Transcriptome characteristic analysis and SSR marker development of Choerospondias axillaris

XU Mengyang ， CAI Yuyu ， LI Ting ， WU Nansheng ， SUN Rongxi （1.Institutefoeospodsillissearch，ColeoftngxigicuralUesitycang0，a; 2.Jiangxi ProvincialKeyLaboratoryof Subtropical Forest Resources Cultivation，Colegeof Forestry， Jiangxi Agricultural University，Nanchang33oO45，China）

Abstract：Transcriptome characteristic analysisand SSR marker was developed based on the leaf transcriptome sequences of Choerospondiasaxillaris inorder toprovidetheoretical supportandscientific basis for geneticevaluation， and sex marker-assisted breeding of C .axillaris.Differential expression of male and female transcriptomes，the distribution and sequence characteristics of SSR locus were analyzed，and SSR locus mining，development and validation wereconductedbased on the transcriptome data.Theresults wereas follows：（1）Atotal of 40341 Unigenessequences were obtained from male and female transcriptomes of c .axillaris.The totallength，the length of N5O，average length and GC content were 52 806 369 bp，2 409 bp，1 309 bp，and 3 8 . 7 5 % ，respectively.A total of 1 949 differentially expresed genes between males and females were screned，among which 1 O52 genes were significantly upregulated and 897 genes were dowregulated in males compared to females.（2）Among all Unigenes，5251 SSR loci were detected with 619 Unigenes sequences containing twoor more SSR loci，resulting in an SSR occurrencefrequencyof 11.18% and anaveragedistribution distance of10.O6 kb.Among all SSRloci，dinucleotiderepeatsaccountedfor the highest proportion （ 4 6 . 9 5 % ），followed by trinucleotide repeats （ 3 4 . 2 7 % ）.（3）A total of 20 pairs of SSR polymorphic primers were obtained through screening and validation，detecting 80 alleles among 85 samples，with an average polymorphism information content（PIC）of O.56.In summary，the sequencing qualityof C .axillarisishigh，andtheassemblyeffectis good.The 20 pairs providea reference fortheanalysis of population genetic diversity，sex marker-asisted breeding and fingerprints construction of C . axillaris.

Key words： Choerospondias axillris，primer development， transcriptome，SSR，locus characteristics

南酸棗（Choerospondiasaxillaris）為漆樹(shù)科（Anacardiaceae）南酸棗屬（Choerospondias）植物，別名五眼果、廣棗、人面子等，系蒙古族習(xí)用藥材（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1980）。其樹(shù)皮用于制備栲膠和鞣料、果實(shí)可食用或藥用，并具有較高的材用價(jià)值（蘇永精等，2023；李若熙等，2023）。南酸棗廣泛分布于我國(guó)南方，是重要的速生造林樹(shù)種，兼具經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益（高陽(yáng)等，2021;Zhangetal.，2022；楊觀蘭等，2022；李景恩等，2024）。此外，作為東亞特有單屬植物，它是亞熱帶、熱帶落葉闊葉林的重要組成部分。古地理研究表明，南酸棗屬植物可能起源于早始新世的歐洲，并沿溫暖濕潤(rùn)的特提斯洋擴(kuò)散到亞洲，東亞南酸棗屬的分布格局形成可能出現(xiàn)于晚中新世之前（Liangetal.，2022）。東亞地區(qū)自漸新世以來(lái)有連續(xù)的南酸棗屬化石記錄，顯示出較高的適應(yīng)性。福建中新世的南酸棗化石，與現(xiàn)代南酸棗形態(tài)差異比較大，其中遠(yuǎn)古南酸棗形態(tài)比現(xiàn)代“子孫”更加多樣（Wangetal.，2020）。南酸棗與漆樹(shù)科的鹽膚木屬（Rhus）植物在分布范圍情況上有相似之處，鹽膚木屬植物起源于早始新世的北美西部，在中始新世期間間斷分布在亞洲和北美。吳澤玲（2023）研究認(rèn)為，亞洲東部特殊的地形及氣候可能保留了這兩個(gè)屬。南酸棗很早就在歐洲消失，但在中國(guó)華南地區(qū)可能一直存在至今（Wangetal.，2020）。

