNA條帶清晰，無明顯降解（圖1A），質(zhì)量符合建庫(kù)要求。將各RNA等量混合，并進(jìn)一步分離純化mRNA及合成雙鏈cDNA。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，純化得到的mRNA以及合成的雙鏈cDNA條帶清晰，呈彌散狀均勻分布（圖1B，圖1C），質(zhì)量較好，可用于后續(xù)文庫(kù)構(gòu)建。

2.2""酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定

將純化獲得的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，添加重組接頭后，并通過BP反應(yīng)連入pDONR222載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到cDNA初級(jí)文庫(kù)菌液。取50"μL稀釋100倍的文庫(kù)菌液涂板，生長(zhǎng)出的克隆總數(shù)約為2100個(gè)（圖2A），初級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量約為4.20×106"CFU/mL，總克隆數(shù)為1.68×"107"CFU。菌落PCR結(jié)果顯示，24個(gè)隨機(jī)選取的單克隆均擴(kuò)出單一條帶，且片段平均長(zhǎng)度超過1000"bp，重組率達(dá)100%（圖2B），符合初級(jí)文庫(kù)的質(zhì)量要求。

通過電極轉(zhuǎn)化法將初級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒與pGADT7-"DEST載體質(zhì)粒LR反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B，獲得次級(jí)文庫(kù)菌液。取50"μL"100倍稀釋后文庫(kù)菌液涂板，生長(zhǎng)出約1900個(gè)單菌落（圖2C）。經(jīng)計(jì)算，次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量約為3.80×"106"CFU/mL，總克隆數(shù)為1.52×107"CFU。對(duì)24個(gè)隨機(jī)選取的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示，均擴(kuò)增出條帶，重組率達(dá)100%，平均插入片段長(zhǎng)度超過1000"bp（圖2D）。以上結(jié)果表明，所構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量很好，可進(jìn)行酵母雙雜交篩選。

2.3""HbTRXy2誘餌載體構(gòu)建及其毒性和自激活活性檢測(cè)

根據(jù)HbTRXy2基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整編碼區(qū)的引物，從橡膠樹葉片cDNA中擴(kuò)出了符合預(yù)期大小527"bp的條帶（圖3A）。經(jīng)公司測(cè)序確定正確后，通過酶切連接的方法將HbTRXy2基因連接到載體pGBKT7，獲得誘餌載體pGBKT7-"HbTRXy2。將pGBKT7-HbTRXy2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞，挑取3個(gè)單克隆抽提質(zhì)粒并進(jìn)行PCR檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果證實(shí)誘餌載體成功轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（圖3B）。

將含有pGBKT7-HbTRXy2、pGBKT7（空載體對(duì)照）、pGBKT7-Lam+pGADT7-T（陰性對(duì)照）或pGBKT7-53+pGADT7-T（陽性對(duì)照）的Y2H Gold酵母菌分別在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal和SD/-Trp/X-α-gal/AbA平板上劃線培養(yǎng)。結(jié)果（圖4）顯示，4種酵母菌在SD/-Trp平板上均有生長(zhǎng)，

差異不明顯，表明誘餌載體pGBKT7-HbTRXy2對(duì)酵母菌無毒性。在SD/-Trp/X-α-gal平板上，4種酵母菌均能正常生長(zhǎng)，但僅有陽性對(duì)照酵母菌顯藍(lán)色。在SD/-Trp/X-α-gal/AbA平板上，僅有陽性對(duì)照酵母菌生長(zhǎng)且顯藍(lán)色，表明誘餌載體pGBKT7-"HbTRXy2在Y2HGold酵母菌株中無自激活活性，可用于酵母雙雜交篩選。

