中圖分類號：Q943 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3142（2025）04-0628-13

Molecular mechanism of the colour spot formation in Paeonia delavayi petals

LI Haiqing'，DU Chun2，WANG Juan2*， ZHANG Huaibi3（1.ColegeofditUniversityKungO，a；3.ZedIsiuteforntamp;odsechLiedalestoto，Zd）

Abstract：To investigatethe molecular mechanisms of colour spotformation inPaeonia delavayi petals，this study used yellow petals of P .delavayi with and without colour spot as experimental material.Utilizing the Ilumina platform for transcriptome sequencing and the UPLC system for metabolome analysis，the keydiferentially expressed genes （DEGs）

and transcription factors affecting colour spot formation in P .delavayi were screened. The resultswere as follows：（1） The transcriptome sequencing yielded 63 981 Unigenes with an average length of 8 0 5 b p ，and 6 8 . 2 4 % of these Unigenes wereannotated.Atotalof19496DEGs wereidentified，of which41DEGs were involved inflavonoidbiosynthesisand DFR，CHS，and C H I structural genes showed significant differential expression. Among the obtained 37 MYB transcription factors，oneR2R3-MYB transcription factor，PdMYB3O，was found to playa significant role in promoting colour spot formation.（2）Targeted analysis using the UPLC-MS/MS platform detected 44 anthocyanin compounds.（3） The expresion trends of DEGs identified by RNA-seq were consistent with theqRT-PCR results.Insummary，the colour spot formation of P .delavayi is mainly influenced by anthocyanins.The transcription factor PdMYB3O ispositively correlated with the structural genes CHS， C H I ，and DFR during the yellow flower with red spot bud stage（B-S1） due to their similar highexpressonlevels.Itispredicted that PdMYB3Omayactasa positiveregulator in theflavonoid biosynthesispathway，enhancing theexpression levelsof structural genesinvolved inflavonoidbiosynthesis，thereby promoting theacumulationofanthocyanins intheplant.Thisstudyprovidesascientificbasis fordeveloping efficient breeding techniques for P .delavayi.

Key words：Paeonia delavayi，colour spot formation，transcriptome，metabolome，diferentially expressed genes （DEGs）

芍藥屬植物作為世界范圍內(nèi)享有盛譽的觀賞植物，其來源于中國，擁有源遠(yuǎn)流長的栽培歷史和育種傳統(tǒng)（Zhouetal.，2014）。牡丹（Paeoniasuffruticosa）是中國最著名的傳統(tǒng)花卉之一，以其花朵碩大、色彩鮮艷、造型獨特而聞名于世界各地。目前，全球有超過2000個品種具有各種花瓣色素圖案，如斑點、條紋和更復(fù)雜的圖案。色斑指在花瓣的不同位置出現(xiàn)的具有特定紋絡(luò)、圖案的異色斑點和條紋，色斑作為花色的一種特殊表現(xiàn)類型。其大小、顏色和分布不僅對牡丹的觀賞價值有重要影響，而且對傳粉動物具有一定吸引力，進而會對牡丹的繁殖產(chǎn)生一定影響（張艷麗等，2011）。在牡丹組植物中，兩種野生物種P.rockii和滇牡丹（P.delavayi）產(chǎn)生帶有色斑的花瓣，因花瓣色斑的顯性遺傳性狀可以在其后代中觀察（Shietal.，2017）。滇牡丹被列入國家二級重點保護野生植物（李奎，2014），它們分布于中國西南山地，以云南的西北部為其分布中心，生長于海拔1 9 0 0 ～ 3 6 0 0 m 的山地樹林邊緣、山地陽坡及草坪上。其花瓣顏色多樣，從白到紅，再到紫，每一種顏色都會產(chǎn)生一系列的漸變且在花瓣基部會出現(xiàn)一些深淺、大小各異的色斑（劉磊等，2019）。因此，滇牡丹花瓣表型上形態(tài)和顏色極為豐富，色斑作為植物花瓣進化的顯著特征，不僅反映了自然選擇的影響，也是人工培育中追求的重要方向，對現(xiàn)代花卉產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展具有深遠(yuǎn)的意義（Cooleyamp;Willis，2009），同時作為培育新品種育種材料和基因資源具有極高的保護和研究價值（史倩倩，2015）。根據(jù)其花瓣顏色和色斑形狀，仍能將它們劃歸到一個容易辨認(rèn)的類別中（李想，2019）。然而，目前尚無法通過傳統(tǒng)的雜交方法來繁殖具有特定色斑的牡丹品種。因此，研究滇牡丹的色斑產(chǎn)生的分子機制，為今后進行精準(zhǔn)的牡丹品質(zhì)選擇和培養(yǎng)提供了重要參考依據(jù)。