南酸棗具有較強(qiáng)適應(yīng)性，能在溫度和降水變化較大的區(qū)域生長(zhǎng)（李冬等，2020）。但是，由于地域氣候不同，其表型性狀、生長(zhǎng)特性、營(yíng)養(yǎng)成分、抗性以及物候期等方面存在較大變異，并在我國(guó)亞熱帶和熱帶地區(qū)長(zhǎng)期進(jìn)化中積累了豐富的種內(nèi)遺傳變異（葉學(xué)敏等，2019；堯云萍等，2021；買(mǎi)凱樂(lè)等，2022）。作為雌雄異株的南酸棗，其長(zhǎng)期異交導(dǎo)致基因型高度雜合、缺乏同屬物種參考以及豐富的分子標(biāo)記，這限制了其遺傳評(píng)價(jià)和分子輔助育種工作，不利于其進(jìn)化潛力以及未來(lái)發(fā)展的分析，從而使其分子研究進(jìn)展緩慢（吳邏琦等，2001;谷振軍等，2019）。

物種的遺傳多樣性是其進(jìn)化潛力和適應(yīng)環(huán)境能力的重要指標(biāo)，能為物種應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)（Magurran，1988）。通過(guò)分子標(biāo)記對(duì)物種進(jìn)行遺傳多樣性分析，不僅對(duì)種質(zhì)資源的收集、保存、評(píng)價(jià)和利用等提供重要借鑒，而且還為遺傳學(xué)深層次研究奠定基礎(chǔ)。例如，葉金山等（2015）對(duì)南酸棗ISSR的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化；谷振軍等（2019）對(duì)南酸棗SSR分子標(biāo)記進(jìn)行初步探索；楊春霞等（2018）對(duì)南酸棗葉片和果實(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得大量數(shù)據(jù)；Zhang等（2021）對(duì)南酸棗葉綠體全基因組進(jìn)行測(cè)序，為進(jìn)一步開(kāi)展南酸棗分子遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。然而，目前發(fā)布的基因庫(kù)中未查詢到序列數(shù)據(jù)，分子標(biāo)記序列信息也未明確報(bào)道，限制了南酸棗分子層面的遺傳多樣性研究。

微衛(wèi)星分子標(biāo)記作為自前應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記之一，具有突變快、多態(tài)性和穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于遺傳評(píng)價(jià)、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位、瀕危物種保護(hù)等領(lǐng)域（Kurodaetal.，2006；閻毛毛等，2011）。通過(guò)不同分子標(biāo)記檢測(cè)物種多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)，SSR位點(diǎn)所提供的多態(tài)性通常遠(yuǎn)高于其他分子標(biāo)記，可以更好地反映種群間和種群內(nèi)的遺傳分化和亞分化，提供更準(zhǔn)確的物種進(jìn)化信息。與其他分子標(biāo)記相比，SSR位點(diǎn)通常提供更高的多態(tài)性，更準(zhǔn)確地反映種群間和種群內(nèi)的遺傳分化。例如，郭晉宏等（2019）通過(guò)SSR分析山西晉南漆樹(shù)（Toxicodendronvernicifluum）群體，發(fā)現(xiàn)其群體內(nèi)遺傳多樣性豐富，遺傳變異主要集中在群體內(nèi)部；任重等（2022）基于SSR分子標(biāo)記研究了中國(guó)黃連木（Pistaciachinensis）的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)其具有中等偏下的遺傳分化，遺傳分化主要集中在群體內(nèi)部，劃分為兩個(gè)主要群體。南酸棗的分子生物研究因起步較晚而缺乏基因組和相關(guān)序列信息。本研究利用南酸棗雌雄葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析南酸棗雌雄表達(dá)差異，以及其轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的分布及序列特征，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記引物，以期為其遺傳多樣性評(píng)價(jià)、雌雄性別標(biāo)記開(kāi)發(fā)及指紋圖譜構(gòu)建等研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料采自南酸棗種質(zhì)資源圃，選取10年生（雌雄無(wú)性系各3株：Female-1、Female-2、Female-3、Male-1、Male-2、Male-3）南酸棗新鮮葉片經(jīng)液氮速凍后，干冰保存送至檢測(cè)公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。采集江西崇義（JXCY）、貴州江口（GZJK）、湖南桑植（HNSZ）、云南芒市（YNMS）、廣西平南（GXPN）、湖北赤壁（HBCB）、安徽祁門(mén)（AHQM）和重慶沙坪壩（CQSPB）8個(gè)群體各1個(gè)樣品作為引物篩選樣品。引物多態(tài)性驗(yàn)證所用試驗(yàn)材料取自3個(gè)?。▍^(qū)）的85份樣品（表1）。所有南酸棗樣本采其健康無(wú)病蟲(chóng)害嫩葉，經(jīng)過(guò)硅膠迅速干燥之后保存用于DNA提取，最后進(jìn)行引物篩選及多態(tài)性驗(yàn)證。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1轉(zhuǎn)錄組組裝及分析對(duì)高通量測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)（rawdata）進(jìn)行過(guò)濾，獲得高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)（cleandata）。利用Trinity軟件（Grabherretal.，2011）對(duì)過(guò)濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)參基因組組裝，獲得轉(zhuǎn)錄本信息（transcripts）及Unigenes序列信息。以拼接得到的Unigenes作為參考序列，將樣品的有效序列（cleanreads）與參考序列比對(duì)，得到readcount。將readcount轉(zhuǎn)換為FPKM（FragmentsPerKilobaseMillion），得到基因的表達(dá)水平。

