摘要：該研究以16種櫻屬植物為研究材料，利用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其進(jìn)行聚類(lèi)分析，旨在為鐘花櫻及其近緣種的物種分類(lèi)、物種資源保護(hù)、砧木選擇和雜交親本選擇提供分子水平的依據(jù)和技術(shù)支持。結(jié)果表明：（1）遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)17對(duì)EST-SSR引物共檢測(cè)出98個(gè)等位基因，每對(duì)引物平均為5.76個(gè)，有效等位基因數(shù) 為 1 . 1 6 ～ 7 . 6 4 ，平均值為3.22；觀察雜合度 為 0 . 0 4 ～ 0 . 5 4 ，平均值為0.28；期望雜合度 為 0 . 5 8 ～ 0 . 9 2 ，平均值為0.77;Shannon's指數(shù) （ I ） 為 1 . 3 8 ～ 2 . 6 5 ，平均值為2.14;多態(tài)信息含量（PIC）為 0 . 6 2 ～ 0 . 9 2 ，平均值為0.78。（2）聚類(lèi)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了野生早櫻和黑櫻桃外，其余14個(gè)物種親緣關(guān)系密切，聚為一大類(lèi)（遺傳相似系數(shù) 為 ），其中，鐘花櫻和高盆櫻之間的親緣關(guān)系最高（ ），鐘花櫻和野生早櫻之間的親緣關(guān)系最低（ ），因此，建議使用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的野生早櫻和黑櫻桃與鐘花櫻進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。（3）在我國(guó)南方的生產(chǎn)實(shí)踐中，已出現(xiàn)以華中櫻為砧木，以鐘花櫻為接穗嫁接的高接苗。因此，從理論上講，與鐘花櫻親緣關(guān)系較近的華中櫻、山櫻、散毛櫻和浙閩櫻等也可以作為砧木，但還應(yīng)考慮砧木的抗性、長(zhǎng)勢(shì)、繁殖和壽命等。通過(guò)嫁接實(shí)驗(yàn)得知，華中櫻和山櫻作為砧木嫁接鐘花櫻成活率最高（ ? 8 0 % ），與分子實(shí)驗(yàn)基本一致，比較適合作為嫁接鐘花櫻的砧木。該研究結(jié)果為鐘花櫻的選育、繁殖、保護(hù)和利用以及櫻屬之間的物種分類(lèi)提供了分子依據(jù)。

中圖分類(lèi)號(hào)：Q949 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-3142（2025）04-0761-12

Cluster analysis and grafting affinity study of Prunus campanulata and related species based on EST-SSR

LIU Kui，LI Zihan， ZHANG Yi，HAO Wenjie，JIANG Lei，YE Qi，F(xiàn)U Tao（NingboCityCollegeofVocational Technology，Ningbo3151Oo，Zhejiang，China）

Abstract：This studyused16 species of Prunus plants as research materials and conducted cluster analysis using ESTSSR molecular marker technology，aiming to provide molecular level basisand technical support forspecies classification，species resource conservation，rootstock selection，and hybrid parent selection of P .campanulata and its related species.The results were as folows：（1）Theresults of genetic diversityanalysis showed thatatotal of 98 alleles were detected from17pairs ofEST-SSR primers，with an average of5.76aleles per primer pair.The numberof effctive alleles （ ）range was 1.16-7.64，with an average of 3.22；the observed heterozygosity （ ） range was 0 . 0 4 -0 . 5 4 with an average value of O.28；the expected heterozygosity（ ）range was 0.58-0.92，with an average value of 0.77; the Shannon's index （ ）rangewas 1 . 3 8 -2 . 6 5 ，with anaverage value of 2.14；the polymorphism information content （PIC）range was 0.62-0.92，with an average value of 0.78.（2）The clustering analysis results indicated that，except for P . subhirtella var.ascendens and P .maximowiczii，the other14 species were closely related and were clustered into a large group （ ranging from O.653 1 to O.918 4）.Among them，the highest genetic relationship was found between P .campanulata and P cerasoides（ 4），while the lowest was found between P .campanulataand P subhirtella var.ascendens （ ）.Therefore，itis recommended to use P .subhirtella var.ascendens and P maximowiczii which had distant genetic relationships to conduct hybridization experiments with P .campanulata.（3） In the production practice of southern China， grafting had emerged using P . conradinae as rootstock and P . campanulata as scion grafting. Therefore，in theory，species closely related to P .campanulata，such as P . conradinae， P .serrulata， P discoidea， P ·patentipila and P .schneideriana etc.，could also serve as rootstocks. Nevertheless，the resistance， growth，reproduction，andlifespanof therootstock shouldalsobeconsidered.Through grafting experiments，itwas found that P .cerasoidesand P .serrulata had the highest survival rates（ ? 8 0 % ）when grafted onto P .campanulata，which were consistent with molecular experiments and were more suitable as rootstocks for grafting P .campanulata. The research results provide a molecular basis for breeding，reproduction，protection and utilization of P .campanulata，and the classification of species between Prunus.