2.4""HbTRXy2互作蛋白的篩選與分析

通過共轉(zhuǎn)化將誘餌載體pGBKT7-HbTRXy2質(zhì)粒和次級(jí)文庫(kù)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His平板上進(jìn)行初篩（圖5A）。將初篩平板上生長(zhǎng)出的克隆轉(zhuǎn)接到SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/AbA平板上，進(jìn)行高嚴(yán)謹(jǐn)度篩選。52個(gè)克隆在SD/-Trp/-"Leu/-Ade/-His/X-α-gal/AbA平板上生長(zhǎng)，且呈藍(lán)色（圖5B）。采用Matchmaker"Insert"Check"PCR"Mix"2對(duì)陽性克隆進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，回收純化目標(biāo)條帶送公司測(cè)序。經(jīng)序列比對(duì)分析，除去重復(fù)序列后，最終鑒定到24個(gè)與HbTRXy2互作的蛋白（表1）。對(duì)篩選到的互作蛋白進(jìn)行功能注釋發(fā)現(xiàn)，這些蛋白的生物學(xué)功能涉及氧化還原、逆境脅迫響應(yīng)、ATP結(jié)合與代謝、卡爾文循環(huán)、單碳代謝、碳固定、蛋氨酸生物合成、脂質(zhì)A生物合成、金屬離子結(jié)合或轉(zhuǎn)運(yùn)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞體積調(diào)控、磷酸根離子穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)折疊等。

3""討論

蛋白質(zhì)是基因功能的直接執(zhí)行者，雖然一些蛋白質(zhì)可以獨(dú)立地行使功能，但大多數(shù)蛋白質(zhì)需要與其他蛋白質(zhì)互作才能充分發(fā)揮其功能。因此，研究蛋白質(zhì)之間的相互作用已成為深入解析蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。酵母雙雜交技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、成本低、高通量等優(yōu)點(diǎn)，是鑒定蛋白與蛋白互作的最常用方法[15]。在橡膠樹研究中，利用該技術(shù)已篩選鑒定了與HbHDA6[16]、HbMC1[17]、HbPSKR2[18]、HbSRPP7[19]等互作的蛋白。利用酵母雙雜交篩選與目標(biāo)蛋白互作的蛋白，首先需要構(gòu)建高質(zhì)量的酵母cDNA文庫(kù)，而文庫(kù)的質(zhì)量主要由RNA的完整性、文庫(kù)庫(kù)容等決定[20]。為使文庫(kù)包含的蛋白更多，本研究將ABA、H2O2、低溫處理的葉片以及健康、割面干涸、乙烯利處理橡膠樹的膠乳樣品的總RNA等量混合，用于分離純化mRNA及雙鏈cDNA合成，并基于同源重組的方法構(gòu)建了酵母cDNA文庫(kù)。經(jīng)鑒定，所構(gòu)建的次級(jí)文庫(kù)質(zhì)量較好，文庫(kù)重組率達(dá)100%，插入片段平均長(zhǎng)度超過1000"bp，庫(kù)容量約為3.80×"106"CFU/mL，總克隆數(shù)約為1.52×107"CFU，達(dá)到了酵母雙雜交篩選文庫(kù)的質(zhì)量要求。該文庫(kù)的建立為通過酵母雙雜交篩選與目標(biāo)橡膠樹蛋白互作的蛋白奠定了基礎(chǔ)。

硫氧還蛋白通過還原靶蛋白的二硫鍵在植物氧化還原反應(yīng)、光合作用、葉片衰老、逆境響應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用[1-4，"21]。鑒定硫氧還蛋白的靶蛋白將有助于揭示其作用機(jī)理。目前，已鑒定了一些能與硫氧還蛋白互作的蛋白。ARSOVA等[22]采用酵母雙雜交篩選到與239個(gè)克隆與擬南芥TRXz互作，并進(jìn)一步通過BIFC（雙分子熒光互補(bǔ)）等證實(shí)TRXz與類果糖激酶FLN1和FLN2互作。酵母雙雜交、BIFC、pull-down與Co-IP（免疫共沉淀）證實(shí)，番茄SlTrxh與過氧化物氧還蛋白SlPrx存在互作[23]。體外和植物體內(nèi)試驗(yàn)也表明，擬南芥TRXy2能與2-半胱氨酸過氧化物氧還蛋白（2-Cys"Prx）互作[24]。前期研究中，本團(tuán)隊(duì)從橡膠樹中克隆鑒定了一個(gè)受非生物脅迫誘導(dǎo)的y型TRX基因HbTRXy2，并證實(shí)在酵母中超量表達(dá)該基因能提高重組酵母的抗氧化性[14]。為鑒定HbTRXy2的靶蛋白，進(jìn)一步解析HbTRXy2調(diào)控抗氧化性的作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了HbTRXy2的誘餌載體，并通過酵母雙雜交篩選獲得24個(gè)可能與HbTRXy2互作的蛋白，其中，UDP-葡萄糖6-脫氫酶1（scaffold0137_967149）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶A（scaffold1603_54869）、山梨醇脫氫酶（scaffold0624_438647）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AFC2（scaffold0773_328521）和脫水素（scaffold0198_606133）與氧化還原和脅迫應(yīng)答相關(guān)。推測(cè)HbTRXy2可能通過與這些蛋白互作在抗氧化性中發(fā)揮作用。已有研究證實(shí)，芍藥甘油醛-3-磷酸脫氫酶PlGAPC2能通過提高NAD+的含量抑制高溫條件下活性氧的（ROS）產(chǎn)生[25]。過表達(dá)擬南芥山梨醇脫氫酶SDH能提高轉(zhuǎn)基因株系對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫的抗性[26]。在煙草中過表達(dá)高粱脫水素基因SbDhn1和SbDhn2均能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因株系的抗氧化性[27]。