1.2.2SSR位點(diǎn)挖掘與引物設(shè)計(jì)使用MISA軟件（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）對(duì)組裝后的Unigenes進(jìn)行搜索，尋找Unigenes中的SSR位點(diǎn)，設(shè)置單核苷酸至六核苷酸重復(fù)參數(shù)分別為10次、6次、5次、5次、5次和5次（潘麗芹等，2019），對(duì)SSR位點(diǎn)的分布特征和重復(fù)類(lèi)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用Primer3（Rozenamp;Skaletsky，1999）軟件進(jìn)行批量引物設(shè)計(jì)，設(shè)置退火溫度為 ，GC含量為 4 0 % ～ 6 0 % ，引物長(zhǎng)度為1 8 ～ 2 7 b p ，產(chǎn)物長(zhǎng)度為 1 0 0 ～ 3 0 0 b p 。選擇100對(duì)雌雄差異表達(dá)基因所在位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物送武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.2.3基因組DNA提取及檢測(cè)采用CTAB法提取南酸棗基因組DNA。用紫外分光光度計(jì)及 1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量。將條帶清晰、純度高、完整度好的DNA樣品稀釋至50 ，保存 冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4引物篩選驗(yàn)證和PCR擴(kuò)增首先，采用1 . 5 % 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)100對(duì)引物進(jìn)行初步篩選，隨機(jī)選擇2個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)期范圍、條帶清晰且穩(wěn)定的引物即為初篩合格引物。PCR反應(yīng)體系為 2 × Taq PCRMaster Mix1 2 . 5 μ L ，正反引物各 ），DNA模板 1 μ L ，雙蒸水 9 . 5 μ L 。采用Touchdown程序： 預(yù)變性 變性 退火30S， 延伸 4 5 s ， 1 0 個(gè)循環(huán)； 變性 退火 延伸 個(gè)循環(huán); 延伸7m i n ，最后 保存（孫榮喜，2017）。然后，選擇8個(gè)地理位置相距較遠(yuǎn)群體中的8個(gè)樣品，采用毛細(xì)管電泳測(cè)序?qū)Τ鹾Y合格的引物進(jìn)行多態(tài)性復(fù)篩，篩選出峰值信號(hào)強(qiáng)、無(wú)雜峰的引物，作為復(fù)篩合格引物。最后，采用9個(gè)群體的85個(gè)樣品對(duì)復(fù)篩合格的引物進(jìn)行基于毛細(xì)管電泳測(cè)序的引物多態(tài)性驗(yàn)證。