Key words：Prunus，Prunus campanulata，genetic diversity，genetic relationship，breeding，EST-SSR

據(jù)FloraofChina記載全世界約有櫻花150種，中國(guó)約有50種或變種，遠(yuǎn)超日本等國(guó)家或地區(qū)，但我國(guó)從古至今對(duì)觀賞類(lèi)櫻花的選育重視不夠，遠(yuǎn)落后于日本（Liamp;Bruce，2003）。目前，我國(guó)對(duì)櫻花的育種和繁殖研究尚處于起步階段，很多野生櫻花資源還未得到充分的開(kāi)發(fā)和利用，國(guó)內(nèi)觀賞類(lèi)櫻花大多從日本等國(guó)外引種而來(lái)，由于氣候等因素的影響，國(guó)內(nèi)引進(jìn)的品種櫻花存在病蟲(chóng)害發(fā)生嚴(yán)重、適應(yīng)性不強(qiáng)、壽命短等問(wèn)題，因此亟須選育出抗性和適應(yīng)性較強(qiáng)的自主櫻花種質(zhì)。鐘花櫻（Prunuscampanulata）又名福建山櫻花，自然分布于我國(guó)浙江、福建、臺(tái)灣、廣東、江西和廣西等地，具有花期早、花色艷麗等特點(diǎn)，尤其紅色花瓣深受中國(guó)人的喜愛(ài)，因此逐漸應(yīng)用于園林觀賞及住宅小區(qū)的綠化、美化等，有很大的開(kāi)發(fā)潛力。然而，由于多數(shù)鐘花櫻適應(yīng)性較差，往往野生狀態(tài)的生長(zhǎng)和觀賞效果要優(yōu)于庭院綠地。此外，鐘花櫻還存在花稀疏、花色單一等缺陷。因此，系統(tǒng)地開(kāi)展鐘花櫻的抗性研究（包含砧木篩選）及優(yōu)良品種選育尤為重要，如在進(jìn)行品種選育時(shí)融入其他近緣物種優(yōu)良特性將極有可能培育出花色豐富、花期較長(zhǎng)、花更茂密、適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性更強(qiáng)的鐘花櫻新品種、新類(lèi)型，這對(duì)豐富國(guó)內(nèi)櫻屬植物資源和促進(jìn)國(guó)內(nèi)櫻屬植物種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用都具有十分重要的意義。