功能注釋表明，篩選到的與HbTRXy2互作的24個(gè)蛋白涉及氧化還原、逆境脅迫響應(yīng)、ATP結(jié)合與代謝、糖酵解、單碳代謝、碳固定、卡爾文循環(huán)、蛋氨酸生物合成、脂質(zhì)A生物合成、金屬離子結(jié)合或轉(zhuǎn)運(yùn)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞體積調(diào)控、磷酸根離子穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)折疊等。其中，單碳代謝、碳固定、卡爾文循環(huán)、ATP結(jié)合與代謝等均與光合作用密切相關(guān)。核酮糖-1，5二磷酸羧化酶是植物催化CO2固定的關(guān)鍵酶，決定著光合作用中碳同化速率，由多個(gè)大亞基和多個(gè)小亞基組成[28]。葉綠體3-磷酸甘油醛脫氫酶和果糖1，6-二磷酸醛縮酶光合作用中參與卡爾文循環(huán)的重要酶[29-30]。本研究的酵母雙雜交篩選結(jié)果顯示，HbTRXy2與核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶大亞基（scaffold0297_1099976）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶A（scaffold1603_54869）和果糖-1，6-二磷酸醛縮酶6（scaffold0840_283341）存在相互作用，表明HbTRXy2可能通過調(diào)節(jié)卡爾文循環(huán)參與光合作用。已有研究證實(shí)，葉綠體硫氧還蛋白系統(tǒng)在植物光合作用中發(fā)揮重要作用[7-8，"12]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，HbTRXy2基因在葉片中高表達(dá)，且主要定位在葉綠體[14]。葉綠體是進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所。根據(jù)HbTRXy2基因的表達(dá)特性以及與其互作蛋白的功能注釋，推測(cè)HbTRXy2在橡膠樹光合作用中發(fā)揮重要作用。

4""結(jié)論

本研究構(gòu)建了庫(kù)容量為3.80×106"CFU/mL、平均插入片段長(zhǎng)度大于1000"bp的高質(zhì)量橡膠樹酵母雙雜交文庫(kù)，為篩選橡膠樹功能基因的互作蛋白奠定基礎(chǔ)；構(gòu)建了具有抗氧化功能的硫氧還蛋白HbTRXy2的誘餌載體pGBKT7-HbTRXy2，并通過酵母雙雜交篩選獲得24個(gè)與HbTRXy2互作的蛋白，功能涉及氧化還原、逆境脅迫響應(yīng)、ATP結(jié)合與代謝、糖酵解、單碳代謝、碳固定、卡爾文循環(huán)、蛋氨酸生物合成、脂質(zhì)A生物合成、金屬離子結(jié)合或轉(zhuǎn)運(yùn)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞體積調(diào)控、磷酸根離子穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)折疊等多種生物學(xué)進(jìn)程，為進(jìn)一步解析HbTRXy2的生物學(xué)功能及其作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]"VANACKER"H，"GUICHARD"M，"BOHRER"A"S，"ISSAKIDIS-BOURGUET"E."Redox"regulation"of"monode hydroascorbate"reductase"by"thioredoxin"y"in"plastids"revealed"in"the"context"of"water"stress[J]."Antioxidants，"2018，"7（12）："183.