毛細(xì)管電泳檢測(cè)采用3條引物進(jìn)行擴(kuò)增：1條 端添加M13尾巴序列（ -TGTAAAACGACGGCCAGT- ）的正向引物、1條反向引物以及1條 端標(biāo)有HEX、TAMRA、FAM和ROX熒光標(biāo)記的M13尾巴引物。PCR擴(kuò)增采用兩步法：第一步，PCR采用1 0 μ L 反應(yīng)體系： 2 × T a q PCR Master Mix R-primer 模板 1 μ L 和雙蒸水 3 . 8 μ L 。PCR擴(kuò)增程序： 預(yù)變性 變性 3 0 s ， 退火 延伸 3 0 s ，共20個(gè)循環(huán)； 延伸 1 0 m i n ，于 保存。第二步，PCR采用 反應(yīng)體系： 2 × TaqPCR Master Mix ： 熒光標(biāo)記尾巴引物 的

R-primer 、第一步得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2μ L 和雙蒸水 7 . 7 μ L 。PCR擴(kuò)增程序： 預(yù)變性 變性 退火 延伸30s，共35個(gè)循環(huán)； 延伸 1 0 m i n ，保存至 （孫榮喜，2017）。

1.2.5毛細(xì)管電泳測(cè)序?qū)⒓柞０放c分子量?jī)?nèi)標(biāo)GeneScan-500LIZ按 1 0 0 ： 1 的體積比混勻之后，先取 1 0 μ L 加入上樣板，再加入 0 . 3 μ L 的PCR產(chǎn)物， 變性 冷卻后離心，最后采用ABI 3 7 3 0 x L DNA anaLyzer（Applied Biosystems，F(xiàn)oster，CA，USA）進(jìn)行2重或3重毛細(xì)管電泳。

1.3數(shù)據(jù)分析

對(duì)南酸棗轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)分布特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，出現(xiàn)頻率 Σ= Σ 檢測(cè)到的SSR總位點(diǎn)數(shù)/Unigenes總序列數(shù)（黃建敏等，2019）。采用GeneMaker2.2.0軟件（Lukashinamp;Borodovsky，1998）對(duì)收集的毛細(xì)管電泳原始峰圖進(jìn)行基因分型;采用GenAIEx6.5（Peakallamp;Smouse，2012）軟件計(jì)算位點(diǎn)期望雜合度（expected heterozygosity， ）、觀測(cè)雜合度（observedheterozygosity， ）、有效等位基因數(shù)（numberofeffectivealleles， ）和等位基因數(shù)（numberofalleles， ）等遺傳參數(shù)。運(yùn)用PowerMarkerV3.25（Liuamp;Muse，2005）軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝分析

由表2可知，6個(gè)樣品的有效數(shù)據(jù)量均在5.47G以上，總共獲得35.40G的有效數(shù)據(jù)，Q20和Q30均高于 9 6 . 6 3 % 和 9 0 . 9 6 % ，GC含量在 42 % 左右，表明測(cè)序質(zhì)量較高。所有原始轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已提交至NCBI（PRJNA1142239）。雌株葉片（Female-1、Female-2和Female-3）測(cè)序分別獲得44329038條、41676510條和40128104條有效序列，雄株葉片（Male-1、Male-2和Male-3）測(cè)序分別獲得36771300條、36540830條和37214014條有效序列，共得到236659796條有效序列。

通過(guò)Trinity軟件組裝共得到40341條Unigenes序列，總長(zhǎng)度為 5 2 8 0 6 3 6 9 b p 。平均長(zhǎng)度為1309bp，GC 含量為 3 8 . 7 5 % 。Unigenes N50 的數(shù)量和長(zhǎng)度分別為7123條和 ，最大長(zhǎng)度和最小長(zhǎng)度分別為 1 6 8 8 9 b p 和 。其中，長(zhǎng)度為 2 0 1 ～ 5 0 0 b p 的占 3 8 . 3 8 % ，有15482條；長(zhǎng)度為 5 0 1 ～ 1 0 0 0 b p 的占 2 0 . 7 5 % ，有8371條；長(zhǎng)度為 的占 1 7 . 6 2 % ，有7109條；長(zhǎng)度大于 的占 2 3 . 2 5 % ，有9379條。