近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)“櫻花熱”的興起，鐘花櫻已引起了科研工作者、園林公司等的廣泛關(guān)注，并在繁殖技術(shù)及分子研究等方面開(kāi)展了一定研究。黃云鵬等（2022）對(duì)鐘花櫻無(wú)性系生長(zhǎng)性狀的遺傳變異進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)性系間的樹(shù)高、胸徑、冠幅均存在極顯著性差異，表明鐘花櫻無(wú)性系生長(zhǎng)性狀選擇具有可行性；陸日惠等（2022）對(duì)鐘花櫻的幼苗生長(zhǎng)和光合特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)鐘花櫻的幼苗生長(zhǎng)和光合作用因淹水而受到強(qiáng)烈抑制，鐘花櫻耐澇性較弱；黃碧金等（2023）對(duì)鐘花櫻種子發(fā)芽條件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)種子冷藏時(shí)間不宜超過(guò)2年，水溫 、浸種 值為中性時(shí)播種發(fā)芽效果最好；Shahi-Gharahlar等（2011）利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)39份櫻桃亞屬植物的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)ISSR分子標(biāo)記能夠?qū)⒏牧计贩N與野生種質(zhì)有效分離；周成城等（2020）和劉麗麗等（2024）利用ISSR標(biāo)記分別對(duì)12份櫻花種質(zhì)和18份櫻屬材料進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)ISSR標(biāo)記在櫻屬種具有較高的遺傳多樣性，能夠較好地用于櫻屬植物間的親緣關(guān)系分析；趙慶杰等（2016）利用SCAR分子標(biāo)記成功地對(duì)20個(gè)櫻花品種進(jìn)行了鑒定；嚴(yán)佳文等（2022）利用SNP標(biāo)記技術(shù)對(duì)47份櫻花種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，能夠?qū)鸦s交后代進(jìn)行有效區(qū)分和未知類(lèi)群的鑒定；何恒流等（2015）利用SSR分子標(biāo)記對(duì)陜西7個(gè)毛櫻桃自然居群進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明陜西毛櫻桃自然居群遺傳多樣性水平較高；宗宇等（2016）利用SSR分子標(biāo)記對(duì)24份櫻桃種質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)結(jié)果，但與經(jīng)典的形態(tài)學(xué)分類(lèi)不完全一致；李水根等（2022）利用基因組SSR分子標(biāo)記可以較好地反映45種供試櫻屬植物之間的親緣關(guān)系；孫澤碩等（2023）利用SSR標(biāo)記對(duì)42份櫻花品種進(jìn)行了聚類(lèi)分析和DNA指紋圖譜構(gòu)建，但對(duì)部分混合品種不能很好地聚類(lèi)區(qū)分。然而，目前利用EST-SSR對(duì)我國(guó)櫻屬植物原種進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析的相關(guān)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)屬于第二代分子標(biāo)記技術(shù)，其穩(wěn)定性、多態(tài)性和安全性都要高于RFLP、RAPD、AFLP等分子標(biāo)記技術(shù)，可很好地用于物種間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。本研究以鐘花櫻及其近緣種等16種櫻屬植物為研究對(duì)象，采用EST-SSR分子標(biāo)記對(duì)鐘花櫻及其近緣種進(jìn)行親緣關(guān)系的探討，通過(guò)遺傳多樣性分析和聚類(lèi)分析，擬探討以下問(wèn)題：（1）鐘花櫻及其近緣種等16種櫻屬植物遺傳多樣性的高低；（2）鐘花櫻與其余15種櫻屬植物親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近；（3）能否篩選出與鐘花櫻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的近緣種，用于雜交育種選育優(yōu)良新品種；（4）能否篩選出與鐘花櫻親緣關(guān)系較近的近緣種，用于培育優(yōu)良砧木。以期為進(jìn)一步研究鐘花櫻及其近緣種的物種分類(lèi)、物種資源保護(hù)利用、雜交親本選擇和砧木的選擇等提供分子水平依據(jù)和技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

2021年3—4月本課題組成員先后從福建 ）、云南（ ）、上海（ 、浙江（ 、 2 8°51′～" ）等地搜集了16份櫻花種質(zhì)資源，具體見(jiàn)表1。本課題組主要進(jìn)行中國(guó)櫻花種質(zhì)資源調(diào)查、物種分類(lèi)和育種等方面的工作，野外對(duì)已經(jīng)長(zhǎng)出葉片的櫻花采集健康、無(wú)病害的幼葉若干后用硅膠處理，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室 冰箱保存，而對(duì)于另一部分還未長(zhǎng)出葉片的櫻花，野外采集其枝條或?qū)嵣?，運(yùn)回后對(duì)其枝條進(jìn)行水培或扦插以及對(duì)實(shí)生苗進(jìn)行種植，精心管理后待長(zhǎng)出嫩葉，采集健康、無(wú)病害的幼葉若干，采后立即送回實(shí)驗(yàn)室 保存，用于分子試驗(yàn)。種植成活的幼苗移植到試驗(yàn)基地，以利于種質(zhì)資源的保存，也為后續(xù)的育種工作留下寶貴的試驗(yàn)材料。