花瓣及其色斑顏色變化通常由花青素積累的種類和濃度決定（Wangetal.，2004）?；ㄇ嗨卦谀档せò昊看罅糠e累而導(dǎo)致色斑形成（Zhangetal.，2007）。花瓣基部色斑不僅在物種繁育上發(fā)揮重要作用，而且還具有重要的觀賞和商業(yè)價值，但其形成機理的研究卻鮮有報道（Luanetal.，2023）?；ㄇ嗨刈鳛橹参镏兄匾拇紊x產(chǎn)物，花瓣色斑呈色是一個非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，既受到環(huán)境因素的影響，也與植物體內(nèi)的花色素合成代謝過程緊密相關(guān)（Tanakaetal.，2008）。Yamagishi等（2013）研究表明，花瓣及其色斑的形成受到遺傳控制，然而其分子機制尚不完全清楚。在花瓣中，一個或多個花青素結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄變異會導(dǎo)致色斑的顏色生成，與非色斑區(qū)相比，花青素是色斑區(qū)的主要色素（Zhangetal.，2007）。研究顯示 C H S ， F 3 H ， D F R 和ANS4個花青素生物合成相關(guān)基因在牡丹品種‘Jinrong’的紫色斑點區(qū)域顯著高表達（Zhangetal.，2015），同樣牡丹品種‘Paeoniarockii’中的PrMYB5轉(zhuǎn)錄因子激活PrDFR基因，促進了色斑的生成（Shietal.，2022）。這些研究為滇牡丹色斑形成的機理研究提供了重要參考。Luan等（2022）認(rèn)為牡丹中 P s M Y B 3 0 是斑點形成的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控和激活了參與花青素生物合成的下游 P s A N S 基因。綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子對色斑的調(diào)控具有重要的參考意義，在不同類型的轉(zhuǎn)錄因子中，MYB對于控制類黃酮生物合成通路至關(guān)重要，與類黃酮生物合成相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為在亞組中具有保守功能，對花青素生成具有轉(zhuǎn)錄激活作用（Tohgeetal.，2005）。

滇牡丹不僅花瓣顏色表型豐富，而且還在花瓣基部形成形狀、大小和顏色深淺不一的色斑，然而對其色斑形成的分子機理的研究鮮有報道。因此，本研究以滇牡丹復(fù)合群（洪德元，2016）（Paeoniadelavayicomplex）的2種表型的植株，即無色斑黃色花瓣植株和黃色花瓣基部帶紅色斑塊植株（圖1）為研究材料，采用RNA-seq技術(shù)對2種表型植株花瓣的硬蕾期和盛花期進行轉(zhuǎn)錄組測序和代謝組測序，擬解決以下科學(xué)問題：（1）影響滇牡丹色斑形成的關(guān)鍵基因；（2）滇牡丹2種表型植株花瓣的花青素含量差異；（3）滇牡丹轉(zhuǎn)錄因子PdMYB30對色斑形成的調(diào)控激活作用。研究結(jié)果不僅能為牡丹新品種培育工作和調(diào)控色斑基因的研究提供理論依據(jù)，還能為木本觀賞植物色斑形成機理的研究補充豐富的案例進而發(fā)揮重要的參考價值。

RIN）設(shè)置在6.5以上。對樣品進行檢測并確保其質(zhì)量合格后，由北京諾禾致源生物信息技術(shù)有限公司創(chuàng)建cDNA文庫并進行Illumina測序。

1.3代謝物分析

將采集的滇牡丹花瓣裝人凍存管后迅速放入液氮罐冷凍保存，使用球磨儀（德國Retsch公司） 研磨至粉末狀，每例樣品稱取50mg，加入 5 0 0 μ L 的 80 % 甲醇，渦旋混勻，冰浴中超聲 離心 1 5 m i n ，取上清液進行LC-MS分析。對樣品數(shù)據(jù)使用超高效液相色譜系統(tǒng)（UPLC）及色譜柱（ACQUITY BEH ）進行分離。其中，進樣量2μ L ，柱溫 4 0 % ，流速 ;色譜流動相A為超純水（加入 0 . 1 % 的甲酸），流動相B為甲醇（加入 0 . 1 % 的甲酸）。

1.4轉(zhuǎn)錄組基因表達分析及基本注釋

通過Q20、Q30指標(biāo)以及GC值，用以評估轉(zhuǎn)錄組清潔數(shù)據(jù)的質(zhì)量。使用Trinity（ 完成轉(zhuǎn)錄組組裝，基于以下數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋。使用BLAST軟件（version2.2.26）將它們與基于NR數(shù)據(jù)庫（NCBI非冗余）Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫以及COG和GO數(shù)據(jù)庫進行注釋。轉(zhuǎn)錄本豐度（讀取計數(shù)）由RSEM估計，使用Trinity剪接作為參考序列，并將清潔樣本讀數(shù)映射到參考序列，采用FPKM方法衡量基因的表達水平。