將組裝后的Unigenes作為參考，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本中基因檢測(cè)的情況（表3）。6個(gè)雌雄樣品中共檢測(cè)到40341個(gè)基因，其中雌株可以比對(duì)總基因的比例在 7 2 % 以上，而雄株的比例只占 70 % 左右。

2.2差異基因表達(dá)分析

采用以 值為基礎(chǔ)的聚類(lèi)分析方法，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行表達(dá)量分析。將6個(gè)樣品按雌雄分為兩組，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率 P 值（ P value） lt; 0 . 0 5 和差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)的絕對(duì)值 為篩選標(biāo)準(zhǔn)在南酸棗雌株和雄株葉片組間對(duì)比，最終篩選到1949個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因和下調(diào)基因分別有1052個(gè)和897個(gè)（圖1）。

2.3轉(zhuǎn)錄組SSR數(shù)量與分布

使用MISA軟件對(duì)南酸棗的40341條Unigenes序列進(jìn)行檢索后，共檢測(cè)到5251個(gè)SSR位點(diǎn)。這些SSR位點(diǎn)分布在4511條Unigenes序列上，SSR的出現(xiàn)頻率（檢測(cè)到的SSR位點(diǎn)總數(shù)與Unigenes序列總數(shù)之比）為 1 3 . 0 2 % ，發(fā)生頻率（含SSR位點(diǎn)的Unigenes數(shù)與Unigenes序列總數(shù)之比）為 1 1 . 1 8 % 。在這些Unigenes序列中，含有單個(gè)SSR位點(diǎn)的有3892條，含有2個(gè)及以上SSR位點(diǎn)的有619條，含有復(fù)合SSR位點(diǎn)的有386條。此外，有18條Unigenes序列中復(fù)合SSR位置出現(xiàn)重疊（表4）。

由表5可知，除單核苷酸重復(fù)外，二核苷酸重復(fù)類(lèi)型最為常見(jiàn)，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的 4 2 . 9 3 % ，平均分布距離為 2 3 . 4 3 k b ;其次是三核苷酸和四核苷酸重復(fù)類(lèi)型，分別占 3 1 . 0 6 % 和 1 1 . 5 2 % ，平均分布距離分別占 3 2 . 3 8 k b 和 8 7 . 2 8 k b ;五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類(lèi)型占比較小，分別為 3 . 5 2 % 和 3 . 2 8 % ，平均分布距離分別為 2 8 5 . 4 4 k b 和 3 0 7 . 0 1 k b 。各種核苷酸重復(fù)類(lèi)型的平均分布距離存在較大差異。

在Unigenes序列中，二核苷酸重復(fù)出現(xiàn)頻率最高，達(dá)到 5 . 5 9 % ，其次是三核苷酸重復(fù)，為4 . 0 4 % ;四核苷酸、五核苷和六核苷酸重復(fù)類(lèi)型的出現(xiàn)頻率較低，分別為 1 . 5 0 % . 0 . 4 6 % 和 0 . 4 3 % ；復(fù)合型核苷酸和位置有重疊的復(fù)合型核苷酸重復(fù)的占比（ 7 . 3 5 % . 0 . 3 4 % 與出現(xiàn)頻率 （ 0 . 9 6 % ， 0 . 0 4 % ）均較低（表5）。

SSR位點(diǎn)序列長(zhǎng)度總長(zhǎng)為 ，其中二核苷酸重復(fù)類(lèi)型的SSR長(zhǎng)度最長(zhǎng)，為41248.20bp，其次是三核苷酸重復(fù)類(lèi)型（ 2 9 4 7 2 . 1 7 b p ），四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)類(lèi)型的SSR長(zhǎng)度分別為 1 0 5 4 5 . 1 5 ， 3 9 7 5 . 6 5 ， 4 4 3 4 . 1 6 b p 。除去復(fù)合型核苷酸和位置有重疊的復(fù)合型核苷酸重復(fù)類(lèi)型，六核苷酸重復(fù)類(lèi)型的平均長(zhǎng)度最長(zhǎng)，但占比較?。?3 . 2 8 % ）。所有SSR位點(diǎn)的平均長(zhǎng)度為22.31bp（檢測(cè)到的序列總長(zhǎng)度與搜索到的SSR數(shù)量之比），平均每 1 0 . 0 6 k b （檢測(cè)序列總的大小與搜索到的SSR數(shù)量之比）就會(huì)有1個(gè)SSR位點(diǎn)出現(xiàn)（表5），其中檢測(cè)序列總的大小見(jiàn)表 4 （ 5 2 8 0 6 3 6 9 b p ）以及 O