[2]"SEVILLA"F，"MARTI"M"C，"DE"BRASI-VELASCO"S，"JIMENEZ"A."Redox"regulation，"thioredoxins，"and"glutare doxins"in"retrograde"signalling"and"gene"transcription[J]."Journal"of"Experimental"Botany，"2023，"74（19）："5955-5969.

[3]"GEIGENBERGER"P，"THORMAHLEN"I，"DALOSO"D"M，"FERNIE"A"R."The"unprecedented"versatility"of"the"plant?"thioredoxin"system[J]."Trends"Plant"Science，"2017，"22（3）："249-262.

[4]"JIMENEZ"A，"LOPEZ-MARTINEZ"R，"MARTI"M"C，"CANO-"YELO"D，"SEVILLA"F."The"integration"of"TRX/GRX"systems"and"phytohormonal"signalling"pathways"in"plant"stress"and"development[J]."Plant"Physiology"and"Biochemistry，"2024，"207："108298.

[5]"KANG"Z，"QIN"T，"ZHAO"Z."Thioredoxins"and"thioredoxin"reductase"in"chloroplasts："a"review[J]."Gene，"2019，"706："32-42.

[6]"NEE"G，"WANG"F，"CHATEL-INNOCENTI"G，"MHAMDI"A，"JURANVILLE"E，"VANACKER"H，"NOCTOR"G，"ISSAK IDIS-BOURGUET"E."Thioredoxins"m"regulate"plastid"glucose-6-phosphate"dehydrogenase"activity"in"Arabidopsis"roots"under"salt"stress[J]."Frontiers"in"Plant"Science，"2023，"14："1179112.

[7]"秦童，"黃震，"康振輝."葉綠體硫氧還蛋白系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制[J]."植物學(xué)報(bào)，"2019，"54（1）："119-132."QIN"T，"HUANG"Z，"KANG"Znbsp;H."Regulatory"mechanism"of"thioredoxin"（Trx）"in"chloroplasts[J]."Chinese"Bulletin"of"Botany，"2019，"54（1）："119-132."（in"Chinese）

[8]"SERRATO"A"J，"FERNANDEZ-TRIJUEQUE"J，"BARAJAS-"LOPEZ"J"D，"CHUECA"A，"SAHRAWY"M."Plastid"thioredoxins："a"“one-for-all”"redox-signaling"system"in"plants[J]."Frontiers"in"Plant"Science，"2013，"4："463.

[9]"COLLIN"V，"LAMKEMEYER"P，"MIGINIAC-MASLOW"M，"HIRASAWA"M，"KNAFF"D"B，"DIETZ"K"J，"ISSAKIDIS-"BOURGUET"E."Characterization"of"plastidial"thioredoxins"from"Arabidopsis"belonging"to"the"new"y-type[J]."Plant"Physiology，"2004，"136（4）："4088-4095.

[10]"LAUGIER"E，"TARRAGO"L，"COURTEILLE"A，"INNOC ENTI"G，"EYMERY"F，"RUMEAU"D，"ISSAKIDIS-"BOURGUET"E，"REY"P."Involvement"of"thioredoxin"y2"in"the"preservation"of"leaf"methionine"sulfoxide"reductase"capacity"and"growth"under"high"light[J]."Plant，"Cell"amp;"Environment，"2013，"36（3）："670-682.