1.2EST序列來(lái)源

從http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank 下載櫻屬植物的EST序列，并且通過(guò)搜索字段輸人Cerasus總共獲得111850個(gè)EST序列，選擇其中部分單序列進(jìn)行SSR信息分析和EST-SSR引物開(kāi)發(fā)。

1.3EST-SSR的查找

登錄網(wǎng)址 http：//www.gramene.org/gremene/searches/ssrtool，我們使用SSRIT軟件在線搜索了二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸5種類(lèi)型的EST-SSR序列，其中重復(fù)序列長(zhǎng)度必須大于 的識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)，即重復(fù)次數(shù)應(yīng)分別大于或等于10、6、5、3、3。

1.4EST-SSR引物設(shè)計(jì)

利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)SSR側(cè)翼區(qū)的引物。引物設(shè)計(jì)的主要參數(shù)如下：EST序列長(zhǎng)度必須大于 1 0 0 b p ;SSR序列的起始和終止位置應(yīng)分別與 和 相距不小于 2 0 b p ;引物長(zhǎng)度為 1 8 ～ 2 2 b p ：退火溫度 T m 值為 ；上游和下游引物的T m 值均應(yīng)小于 5 ‰ ;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1 0 0 ～ 5 0 0 b p ，當(dāng)分?jǐn)?shù)超過(guò)90分時(shí)可以用于引物合成；此外，引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)應(yīng)盡量避免出現(xiàn)。引物設(shè)計(jì)完成后，由上海桑尼生物科技有限公司合成，命名為PC加序列號(hào)，如PC1。選擇表型性狀差異較大的4種材料（散毛櫻、郁李、鐘花櫻、黑櫻桃）進(jìn)行引物篩選。

1.5總DNA提取

采用植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒（上海萊楓生物科技有限公司）進(jìn)行DNA的提取，

表116種櫻屬植物信息

通過(guò) 1 . 5 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Eppendorf生產(chǎn)公司的Bio-Photometr核酸檢測(cè)器檢測(cè)DNA濃度和純度，根據(jù)計(jì)算的DNA濃度，用TE將DNA樣品溶液稀釋至 0

1.6引物篩選與聚丙烯酰胺凝膠電泳

上海桑尼生物科技有限公司總共合成了50對(duì)EST-SSR引物，其中12對(duì) EST SSR引物來(lái)自Prunus jamasakura（Yoshiakietal.，20o9），其余38對(duì)均為自己設(shè)計(jì)合成所得，其中有36對(duì)引物可以在4種材料（散毛櫻、郁李、鐘花櫻、黑櫻桃）中成功擴(kuò)增（PCR）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)體系為 ，其中包含 1 0 μ L 的 Easy TaqTM DNAPolymeraseforPAGE（包含TaqDNA聚合酶、dNTP和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，由Trans-GenBiotech公司提供） . 1 μ L 基因組DNA（ ） . 0 . 8 μ L（ 5 引物對(duì)和 。PCR反應(yīng)在Eppendorf-Master循環(huán)儀上進(jìn)行，PCR循環(huán)條件： 初始變性 s和 個(gè)循環(huán);最后 延伸 7 m i n 。反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物在 1 . 5 % 瓊脂糖凝膠（biowest瓊脂糖）上進(jìn)行電泳分離，其中緩沖液為 0 . 5 × T B E （1L 中含有 5 . 4 g T r i s . 2 . 7 5 g 硼酸和0.372 ），電泳速率為 ，電泳結(jié)束后用溴化乙錠（ ）染色并在紫外光下觀察，以Mark作為標(biāo)準(zhǔn)。最終篩選出17對(duì)譜帶清晰、多態(tài)性良好的EST-SSR引物用于分析整個(gè)樣本的分析（表2）。再使用相同的循環(huán)條件，然后用 5 μ L 擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物，并使用 6 % 聚丙烯酰胺凝膠電泳（含 尿素 40 % 丙烯酰胺、 6 0 μ L TEMED 和 6 0 μ L （204號(hào) 2 5 % APS在 中）和銀染（ ，干燥后使用數(shù)碼相機(jī)拍照保存。