1.5差異基因和基因功能分析

1材料與方法

1.1實驗材料

實驗材料均采自海拔 的梁王山滇牡丹資源收集圃（ E、 。選擇無色斑黃色花瓣和黃色花瓣基部帶紅色斑塊的2種表型的滇牡丹植株，分別采集硬蕾期（被花萼完全緊實包裹的花蕾）和盛花期（花瓣展開，雌雄蕊可見）2個發(fā)育階段的花瓣（圖1），保存在液氮中帶回實驗室儲存在 冰箱作為實驗材料。每種表型選擇3個植株，作為3個生物學(xué)重復(fù)，采集2個發(fā)育階段的花瓣。

1.2轉(zhuǎn)錄組測序

通過采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，使用RNANano6O0OAssayKit定量總RNA樣本的質(zhì)量、濃度及其完備程度，使用超過 1 . 5 μ g 的總RNA，每個樣品的RNA 完整性數(shù)（RNA integritynumber，

采用Illumina技術(shù)對滇牡丹2種表型植株花瓣進行測序分析，并對Unigenes進行組裝，用于樣本組之間差異表達的后續(xù)分析。通過錯誤發(fā)現(xiàn)率（fault discovery rate，F(xiàn)DR） ? 0 . 0 1 和倍數(shù)變化 ? 2 且 P value ? 0 . 0 5 為篩選差異表達基因（differentiallyexpressedgenes，DEGs）標(biāo)準(zhǔn)，來找出類黃酮生物合成通路中的DEGs。通過KOBAS（KEGG Orthology-Based Annotation System）軟件測試KEGG通路中DEGs的統(tǒng)計富集度。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢索轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量和類型，對比到其他植物花瓣色斑形成的研究中，進一步挖掘影響滇牡丹色斑形成的關(guān)鍵基因。

1.6滇牡丹PdMYB30轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和分析

通過對滇牡丹2種表型植株花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄因子序列進行深度檢索，獲得了滇牡丹PdMYB30（Mix-74_transcript_142862）的詳細(xì)序列注釋信息。此外，從擬南芥數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站TAIR

NB-S1.無色斑黃花硬蕾期；NB-S2.無色斑黃花盛開期；

B-S1.紅色斑黃花硬蕾期；B-S2.紅色斑黃花盛開期。

NB-S1.Yellow flower without colour spot bud stage；NB-S2. Yellowflowerwithout colour spot blooming stage；B-S1.Yellow flowerwithredspotbud stage；B-S2.Yellowflowerwithred spot blooming stage.

（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）下載擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列，同PdMYB30進行系統(tǒng)發(fā)育分析來預(yù)測其功能。借助轉(zhuǎn)錄因子差異基因表達熱圖，將與色斑形成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子進行聚類分析。

基于NCBI的BLAST結(jié)果，選擇了與PdMYB30氨基酸同源性較高的物種序列進行多重序列對比分析，并使用DNAMAN6.0.3.99軟件對PdMYB30（Mix-74_transcript_142862）和其他植物的一些與花青素生物合成及色斑形成相關(guān)的R2R3-MYB蛋白進行了多序列比對。通過MEGA11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并采用bootstrap方法進行了檢驗，測試次數(shù)為1000次。

1.7影響色斑形成相關(guān)基因?qū)崟rqRT-PCR分析

為了驗證滇牡丹測序數(shù)據(jù)的每百萬個映射讀取的轉(zhuǎn)錄本每千堿量片段數(shù)（fragmentsperkilobases of transcripts read per million maps，F(xiàn)PKM）的準(zhǔn)確性，選取類黃酮生物合成通路中差異表達的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子在2種表型的滇牡丹植株花瓣的2個時期進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析。cDNA合成采用AQ601（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）試劑盒。采用TBtools進行特異性引物設(shè)計（表1）。滇牡丹所選Actin為內(nèi)參基因，采用TRANSBIOTECH試劑盒（貨號為AQ601）并按照說明書進行實驗，在7500Real-timePCR儀器中進行3次生物學(xué)重復(fù)qRT-PCR檢測，再通過 分析來估算其表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量分析

通過對2種表型植株花瓣2個發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，無色斑黃色花硬蕾期花瓣（NB-S1）、無色斑黃色花盛開期花瓣（NB-S2）、紅色斑黃色花硬蕾期花瓣（B-S1）和紅色斑黃色花盛開期花瓣（B-S2）的基因讀數(shù)、基數(shù)、GC含量等為3個生物學(xué)重復(fù)測序的最小值到最大值的范圍（表2），共獲得 的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，經(jīng)過去除冗余后剩余230447987干凈讀數(shù)（cleanreads），GC含量范圍為 4 4 . 3 2 % ～ 4 5 . 3 2 % 。此外，Q20 堿基均不低于 9 8 . 0 8 % ，Q30堿基不低于 9 4 . 3 2 % ，表明測序質(zhì)量良好，干凈數(shù)據(jù)（cleandata）質(zhì)量符合要求，數(shù)據(jù)可信度高。

通過Trinity軟件分析，共獲得63981個單基因，包含 35164 323個堿基，N50 長度為 9 9 1 b p 其中最短的為 ，最長的為 ，平均長度為 8 0 5 b p 。