• NEE"G，"ZAFFAGNINI"M，"TROST"P，"ISSAKIDIS-"BOURGUET"E."Redox"regulation"of"chloroplastic"glucose-6-phosphate"dehydrogenase："a"new"role"for"f-type"thioredoxin[J]."FEBS"Letters，"2009，"583（17）："2827-2832.
• OKEGAWA"Y，"SATO"N，"NAKAKURA"R，"MURAI"R，"SAKAMOTO"W，"MOTOHASHI"K."X-"and"y-type"thiore doxins"maintain"redox"homeostasis"on"photosystem"I"acceptor"side"under"fluctuating"light[J]."Plant"Physiology，"2023，"193（4）："2498-2512.
• NEE"G，"CHATEL-INNOCENTI"G，"MEIMOUN"P，"LEYMARIE"J，"MONTRICHARD"F，"SATOUR"P，"BAILLY"C，"ISSAKIDIS-BOURGUET"E."A"new"role"for"plastid"thioredoxins"in"seed"physiology"in"relation"to"hormone"regulation[J]."International"Journal"of"Molecular"Sciences，"2021，"22（19）："10395.
• 劉輝，"王真輝，"王帥，"何其光，"胡義鈺，"袁坤，"馮成天."來源于橡膠樹的硫氧還蛋白HbTRXy2及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用："ZL202310632739.3[P]."2024-08-13.LIU"H，"WANG"Z"H，"WANG"S，"HE"Q"G，"HU"Y"Y，"YUAN"K，"FENG"C"T."Thioredoxin"HbTRXy2"derived"from"rubber"tree"and"its"related"biomaterials"and"applications："ZL202310"632739.3[P]."2024-08-13."（in"Chinese）
• 沈竹，"曹勤紅."酵母雙雜交及其衍生技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J]."農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，"2022，"30（12）："2425-2433.SHEN"Z，"CAO"Q"H."Research"progress"on"application"of"yeast"two"hybrid"system"and"Y2H-derivated"techniques[J]."Journal"of"Agricultural"Biotechnology，"2022，"30（12）："2425-"2433."（in"Chinese）
• 張世鑫，"吳紹華，"楊署光，"晁金泉，"史敏晶，"葛立鑫，"蔣毅，"田維敏."橡膠樹形成層組織的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建及HbHDA6互作蛋白篩選[J]."廣西植物，"2024，"44（2）："245-256.ZHANG"S"X，"WU"S"H，"YANG"S"G，"CHAO"J"Q，"SHI"M"J，"GE"L"X，"JIANG"Y，"TIAN"W"M."Construction"of"yeast"two-hybrid"cDNA"library"incambium"tissue"of"Hevea"brasiliensis"and"screening"of"HbHDA6"interacting"proteins[J]."Guihaia，"2024，"44（2）："245-256."（in"Chinese）
• LIU"H，"WEI"Y，"DENG"Z，"YANG"H，"DAI"L，"LI"D."Involvement"of"HbMC1-mediated"cell"death"in"tapping"panel"dryness"of"rubber"tree"（Hevea"brasiliensis）[J]."Tree"Physiology，"2019，"39（3）："391-403.
• 杜曉愚，"趙一杰，"張世鑫，"田維敏，"晁金泉."巴西橡膠樹HbPSKR2基因克隆及互作蛋白鑒定[J]."熱帶作物學(xué)報(bào)，"2024，"45（4）："653-662.DU"X"Y，"ZHAO"Y"J，"ZHANG"S"X，"TIAN"W"M，"CHAO"J"Q."Cloning"and"interacted"protein"identification"of"HbPSKR2"gene"from"rubber"tree[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2024，"45（4）："653-662."（in"Chinese）

[19]"聶智毅，"康桂娟，"覃懷德，"曾日中."橡膠樹膜系統(tǒng)酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建及HbSRPP7互作蛋白篩選[J]."熱帶作物學(xué)報(bào)，"2023，"44（9）："1735-1744.NIE"Z"Y，"KANG"G"J，"QIN"H"D，"ZENG"R"Z."Construction"of"a"normalized"Hevea"brasiliensis"latex"MYTH"cDNA"library"and"screening"of"HbSRPP7"interacting"proteins[J]."Chinese"Journal"of"Tropical"Crops，"2023，"44（9）："1735-1744."（in"Chinese）

[20]"陳玉婷，"劉露，"楚盼盼，"魏嘉賢，"錢慧娜，"陳華，"蔡鐵城，"莊偉建，"張沖."受青枯菌誘導(dǎo)的花生根酵母雙雜交文庫(kù)構(gòu)建和AhRRS5互作蛋白的篩選[J]."作物學(xué)報(bào)，"2021，"47（11）："2134-2146.CHEN"Y"T，"LIU"L，"CHU"P"P，"WEI"J"X，"QIAN"H"N，"CHEN"H，"CAI"T"C，"ZHUANG"W"J，"ZHANG"C."Construction"of"yeast"two-hybrid"cDNA"library"induced"by"Ralstonia"solana-cearum"and"interaction"protein"screening"for"AhRRS5"in"peanut[J]."Acta"Agronomica"Sinica，"2021，"47（11）："2134-"2146."（in"Chinese）