1.7嫁接親和性實(shí)驗(yàn)

選擇浙江省有分布且適合作為砧木櫻屬植物為材料，以3年生籽播苗野生早櫻、山櫻、迎春櫻、尾葉櫻、華中櫻、浙閩櫻為砧木（郁李、毛櫻桃、雪落櫻和沼生矮櫻長(zhǎng)勢(shì)慢，不適合作為砧木；崖櫻、高盆櫻、散毛櫻、黑櫻桃和武夷紅櫻浙江區(qū)域無(wú)分布，亦不適合作為砧木），每個(gè)砧木20棵，以鐘花櫻枝條為接穗。嫁接實(shí)驗(yàn)于2023年2月開(kāi)始，砧木種植在種植袋中，種植袋大小為直徑 、高 ，基質(zhì)為黃土：泥炭：珍珠巖 = 5 ： 3 ： 2 C V ： V ： V ） ，接穗采集長(zhǎng)勢(shì)旺盛的母株，接穗上的芽保證為葉芽，避免嫁接接穗為花芽，否則接穗難以成活。嫁接完成后，后期定期進(jìn)行養(yǎng)護(hù)管理，每3＼～5d進(jìn)行一次澆水，為了避免假活現(xiàn)象出現(xiàn)，在2024年5月開(kāi)始統(tǒng)計(jì)每個(gè)砧木的嫁接成活率。

1.8數(shù)據(jù)分析

根據(jù)各分子標(biāo)記在相同電泳遷移率（相同分子量片段）的有無(wú)，統(tǒng)計(jì)得到所有位點(diǎn)的二元數(shù)據(jù)，

表217個(gè)多態(tài)性ESTSSRs的引物特征

有擴(kuò)增帶記為1，無(wú)帶記為0。利用軟件Popgen32計(jì)算等位基因數(shù)（numberof alleles， ）、有效等位基因數(shù)（numberof effective alleles， ）、觀察雜合度（observed heterozygosity， ）、期望雜合度（expectedheterozygosity， ）和Shannon's指數(shù) （ I ） ;利用軟件PowerMarkerv3.25計(jì)算多態(tài)信息含量（polymorphisminformationcontent，PIC）；利用軟件N T S Y S p c2 . 1 0 e 進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，建立親緣關(guān)系圖；采用Excel進(jìn)行嫁接成活率的統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果分析

2.1DNA提取質(zhì)量和最佳退火溫度的篩選

16個(gè)樣品 比值均在1.6至1.8之間，說(shuō)明提取的DNA質(zhì)量較好，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。在梯度PCR儀器上對(duì)所有引物的最佳退火溫度進(jìn)行篩選，篩選范圍為 ，以提高PCR擴(kuò)增效率，有利于得到清晰的聚丙烯凝膠電泳圖，減少實(shí)驗(yàn)誤差，其中圖1為部分合成引物最佳退火溫度的篩選。

M代表Mark，下同；PC1、PC3、PC6和PC8分別代表不同 引物。

MrepresentsMark，the same below；PC1，PC3，PC6and PC8 representdifferentprimers，respectively.