表4南酸棗轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的信息

2.4轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的基元長(zhǎng)度及重復(fù)基元特點(diǎn)

基元長(zhǎng)度在 2 0 b p 以下的SSR位點(diǎn)共有3601個(gè)，所占比例最高，為 6 8 . 5 8 % ;其次為長(zhǎng)度為21＼～3 0 b p 的SSR位點(diǎn)，有1112個(gè)，占比為 2 1 . 1 8 % ；長(zhǎng)度在 3 0 b p 以上的總占比較小，僅占 1 0 . 2 4 % 。

5251個(gè)SSR位點(diǎn)中含有412種重復(fù)基元類(lèi)型。其中，二核苷酸重復(fù)基元有10種，以AG/CT為主要類(lèi)型，為1309個(gè)，頻率為 2 4 . 9 3 % ，其次是AT/AT類(lèi)型，有730個(gè)，頻率為 1 3 . 9 0 % ；三核苷酸重復(fù)基元有60種，主要以AAG/CTT為優(yōu)勢(shì)類(lèi)型，共556個(gè)，頻率為 1 0 . 5 9 % ，其次是AAT/ATT類(lèi)型，有277個(gè)，頻率為 5 . 2 8 % ;四核苷酸重復(fù)基元有95種，AAAT/ATTT類(lèi)型最多，有312個(gè)，頻率為 5 . 9 4 % ，其次是AAAG/CTTT類(lèi)型，有

103個(gè)，頻率為 1 . 9 6 % ；五核苷酸重復(fù)基元有99種，以AAAAT/ATTTT為主要類(lèi)型，共有53個(gè)，頻率為 1 . 0 1 % ；此外，六核苷酸重復(fù)基元148種、復(fù)合型重復(fù)基元404種、位置重疊的復(fù)合型重復(fù)基元18種，但出現(xiàn)頻率都很低，均在 0 . 5 % 以下（圖2）。

2.5南酸棗轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)次數(shù)

去掉復(fù)合型位點(diǎn)，二核苷酸至六核苷酸的SSR基元重復(fù)次數(shù)分布在4至29之間。其中，最常見(jiàn)的是6個(gè)串聯(lián)重復(fù)（1100），占總數(shù)的 2 2 . 6 9 % ;其次是5個(gè)串聯(lián)重復(fù)（1057）和4個(gè)串聯(lián)重復(fù)（727），分別占總數(shù)的 2 1 . 8 1 % 和 1 5 . 0 0 % ；二核苷酸以6個(gè)串聯(lián)重復(fù)為主，三核苷酸以5個(gè)串聯(lián)重復(fù)為主，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸均以4個(gè)串聯(lián)重復(fù)為主（表6）。隨著重復(fù)次數(shù)的增加，SSR數(shù)量逐漸減少。

表6不同重復(fù)次數(shù)SSR的核苷酸類(lèi)型的數(shù)量及占比

2.6引物篩選與有效性驗(yàn)證

2.6.1引物初篩與復(fù)篩在100對(duì)SSR引物中，初篩共有55對(duì)引物成功擴(kuò)增出預(yù)期的清晰條帶，擴(kuò)增成功率為 5 5 % （24對(duì)電泳結(jié)果見(jiàn)圖3）。經(jīng)毛細(xì)管電泳復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)20對(duì)引物表現(xiàn)出較高多態(tài)性，在有效引物中占 3 6 . 3 6 % ，其中引物NSZ-9141檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.6.2SSR位點(diǎn)群體遺傳分析有效性驗(yàn)證利用湖北、湖南、廣西9個(gè)群體的85個(gè)南酸棗樣品對(duì)20對(duì)引物進(jìn)行有效性驗(yàn)證。表7結(jié)果顯示，共檢測(cè)