2.2代謝物分析

為了探究滇牡丹種間色斑形成的原因，用同時采集的2種表型植株3個生物學(xué)重復(fù)的實驗材料，通過UPLC-MS/MS平臺靶向測定樣品中的花青素、類黃酮生物合成途徑進行代謝組檢測。每種花瓣進行3次生物學(xué)重復(fù)，并對其所含花青素進行定性定量分析。由圖2可知，共檢測到44種花青素化合物，主要分為三類，即9種矢車菊素（cyanidin）、7種天竺葵素（pelargonidin）和6種飛燕草素（delphinidin）。還有其衍生色素其中包括4種矮牽牛素（petunidin）、3種錦葵色素（malvidin）和10種芍藥花素（peonidin），并且有紅色斑的黃色花瓣中的花青素含量顯著高于純黃色花瓣。其中，檢測出來的黃酮類化合物（flavonoid）最高主要有3種，即柚皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（異槲皮苷）和柚皮素-7-0-葡萄糖苷，在帶有紅斑的黃色花瓣中檢測到2種原花青素B3和原花青素B2，純黃色花瓣中未檢測到原花青素，2種表型花瓣的花青素含量也有顯著性差異，其中芍藥花素-3，5-0-二葡萄糖苷在帶紅斑的黃色花瓣中的含量高出純黃色花瓣30倍。

2.3滇牡丹花瓣組織轉(zhuǎn)錄組Unigenes注釋

通過數(shù)據(jù)庫比對獲得轉(zhuǎn)錄本的注釋信息（ E ? ），總共注釋到43661個轉(zhuǎn)錄基因序列，占總數(shù)的 6 8 . 2 4 % （Unigenes總數(shù)為63981個），也說明還有 3 1 . 7 6 % 的Unigenes缺少注釋信息。注釋到NR數(shù)據(jù)庫和 e g g N O G 數(shù)據(jù)庫中的基因較多，標(biāo)注比例分別為43161個（ 6 7 . 4 6 % 和41485個0 6 4 . 8 4 % ）。其次是GO數(shù)據(jù)庫，注釋到32138個，占Unigenes 總數(shù)的 5 0 . 2 3 % 。此外，Swiss-Prot、Pfam、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫的注釋數(shù)分別為29515個（ 4 6 . 1 3 % ）、27543個（ 4 3 . 0 5 % ）、26132個（ 4 0 . 8 4 % ）和21435個 （ 3 3 . 5 0 % ）。其中，COG數(shù)據(jù)庫的注釋成功率最低（13693個， 2 1 . 4 0 % ）。在所有注釋到的Unigenes中，長度為 3 0 0 ～ 1 0 0 0 bp的共有30402個，占總數(shù)的 6 9 . 6 3 % ；有11263個Unigenes長度大于 1 0 0 0 b p ，占總數(shù)的 2 5 . 8 0 % ;有 4 . 5 8 % 的Unigenes長度小于 3 0 0 b p 。這說明基因序列拼接不完全，沒有注釋到的Unigenes還有很多，可能會影響后續(xù)基因功能驗證。

通過序列比對尋找同源物種，滇牡丹基因與NR比對到的最多的物種是葡萄（Vitisvinifera）（ 1 5 . 1 1 % ），其次是栓皮櫟（Quercussuber） （ 5 . 9 5 % ） ）、胡桃（Juglansregia）（ 4 . 4 8 % ）、荷花（Nelumbionucifera） （ 3 . 2 4 % ）、巴西橡膠（Heveabrasiliensis）（ 2 . 8 3 % ）等。使用KOG數(shù)據(jù)庫進行同源蛋白注釋，結(jié)果僅獲取26132個基因的相關(guān)注釋且這些單基因顯著富集在25個大類中。為了進一步了解單基因的生物學(xué)功能，對顯著表達基因進行GO富集分析。結(jié)果顯示，32138個基因被成功注釋并劃分為三大類，包括56個GO功能條目。

2.4差異表達分析

通過比較2種表型植株不同發(fā)育階段花瓣的FPKM值發(fā)掘花瓣發(fā)育過程中的DEGs，總共有19496個基因在不同發(fā)育階段差異表達。NB-S2vsB-S2、NB-S1vsB-S1、B-S1vsB-S2、NB-S1vsB-S2、NB-S2vsB-S1中分別有5488個、9224個、9513個、13649個和11973個DEGs（圖3）。其中，NB-S1vsB-S2比較檢測到DEGs最多，上調(diào)轉(zhuǎn)錄本7946個和下調(diào)轉(zhuǎn)錄本5703；NB-S2vsB-S2比較檢測到DEGs最少，上調(diào)轉(zhuǎn)錄本3442個和下調(diào)轉(zhuǎn)錄本2046個;在硬蕾期2種花色NB-S1vsB-S1上調(diào)表達的轉(zhuǎn)錄本5652個DEGs比下調(diào)表達3572個DEGs高很多，說明純黃色硬蕾期和紅色斑黃色花瓣盛開期基因最多，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)別也更為復(fù)雜。