2.2EST-SSR引物的遺傳多樣分析

從Yoshiaki等（2009）開(kāi)發(fā)出的12對(duì)引物以及自己合成的38對(duì)引物中分別篩選出9對(duì)和8對(duì)用于全部材料的SSR擴(kuò)增，這17對(duì)引物共擴(kuò)增出98條帶，每條EST引物擴(kuò)增出條帶數(shù)為2＼～12，大多數(shù)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為3＼～9，每條引物平均擴(kuò)增出5.76條。有效等位基因數(shù)（ 為 1 . 1 6 ～ 7 . 6 4 ，平均值為3.22；觀察雜合度（ 為 0 . 0 4 ～ 0 . 5 4 ，平均值為0.28;期望雜合度 為 0 . 5 8 ～ 0 . 9 2 ，平均值為0.77;Shannon's指數(shù) （ I ） 為 1 . 3 8 ～ 2 . 6 5 ，平均值為2.14；多態(tài)信息含量（PIC）為 0 . 6 2 ～ 0 . 9 2 ，平均值為0.78（表3）。結(jié)果表明，鐘花櫻及其近緣種遺傳多樣性較為豐富，其中圖2為引物PC10在鐘花櫻及其近緣種的EST-SSR擴(kuò)增圖。

2.3聚類(lèi)分析

根據(jù)SSR擴(kuò)增結(jié)果，利用NTSYSpc2.10e軟件進(jìn)行Jaccard相似性系數(shù)分析，計(jì)算出它們之間的遺傳相似系數(shù)（genetic similaritycoefficient， ），其范圍為 ，具體見(jiàn)表4，其中鐘花櫻和高盆櫻遺傳相似系數(shù)最大（ ），武夷紅櫻和野生早櫻遺傳相似系數(shù)最?。?.6531）。由表4的遺傳相似系數(shù)可知，鐘花櫻與高盆櫻親緣關(guān)系最近 （ ），其次與崖櫻（ 0.8980）親緣關(guān)系也很近，但與野生早櫻（ 0.7755）、沼生矮櫻（ ）、黑櫻桃（ 0.7959）尾葉櫻（ ）等親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn);武夷紅櫻與高盆櫻（ ）、鐘花櫻（ 、迎春櫻（ ）等親緣關(guān)系最近，而與野生早櫻（ ）、黑櫻桃（ ）親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

通過(guò)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，構(gòu)建了16種櫻屬植物的聚類(lèi)關(guān)系圖（圖3）。由圖3可知，基本體現(xiàn)了16種櫻屬植物彼此之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。除了野生早櫻和黑櫻桃外，其余14份植物可聚為一大類(lèi)（圖3：I），其中鐘花櫻與高盆櫻聚在一起，崖櫻和雪落櫻聚在一起，山櫻和迎春櫻聚在一起，郁李和毛櫻桃聚在一起，散毛櫻和浙閩櫻聚在一起，尾葉櫻和沼生矮櫻聚在一起，武夷紅櫻和華中櫻聚在一起；野生早櫻和黑櫻桃與其余櫻屬植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，單獨(dú)聚類(lèi)。

2.4嫁接成活率分析

通過(guò)嫁接實(shí)驗(yàn)可知，華中櫻作為砧木嫁接鐘花櫻成活率最高，達(dá) 9 5 % ，野生早櫻作為砧木嫁接鐘花櫻成活率最低，為 40 % 。此外，山櫻作為砧木嫁接鐘花櫻成活率為 8 0 % ，浙閩櫻作為砧木嫁接

表317對(duì)EST-SSR引物在16種櫻屬植物中的遺傳信息

鐘花櫻成活率為 70 % ，尾葉櫻作為砧木嫁接鐘花櫻成活率為 6 5 % ，迎春櫻作為砧木嫁接鐘花櫻成活率為 5 5 % 。

3討論與結(jié)論

I表示14種親緣關(guān)系比較近的櫻屬植物，*表示親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種。

Iindicate14closelyrelated speciesofPrunus， indicate the species thataredistantlyrelated.

SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好以及技術(shù)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，目前已成功地應(yīng)用于植物物種分類(lèi)、鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建（AdamBlondonetal.，2004；Martinezetal.，2006）。EST-SSR是從功能基因組研究表達(dá)序列標(biāo)簽中獲得的一類(lèi)SSR標(biāo)記，該類(lèi)SSR標(biāo)記分布于功能基因內(nèi)部較為保守的轉(zhuǎn)錄區(qū)，參與基因編碼，序列較為保守，重復(fù)性高，因此，EST-SSR在物種間具有較好的通用性（Sahaetal.，2004）。前人研究認(rèn)為EST-SSR與基因組SSR（gSSR）在遺傳關(guān)系分析及分子水平上遺傳多樣性評(píng)價(jià)的研究結(jié)果是一致的，均能反映個(gè)體或群體間的遺傳差異和親緣關(guān)系，但EST-SSR擴(kuò)增結(jié)果比gSSR更穩(wěn)定，能降低條帶判讀的難度，同時(shí)也更能反映出個(gè)體或群體的遺傳變異（Chabane etal.，2005；La etal.，2005）。目前，EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和研究技術(shù)已經(jīng)比較成熟，已被許多植物廣泛應(yīng)用（婁永峰等，2022；儀澤會(huì)等，2023；邊境等，2023；Singhetal.，2023；呂文濤等，2024；Liuetal.，2024）。本研究利用17對(duì)EST-SSR引物在鐘花櫻及其近緣種共16份樣品檢測(cè)出98個(gè)等位基因，平均每個(gè)引物5.76個(gè)等位基因，Shannon's信息指數(shù)（I）平均值為2.14，觀察雜合度 平均值為0.28，期望雜合度 平均值為0.77，多態(tài)信息含量（PIC）平均值為0.78（每對(duì)

EST-SSR引物的PIC值均大于0.50），以上信息均表明本研究選擇的EST-SSR引物具有較高的多態(tài)性。本研究所得到的 I 平均值（2.14）和 平均值（0.77）高于何恒流等（2015）的 I 平均值（1.28）和 平均值（0.672）以及宗宇等（2016）的 I 平均值（0.775）和 平均值（0.384）。此外，本研究所得到的PIC平均值（0.78）高于從睿等（2020）的PIC平均值（0.73）和孫澤碩等（2023）的PIC平均值（0.77），表明EST-SSR標(biāo)記檢測(cè)的 和PIC均高于gSSR標(biāo)記。因此，利用EST-SSR分子標(biāo)記探討櫻屬植物遺傳多樣性和親緣關(guān)系要優(yōu)于gSSR等其他分子標(biāo)記，同時(shí)該分子標(biāo)記方法也可以作為一種分子輔助方法用于櫻屬植物物種分類(lèi)、種質(zhì)鑒定、育種以及新種或隱種的發(fā)現(xiàn)等。

雜交育種是增加生物變異性的一個(gè)重要方法，是目前運(yùn)用最為廣泛的一種常規(guī)育種方式。選擇適宜的、具有優(yōu)良性狀的親本可能獲得具有雙親優(yōu)良性狀的雜交后代。鐘花櫻是中國(guó)特有的野生資源物種，早春開(kāi)花，先花后葉，花色粉紅至深紅，十分艷麗，深受中國(guó)人的喜愛(ài)，是雜交育種親本的好材料。但是，其著花稀疏、色澤單一，盛花時(shí)花瓣不開(kāi)展，樹(shù)形不整齊，適應(yīng)性較差，目前大部分還處于野生狀態(tài)，缺乏人工馴化，育成品種較少，因此其野生資源具有極大的研究及商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值。然而，自前國(guó)內(nèi)有關(guān)鐘花櫻系的新品種大多通過(guò)實(shí)生選種或野外馴化所得，如‘狀元’（曾昭佳等，2023）、‘宗儒櫻‘（張偉等，2024），雜交所得新品種較少。可針對(duì)鐘花櫻的缺陷選擇具有適應(yīng)性較強(qiáng)、花白色、樹(shù)形優(yōu)雅、花期較晚的其他櫻屬植物與其進(jìn)行雜交，可能獲得超越雙親某一性狀或某幾個(gè)性狀的優(yōu)良雜交品種。由遺傳相似系數(shù)和聚類(lèi)結(jié)果可知，鐘花櫻與高盆櫻親緣關(guān)系最近而被聚類(lèi)在一起，這與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類(lèi)相一致，高盆櫻為鐘花櫻的近緣物種，不適宜與鐘花櫻進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，此外，鐘花櫻也與華中櫻等13個(gè)櫻屬植物聚為一大類(lèi)，它們彼此間親緣關(guān)系相對(duì)較近，均可認(rèn)為是鐘花櫻的近緣物種。黑櫻桃、野生早櫻與鐘花櫻相距較遠(yuǎn)，可考慮與鐘花櫻進(jìn)行相關(guān)雜交試驗(yàn)，尤其是野生早櫻，其樹(shù)勢(shì)健壯旺盛、樹(shù)形高大優(yōu)美、枝條細(xì)密、抗性強(qiáng)，是非常好的雜交育種材料。