橫軸和縱軸分別表示片段大?。╞p）和熒光強(qiáng)度；JXCY.江西崇義；GZJK.貴州江口；HNSZ.湖南桑植；YNMS.云南芒市；

GXPN.廣西平南；HBCB.湖北赤壁；AHQM.安徽祁門(mén)；CQSPB.重慶沙坪壩。

The X -axis and Y . -axisindicatesfragment size（bp）and fluorescence intensity，respectively；JXCY.Chongyi，Jiangxi；GZJK.Jiangkou， Guizhou；HNSZ.Sangzhi，Hunan；YNMS.Mangshi，Yunan;GXPN.Pingnan，Guangxi；HBCB.Chibi，Hubei；AHQM.Qimen，Anhui;

CQSPB. Shapingba，Chongqing.

到等位基因數(shù)（ ）為80，平均每對(duì)引物檢測(cè)到3.82個(gè)等位基因；平均有效等位基因數(shù)（ ）為2.61，其值分布在1.14（NSZ-22900）至7.16（NSZ-131）之間；多樣性指數(shù) （ I ） 分布在0.21（NSZ-22900）至2.06（NSZ-131）之間，平均值為0.98；平均觀測(cè)雜合度（ 以及期望雜合度（ ? ? ? ? ? ）值均為0.53；多態(tài)性信息含量（PIC）在0.12（NSZ-22900）至0.92（NSZ-186）之間，平均值為0.56。其中，15個(gè)位點(diǎn)具有高度多態(tài)性（ P I Cgt;0 . 5 ），4個(gè)位點(diǎn)具有中度多態(tài)性（ （ 0 . 2 5

3討論

對(duì)于沒(méi)有參考基因組的非模式物種，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記被認(rèn)為是最有效的方法（Unambaetal.，2015）。本研究基于南酸棗雌雄葉片轉(zhuǎn)錄組，共獲得236659796條有效序列，N50長(zhǎng)度為 2 4 0 9 b p ，平均長(zhǎng)度為 ，高于同漆樹(shù)科植物芒果（Mangiferaindica）（ 平均長(zhǎng)度 ）（丁雨格等，2024）。此外，也高于其他學(xué)者有關(guān)南酸棗葉片及果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果（ N 5 0 = 1 8 4 1 b p ;平均長(zhǎng)度 = 1 2 8 7 b p （谷振軍等，2019），以及同為長(zhǎng)江以南主要闊葉樹(shù)種的米褚（Castanopsis carlesii） （ N 5 0 = 1 4 2 7 b p ;平均長(zhǎng)度 ）（Zhongetal.，2023）和同樣果用價(jià)值較高的苦楝（Meliaazedarach）（ N5 0 = 1 9 5 5 bp;平均長(zhǎng)度 = 1 4 3 1 . 8 2 b p ）（蔡金峰等，2021）的測(cè)序結(jié)果。這說(shuō)明研究所獲得的南酸棗轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量以及組裝效果較好，為南酸棗的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)奠定良好的信息基礎(chǔ)。

本研究從南酸棗葉片轉(zhuǎn)錄組序列中檢測(cè)到5251個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)，平均分布距離為 1 0 . 0 6 k b SSR發(fā)生頻率為 1 1 . 1 8 % 。本研究SSR發(fā)生頻率低于南酸棗果實(shí)及葉片轉(zhuǎn)錄組中的發(fā)生頻率 2 5 . 5 2 %