在DEGs的KEGG分類方面，我們通過搜索KEGG數(shù)據(jù)庫進一步分析了Unigenes，在19496個DEGs中的4709個被分配到5個主要類別（圖4），其中前49個通路的DEGs被分配到5個主要類別，即3個細(xì)胞過程（269個基因）、36個代謝通路（1186個基因）、1個環(huán)境信息處理通路（97個基因）、8個遺傳信息處理通路（3042個基因）、1個有機系統(tǒng)（115個基因）。最顯著富集的通路為核糖體，其次為碳代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、淀粉和蔗糖代謝及氨基酸的生物合成通路。而色斑的形成與花青素積累相關(guān)（齊方婷和黃河，2023）。因此，重點關(guān)注了與花青素形成相關(guān)的類黃酮生物合成途徑，有41個DEGs參與了與花青素生物合成相關(guān)的類黃酮生物合成通路（ k o 0 0 9 4 1） ，可能影響了該代謝途徑。

2.5類黃酮生物合成通路DEGs分析

通過DEGs分析及其功能注釋顯示，差異顯著的3個基因在2種表型花瓣2個發(fā)育時期的表達模式有顯著性差異（表3），即Mix-74_transcript_

1.內(nèi)吞作用；2.吞噬體；3.過氧物酶體；4.植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；5.RNA 運輸；6.植物-病原互作；7.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工； 8.核糖體；9.真核生物中的核糖體生物起源；10.蛋白酶體；11.RNA 降解；12.mRNA監(jiān)視通路；13.泛素介導(dǎo)的蛋白水解； 14.碳代謝；15.氨基酸的生物合成；16.淀粉和蔗糖代謝；17.內(nèi)吞作用；18.氧化磷酸化；19.糖酵解/糖異生；20.胱氨酸和蛋 氨酸代謝；21.苯丙類生物合成；22.氨基糖和核苷酸糖的代謝；23.谷胱甘肽代謝；24.丙酮酸代謝；25.光合生物中的碳固定； 26.戊糖和葡萄糖酸鹽的相互轉(zhuǎn)化；27.脂肪酸代謝；28.氧物酶體；29.乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝；30.檸檬酸循環(huán)（TCA循 環(huán)）；31.嘧啶代謝；32.吞噬體；33.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝；34.戊糖磷酸途徑；35.抗壞血酸和醛酸鹽代謝；36.萜類 骨架生物合成；37.脂肪酸降解；38.苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；39.2-氧羧酸代謝；40.果糖和甘露糖代謝；41.半 乳糖代謝；42.脂肪酸生物合成；43.氰胺酸代謝；44.亞麻酸代謝；45.氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解；46.丙氨酸、天冬氨 酸和谷氨酸代謝；47.精氨酸和脯氨酸代謝；48.甘油磷酸新陳代謝；49.光合作用；50.酪氨酸代謝；51.葉啉和葉綠素代謝； 52.類黃酮生物合成；53.植物與病原體互作。

1.Endocytosis；2.Phagosoe；3.Peroxisome；4.Planthoronesignaltrasduction；5.RNAtrasport；6Plant-pathogeniteractio；7. Proteinprocessngindoplasmicreticulu；8.bosoe；9.bosomebiognsisinukayotes；10.Proteasoe；.RNAdgrdation; 12.mRNAsuveilancepathay；3.Ubiqitinediatedproteolysis；4.Carbometabolis;15.iosytsisofminocids；.Stad sucrosemetabolis；7.Edocsis8.Oxatiesphorytio；19.Glyolis/lucoesis；.Cteeadeteals； 21.Phenylpropanoidbosythsis；2.Aminosugaradnucleotidesugarmetabolism；2.Glutathionemetabolism；24.Pyruvatemeabols； 25.Carbonfixationinphotostheticorganisms；6.Pentoseandglucuronateinterconversions；7.Fatyacidmetabolism；28.Peroisoe; 29.Glyoxylatenddicarboxylatemetabolism;30.Citrateccle（TCAcycle）；31.Pyriidinemetabolism；32.Phagosoe;3.Giie andthreoninemetabolism；34.Pentosephosphatepathway；35.Ascorbateandaldaratemetabolism；36.Terpenoidbackbonebiosythsis; 37.Fatyaciddgadio；38.Penylalaine，tysineandrytoanossis；39.-Oxocaboxyliccidmetabis；40.uctoa manosemetablism；41.Galactosemetabolism；4.Fatyacidbiosythesis；43.Cynoaminoacidmetablism;4.Linolenicacidtabolis； 45.Valine，leucineandisoleucinedegrdation；46.Aanine，aspartateandlutamatemetabolism；47Arginineandprolinemetabolism； 48.Glycerophosphatemetabolism；49.Photosythesis；0.yrosinemetabolism；51.Porphyrinandchlorophyllmetabolism；52.Favod biosynthesis；53.Plant-pathogen interaction.