目前，我國(guó)福建、廣東等地已經(jīng)開(kāi)始開(kāi)展鐘花櫻野生資源的引種馴化，但是種苗繁育主要采用播種、嫁接或扦插等方式，存在種苗分化嚴(yán)重、商品苗率低等問(wèn)題，尤其是櫻花實(shí)生苗需要度過(guò)至少4至5年的幼齡期才能到達(dá)成熟期而開(kāi)花結(jié)果，這大大增加了生產(chǎn)成本。此外，對(duì)生產(chǎn)中選育的具有花期早、花茂密、長(zhǎng)勢(shì)好和樹(shù)形美等優(yōu)良性狀的單株，不宜采用播種方法繁殖，而只能進(jìn)行組培、扦插和嫁接等無(wú)性方法繁殖。嫁接繁殖無(wú)疑是最經(jīng)濟(jì)有效的方法，在中國(guó)南方地區(qū)的生產(chǎn)實(shí)踐中，已經(jīng)見(jiàn)到以華中櫻為砧木、以鐘花櫻為接穗的高接苗木，二者親和性較好，其中華中櫻從南到北均有分布，分布十分廣泛，其適應(yīng)性、抗性、長(zhǎng)勢(shì)等方面都較好，是非常優(yōu)良的砧木。陳璋（2007）用食用櫻桃、毛櫻桃、山櫻和鐘花櫻作為砧木嫁接鐘花櫻，結(jié)論是食用櫻桃和鐘花櫻作為砧木嫁接成活率最高。周俐等（2021）使用華中櫻、尾葉櫻、野生早櫻3種野生櫻花作為砧木嫁接‘琉球緋櫻’‘中國(guó)紅'‘楚紅’‘楚錦’和‘鐘花櫻'5個(gè)鐘花櫻系櫻花品種，發(fā)現(xiàn)華中櫻作為砧木嫁接成活率最高。由遺傳相似系數(shù)可知，鐘花櫻與華中櫻的遺傳相似系數(shù)為0.8163，理論上凡是與鐘花櫻遺傳相似系數(shù)高于0.8163的均可作為其砧木的選擇對(duì)象，如山櫻、迎春櫻、散毛櫻、浙閩櫻等，但還應(yīng)考慮砧木的抗性、長(zhǎng)勢(shì)、繁殖和壽命等因素。通過(guò)嫁接實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)華中櫻和山櫻作為砧木嫁接鐘花櫻成活率最高（ ≥ 8 0 % ），這與周俐等（2021）實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。浙閩櫻次之（ 7 0 % ），這與分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，然而迎春櫻較低（ ? 6 0 % ），不太適合作為嫁接鐘花櫻的砧木，這與分子實(shí)驗(yàn)相違背，這可能與本研究?jī)H采用EST-SSR標(biāo)記有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步研究，后續(xù)將加入基因組SSR（gSSR）用于櫻屬植物親緣關(guān)系的分析。

本研究利用EST-SSR分子標(biāo)記對(duì)鐘花櫻及其近緣種進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系的探討，結(jié)果表明鐘花櫻及其近緣種共16個(gè)櫻屬物種遺傳多樣性較高，鐘花櫻與高盆櫻等13個(gè)櫻亞屬植物親緣關(guān)系較近，而與野生早櫻和黑櫻桃相對(duì)較遠(yuǎn)，因此可選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，如野生早櫻和黑櫻桃，可選擇親緣關(guān)系比較近的作為砧木，如華中櫻和山櫻等。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究鐘花櫻及其他野生櫻花資源的物種分類(lèi)、物種資源保護(hù)利用、砧木的選擇和雜交親本選擇等提供了分子水平依據(jù)和技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴 李莉）