表720對(duì)多態(tài)性SSR引物序列信息

（谷振軍等，2019），而高于枇杷（Eriobotrya japonica）（ 6 . 7 7 % ）（鄭婷婷等，2015）和芒果（ 7 . 5 7 % ）（羅純等，2015）等植物，這表明不同物種之間SSR發(fā)生頻率存在差異（Zalapaetal.，2012）。不同測(cè)序組織類(lèi)型選擇、基因表達(dá)量的差異、SSR位點(diǎn)搜索標(biāo)準(zhǔn)的不一致以及Unigenes數(shù)量、長(zhǎng)度和序列大小的差異可能是導(dǎo)致這種差異的原因。不同植物的SSR位點(diǎn)重復(fù)基元類(lèi)型各異，多數(shù)植物如楊梅（Myricarubar）（張淑文等，2019）、芒果（羅純等，2015）、白三葉（Trifoliumrepens）（張婷婷等，2023）等都以二核苷酸、三核苷酸重復(fù)為主。本研究中二核苷酸重復(fù)占比最高（ 4 6 . 9 5 % ），其次為三核苷酸重復(fù) （ 3 4 . 2 7 % ） 。這兩種重復(fù)基元所占比例高達(dá) 8 1 . 2 2 % ，與大多數(shù)物種重復(fù)基元類(lèi)型相同。但是，也有植物以單核苷酸重復(fù)為主，如枸杞（Lyciumchinense）（王佳偉等，2022）、懸鈴木（Platanusacerifolia）（張思思等，2022）等。然而，由于單核苷酸自身的特殊性，大多數(shù)研究中不將其作為研究對(duì)象，因此在本研究中不考慮單核苷酸重復(fù)。

多態(tài)性是鑒定分子標(biāo)記性能的重要參考指標(biāo)之一。Temnykh等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，SSR長(zhǎng)度是影響其多態(tài)性的重要因素。具有高度多態(tài)性的SSR長(zhǎng)度通常大于 2 0 b p ，中度多態(tài)性的SSR長(zhǎng)度大多為 1 2 ～ 2 0 b p ，低度多態(tài)性的SSR長(zhǎng)度在 以下。南酸棗SSR位點(diǎn)長(zhǎng)度大多為 2 1 ～ 3 0 b p ，共有1112個(gè)，表明南酸棗的SSR位點(diǎn)具有高多態(tài)性潛能。本研究開(kāi)發(fā)的20對(duì)引物，在9個(gè)群體中共檢測(cè)到80個(gè)等位基因，平均觀測(cè)雜合度以及平均期望雜合度均為0.53，平均多態(tài)性信息含量為0.56，其中19個(gè)位點(diǎn)具有中、高多態(tài)性，說(shuō)明開(kāi)發(fā)的SSR引物能夠滿足后續(xù)相關(guān)研究需求。通常認(rèn)為，重復(fù)基元長(zhǎng)度與選擇壓力相關(guān)，短重復(fù)基元變異速率越快，低級(jí)重復(fù)基元類(lèi)型的SSR多態(tài)性高于高級(jí)重復(fù)基元類(lèi)型（Zhangetal.，2005）。單堿基、二堿基和三堿基等低級(jí)重復(fù)基元通常具有較長(zhǎng)的進(jìn)化時(shí)間和較高的變異頻率（陳亮等，2008）。除單核苷酸外，南酸棗主要以二核苷酸重復(fù)為主，表明其具有相對(duì)較高的進(jìn)化程度。在福建地區(qū)發(fā)現(xiàn)的中新世南酸棗化石，經(jīng)研究后發(fā)現(xiàn)其在我國(guó)華南地區(qū)可能自遠(yuǎn)古時(shí)代就一直存在至今，具有悠久的演變歷史（Wangetal.，2020）。南酸棗在此過(guò)程中保持一定進(jìn)化速率的同時(shí)，表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境較高的適應(yīng)性，可能與南酸棗較高的多態(tài)性特性有關(guān)。

4結(jié)論

南酸棗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的SSR發(fā)生頻率為1 1 . 1 8 % ，低級(jí)重復(fù)基元通常具有較長(zhǎng)的進(jìn)化時(shí)間和較高的變異頻率，主要以二核苷酸、三核苷酸重復(fù)為主。20對(duì)引物經(jīng)多態(tài)性驗(yàn)證，共檢測(cè)到80個(gè)等位基因，平均多態(tài)性信息含量為0.56。表明這20對(duì)引物可有效用于后續(xù)南酸棗遺傳多樣性評(píng)價(jià)、性別分子輔助育種、指紋圖譜構(gòu)建以及核心種質(zhì)構(gòu)建等的相關(guān)研究中。

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（責(zé)任編輯周翠鳴）