134155、Mix-74_ transcript_148408 和 Mix-74_transcript_133469在帶紅色斑的黃色花瓣硬蕾期均高表達，它們分別編碼為CHS、CHI和DFR，在B-S1紅色斑黃色花中PdCHS、PdCHI和PdDFR的表達水平顯著高于NB-S1無色斑黃色花瓣，預(yù)測它們對滇牡丹色斑的形成有影響。

2.6轉(zhuǎn)錄因子表達模式分析

通過預(yù)測蛋白序列與plantTFdb之間的hmmscan分析有2058個轉(zhuǎn)錄因子，其中MYB及其家族的轉(zhuǎn)錄因子有101個，刪除結(jié)構(gòu)域完整度低于 30 % 的序列后有73個MYB家族基因，再去掉重復(fù)項后注釋出來37個MYB家族基因。為研究MYB之間的系統(tǒng)進化關(guān)系，使用MEGA11.0.13構(gòu)建NJ（neighbor-joining）樹表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子在進化樹中劃分清楚（圖5：A），相同類型MYB轉(zhuǎn)錄因子聚為一類，擁有相同的保守結(jié)構(gòu)域。對差異表達顯著的29個MYB轉(zhuǎn)錄因子和3個結(jié)構(gòu)基因進行注釋，并根據(jù)3個生物學(xué)重復(fù)的FPKM平均值構(gòu)建的表達熱圖（圖5：B）顯示，轉(zhuǎn)錄因子Mix-74_transcript_142862的表達在NB-S1、B-S1和B-S2階段有較高的表達量，與其他MYB成員存在顯著性差異。Mix-74_transcript_142862鑒定為MYB亞組S1成員，命名為PdMYB30，由1261個核苷酸組成，編碼326個氨基酸殘基。同時轉(zhuǎn)錄因子PdMYB30（Mix-74_transcript_142862）與結(jié)構(gòu)基因CHS（Mix-74_transcript_134155）、CHI（Mix-"transcript_148408）和DFR（Mix-74_transcript_133469）由于相似的高表達而呈正相關(guān)，預(yù)測PdMYB30（Mix-74_transcript_142862）可能是色斑形成的正調(diào)節(jié)因子。

表3色斑形成相關(guān)的差異表達基因

2.7PdMYB30蛋白多序列比對與系統(tǒng)進化分析

在測序滇牡丹花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，獲得了1個與色斑花青素生物合成調(diào)控相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子PdMYB30，比對NCBI非冗余蛋白序列NR數(shù)據(jù)庫，并且經(jīng)BLAST搜索在多種被子植物物種中發(fā)現(xiàn)了許多R2R3-MYB同源物，其氨基酸同一性 gt; 5 0 % 。其中，包括來自牡丹‘HighNoon‘品種中的 P s M Y B 3 0 （GenBank登錄號：OM994392）且為PdMYB30的同源基因，但這2個基因中存在6個氨基酸取代，同時作為激活劑在多個水平上協(xié)同影響色斑花青素生物合成網(wǎng)絡(luò)。與PsMYB30一樣，PdMYB30在N端含有高度保守的R2和R3結(jié)構(gòu)域，表明它屬于典型的R2R3-MYB家族（圖6：A）。PdMYB30與其他花青素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子一起聚類到R2R3-MYB激活子系統(tǒng)發(fā)育樹中（圖6：B）。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，PdMYB30與影響花瓣色斑形成調(diào)節(jié)的MYB處于同一進化枝，包括PrMYB5a、PsMYB12、OgMYB1 和 PeMYB11（Chiou amp;Yeh，2007；Gu et al.，2019；Hsu etal.，2019），以及對花青素有促進作用的MYB，如PsMYB12L、VvMYBA1、PsMYB58和AtMYB113（Theologis et al.，2000； Zhang et al.， 2019； Zhangetal.，2021）。因此，推測PdMYB30是促進花瓣色斑形成的轉(zhuǎn)錄因子。