[21]"LI"X，"SU"G，"PAN"C，"ZHAN"J，"WANG"A，"HAN"Z，"XIAO"D，"HE"L."TRX"h2-PP2AC2"module"servesnbsp;as"a"convergence"node"for"aluminum"stress"and"leaf"senescence"signals，"regulating"cell"death"via"ABA-mediated"ROS"pathway[J]."The"Plant"Journal，"2024，"120（6）："2602-2622.

[22]"ARSOVA"B，"HOJA"U，"WIMMELBACHER"M，"GREINER"E，"USTUN"S，"MELZER"M，"PETERSEN"K，"LEIN"W，"BORNKE"F."Plastidial"thioredoxin"z"interacts"with"two"fructokinase-like"proteins"in"a"thiol-dependent"manner："evidence"for"an"essential"role"in"chloroplast"development"in"Arabidopsis"and"Nicotiana"benthamiana[J]."The"Plant"Cell，"2010，"22（5）："1498-1515.

[23]"ZHAI"J，"QI"Q，"WANG"M，"YAN"J，"LI"K，"XU"H."Overexpression"of"tomato"thioredoxin"h"（SlTrxh）"enhances"excess"nitrate"stress"tolerance"in"transgenic"tobacco"interacting"with"SlPrx"protein[J]."Plant"Science，"2022，"315："111137.

[24]"JURADO-FLORES"A，"DELGADO-REQUEREY"V，"GAL VEZ-RAMIREZ"A，"PUERTO-GALAN"L，"PEREZ-RUIZ"J"M，"CEJUDO"F"J."Exploring"the"functional"relationship"between"y-type"thioredoxins"and"2-Cys"peroxiredoxins"in"Arabidopsis"chloroplasts[J]."Antioxidants，"2020，"9（11）："1072.

[25]"ZHAO"D，"CHENG"Z，"QIAN"Y，"HU"Z，"TANG"Y，"HUANG"X，"TAO"J."PlWRKY47"coordinates"with"cytosolic"glyceraldehyde-3-phosphate"dehydrogenase"2"gene"to"improve"thermotolerance"through"inhibiting"reactive"oxygen"species"generation"in"herbaceous"peony[J]."Plant，"Cell"amp;"Environment，"2025，"48（1）："226-243.

[26]"SHI"X"P，"REN"J"J，"YU"Q，"ZHOU"S"M，"REN"Q"P，"KONG"L"J，"WANG"X"L."Overexpression"of"SDH"confers"tolerance"to"salt"and"osmotic"stress，"but"decreases"ABA"sensitivity"in"Arabidopsis[J]."Plant"Biology，"2018，"20（2）："327-337.

[27]"HALDER"T，"UPADHYAYA"G，"BASAK"C，"DAS"A，"CHAKRABORTY"C，"RAY"S."Dehydrins"impart"protection"against"oxidative"stress"in"transgenic"tobacco"plants[J]."Frontiers"in"Plant"Science，"2018，"9："136.

[28]"TAYLOR-KEARNEY"L"J，"WANG"R"Z，"SHIH"P"M."Evolution"and"origins"of"rubisco[J]."Current"Biology，"2024，"34（16）："R764-R767.

[29]"ZHANG"Z，"LI"X，"ZHANG"Y，"ZHOU"J，"CHEN"Y，"LI"Y，"REN"D."Identification"of"the"fructose"1，6-bisphosphate"aldolase"（FBA）"family"genes"in"maize"and"analysis"of"the"phosphorylation"regulation"of"ZmFBA8[J]."Plant"Science，"2024，"350："112311.

[30]"SIMKIN"A"J，"ALQURASHI"M，"LOPEZ-CALCAGNO"P"E，"HEADLAND"L"R，"RAINES"C"A."Glyceraldehyde-3-phos phate"dehydrogenase"subunits"A"and"B"are"essential"to"maintain"photosynthetic"efficiency[J]."Plant"Physiology，"2023，"192（4）："2989-3000.