黑實線代表R2和R3DNA結(jié)合重復(fù)序列。PdMYB30用 表示。從GenBank檢索蛋白質(zhì)序列，其ID如下：VvMYBA1.樺葉葡萄（KC3426551）；VvMYBA2.樺葉葡萄（BAA2339.1）；PsMYB58.牡丹（MW429211）；PhAn2.矮牽牛（AAF66727）；PsMYB57.牡丹（MK377244）；MdMYB10.蘋果（ABB84753.1）；AtMYB113.擬南芥（AEE34501）；PsMYB30.牡丹（UPL51472.1）；OgMYB1.文心蘭（ABS58501.1）；PeMYB11.蝴蝶蘭（AIS35928）；FtMYB2.苦蕎麥（JF313346）；PrMYB5.紫斑牡丹（c117848）；PsMYB12.牡丹（QIG55705.1）；FtMYB1.苦蕎麥（JF313344）；EsMYBF1.光葉淫羊藿（KU365320）；AtMYB12.擬南芥（NP_182268.1）；PsMYB12L.牡丹（QBK15080）；VvMYBF1.擬南芥（FJ948477.2）。ThsolidlacklinesrepresentR2andR3DNAbindingrepeats.PdMYB30isrepresentedby*RetrievetheproteinsequencefromGenBankwiththefollwingI：VMYBA1.Vitisbetulifoli（AH68552）；VMYBA.V.betulifoli（BAA2339.1）；sMYB58.Peontco（MW429211）；PhAn2.Petuniahybrida（AAF6627）；PsMYB57.Paeoniasuffuticosa（MK377244）；MdMYB10.Malusdomestic（ABB84753.1）；AMYB113.Arabdopsis thaliana（AEE34501）;PsMYB30Peoniasufrutcos（UPL51472.1））;OgMYB1.Onciduhyrd（ABS58501）；PeMYB11Phalaenopsisequestris（AIS35928）；FtMYB2.Fagopyrumtataricum（JF31336）；PrMYB5.Paeoniaocki（c117848）;PsMB12.P.suffuticosa（QG5575.1）；FtMB1.Fagopyrumtataricu（JF31344）；EsMBF1.Epimdiumsgiatum（KU365320）;AtMB12.Arabidopsis hliana（82268.1）；PsMYB12L.Paeoiasufuticosa（QBK1508）；VMB1.Vitisifera（FJ948477.2） .

圖6PdMYB30蛋白與促進花青素合成相關(guān)MYB氨基酸序列比對（A）和系統(tǒng)發(fā)育樹（B）

2.8關(guān)鍵差異表達基因qRT-PCR驗證

通過qRT-PCR對類黃酮生物合成通路中的3個結(jié)構(gòu)基因和1個轉(zhuǎn)錄因子在2種表型2個發(fā)育時期的花瓣中進行驗證，圖7結(jié)果顯示4個基因表達趨勢與RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，它們均在紅色斑黃色花瓣硬蕾期高表達，說明RNA-seq的測序結(jié)果與qRT-PCR的實驗驗證結(jié)果一致，反映了轉(zhuǎn)錄組生物信息預(yù)測的可靠性。

3討論與結(jié)論

花瓣顏色的強度變化是由花青素的濃度和成分決定（Gaoetal.，2016），參與花青素合成的結(jié)構(gòu)基因是整個色斑形成中的關(guān)鍵基因模塊（Zhangetal.，2015），在色斑形成的過程中，結(jié)構(gòu)基因的差異表達影響著不同花青素物質(zhì)的積累，花青素的成分和比例而又決定了牡丹色斑的顏色（Zhangetal.，2007），在牡丹‘HighNoon’中芍藥花素-3，5-o -二葡萄糖苷是牡丹色斑區(qū)花青素的主導(dǎo)成分，在整個花瓣發(fā)育過程中其含量始終超過 5 7 . 1 % ，導(dǎo)致色斑呈現(xiàn)紅色（Luanetal.，2022）。本研究針對滇牡丹2種表型植株3個生物學(xué)重復(fù)共檢測到44種花青素類物質(zhì)，其中純黃色花瓣中檢測出來23種代謝物而在紅色斑黃色花瓣中檢測到37種代謝物。2種表型植株花瓣中的色素并不相同且在紅色斑黃色花瓣的芍藥花素-3，5-0-二葡萄糖苷高于純黃色花瓣30倍。在純黃色花瓣中，僅檢測到少量花青素，表明黃色花瓣主要由黃酮類化合物起到呈色作用，而芍藥花素-3，5-0-二葡萄糖苷是滇牡丹色斑形成的色素基礎(chǔ)，這與前人在牡丹‘HighNoon’中的研究結(jié)果一致（Luanetal.，2022）。在轉(zhuǎn)錄組中黃酮類生物合成通路顯著富集在NB-S1vsB-S1差異組合中，發(fā)現(xiàn)3個結(jié)構(gòu)基因（CHS、CHI、DFR）在紅色斑黃色花瓣B-S1硬蕾期顯著高表達，推測這些結(jié)構(gòu)基因的差異表達可能是導(dǎo)致花瓣中呈現(xiàn)色斑的主要原因（Lietal.，2014）。Gu等（2019）研究表明，CHS是花青素生物合成中的關(guān)鍵酶，CHS活性喪失通常會導(dǎo)致花朵白化。Gu等（2019）報道了 P s M Y B 1 2 與蛋白質(zhì)復(fù)合物中的PsbHLH和 P s W D 4 0 相互作用，并直接激活 P s C H S 表達， P s C H S 為后續(xù)花青素的產(chǎn)生提供了充足的底物，這有助于紫斑的生成。CHI已在多種植物中被克隆，其基因功能也已得到驗證。抑制CHI的表達會使花瓣顏色由紅色變?yōu)榘咨⊿aitoetal.，2011）。Luan等（2022）研究表明，在分子水平上，花青素生物合成相關(guān)基因CHS、DFR和ANS均表現(xiàn)出斑點區(qū)域的表達水平較高，并且與花青素積累呈正相關(guān)?；ㄇ嗨厣锖铣上嚓P(guān)途徑及其機制已被廣泛研究，并且眾所周知在高等植物中高度保守（Zhaietal.，2023）。此外，關(guān)于牡丹花青素生物合成的報道更集中于下游結(jié)構(gòu)基因，特別是二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）和花青素合酶（ANS），它們在紅色花瓣中高表達并負(fù)責(zé)形成牡丹中紅色斑點和雜色花瓣顏色的變化（Luanetal.，2022，2023）。以上研究證實本文中的3個結(jié)構(gòu)基因是影響色斑生成的基因，與本文結(jié)果一致揭示了與滇牡丹花瓣色斑形成相關(guān)的關(guān)鍵色素和相關(guān)生物合成基因的變化。

MYB轉(zhuǎn)錄因子對花青素的正向或負(fù)向的調(diào)控作用決定了色素物質(zhì)的有無，從牡丹花中已經(jīng)分離出幾種促進花青素合成的調(diào)控基因，包括PsMYB57、PsMYB12L、PsMYB113和PsMYB114（Zhangetal.，2020;Maoetal.，2022），并顯示對花青素積累具有積極作用（Luoetal.，2022）。Luan等（2022）研究影響牡丹色斑生成轉(zhuǎn)錄因子時發(fā)現(xiàn)，PsMYB30激活結(jié)構(gòu)基因 P s A N S 表達，促進牡丹‘HighNoon’中的色斑沉著。為了研究MYB30轉(zhuǎn)錄因子對滇牡丹色斑形成的潛在調(diào)控機制，本研究基于滇牡丹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中尋找影響色斑生成轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)了一種類似MYB30的轉(zhuǎn)錄因子，暫命名為PdMYB30。與植物中其他類

MYB30轉(zhuǎn)錄因子類似，PdMYB30在其N端具有完整的R2R3典型基序，已被證實是激活子特征的體現(xiàn)。并且PdMYB30與OgMYB1、PeMYB11、PrMYB5和PsMYB12歸為同一進化枝。其中，OgMYB1對于文心蘭屬唇中的紅斑沉著至關(guān)重要（Chiouamp;Yeh，2007）;PeMYB11屬于R2R3-MYB亞家族，可促進蝴蝶蘭屬唇中部紅斑的形成，通過激活PeF3H5、PeDFR1和PeANS3的表達（Hsuetal.，2019）; P r M Y B 5 a 和 P s M Y B 1 2 轉(zhuǎn)錄因子通過與bHLH和WD40形成MBW復(fù)合物，促進牡丹品種‘青海胡銀波’中紫色色斑的形成（Guetal.，2019；Shietal.，2022）。這一系列的研究證明PdMYB30是影響色斑生成的轉(zhuǎn)錄因子。

本研究通過對滇牡丹中觀察到的純黃色花瓣和紅色斑黃色花瓣2種不同花表型進行了轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了大約 的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，Q30均大于 94 % ，基于KEGG、NR、Swiss-Prot、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫，預(yù)測了50120個Unigenes的功能。在物種相似度上，與葡萄相似度最大，與栓皮櫟、胡桃、荷花和橡膠樹物種相似度較大。基于KOG數(shù)據(jù)庫，有26132個Unigenes進行KOG功能注釋，結(jié)果表明這些單基因顯著富集在25個大類中。此外，對表達基因進行GO富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)32138個Unigenes被注釋到56個GO功能條目中。通路分析研究將DEG注釋為49條代謝通路。注釋了與花青素發(fā)育相關(guān)的類黃酮生物合成（ k o 0 0 9 4 1 ）通路。獲得了可能引起色斑出現(xiàn)的差異表達基因，并對這些基因進行了差異比較分析。黃酮類生物合成通路重要結(jié)構(gòu)基因PdDFR、PdCHS、PdCHI在紅色斑黃色花瓣中的表達水平顯著高于在無色斑黃色花瓣中的表達水平，可能是花色呈現(xiàn)紅色斑的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因。并且，在滇牡丹中鑒定出一種新的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子PsMYB30，對色斑起到重要的調(diào)控激活作用。

色斑現(xiàn)象極大地推動了自然界中花色表型的多樣化進程，揭示了被子植物在適應(yīng)多變環(huán)境、增強生存能力方面的進化脈絡(luò)。因此，深入探究色斑形成的分子機制對于理解生物多樣性形成和生物進化過程具有至關(guān)重要的意義。本研究結(jié)果旨在為滇牡丹色斑品種的分子育種提供寶貴的資源和理論支持，并為其他木本植色斑形成機制的研究提供參考。但是，影響色斑生成的因素不只有轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控機制，除此之外還需要依靠多種調(diào)控手段的層層協(xié)作，后續(xù)可以對影響滇牡丹色斑形成的外界環(huán)境、花青素的甲基化以及糖基轉(zhuǎn)移酶對色斑處花青素的催化來深人分析研究（Zhangetal.，2007；Lietal.，2022），有望能從全方位不斷完善觀賞植物色斑形成的分子機理。

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（責(zé)任編輯周翠鳴）