中圖分類號：Q949 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3142（2025）04-0619-09

Rediscovery， supplementary description，and discussion of the systematic position of the endemic Chinese species Pilea menghaiensis （Urticaceae）

FU Xiaoying1，2，XIONG Chi2， WANG Renfen2，F(xiàn)U Longfei2 *

（1.CollgeofLifeSciences，GuangxiNormalUniersity，Guilin54106，Guangxi，China；2.GuangxiKeyLaboratoryofPlant Conservation and Restoration Ecology in Karst Terrain， Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang AutonomousRegionand ChineseAcademy ofSciences，Guilin541oo6，Guangxi，China）

Abstract：Pilea menghaiensis C.J. Chen is an endemic species of the genus Pilea Lindl.within thefamily Urticaceae Juss.，which isonlydistributed intheDai Autonomous Prefectureof Xishuangbanna inYunnan，China.This species has limitedspecimensandalack ofdescriptionof thefemaleinflorescenceintheFlora ReipublicaePopularis Sinicae. Furthermore，there isascarcityofrelevant studiesonthechloroplastgenomeandphylogeneticrelationshipsof this species.In this study，the complete chloroplast genome of P .menghaiensis was sequenced using high-throughput sequencing technology. The chloroplast genome data of P . menghaiensis were assembled and annotated. Phylogenetic trees of the genus Pilea were reconstructed based on the concatenated sequence matrix of chloroplast genome sequences， as well as the combined matrix of the ITS sequence and two chloroplast DNA regions （trnL-F and r b c L ）. Additionally， photographs and detailed descriptions of the pistillate inflorescence and achenes of P .menghaiensis were obtained.The results were as follws： （1） The complete chloroplast genome was 152 O79 bp long，with a GC content of 3 6 . 6 2 % ，and features a typical quadripartite structure with alarge singlecopy region （LSC）of 83178bp，a smallsingle copyregion （SSC）of 18 355 bp，and two inverted repeat regions （IRs）of 25273 bp each.（2）A total of 132 genes，including 87 protein-coding genes，37tRNA genes，and8rRNA genes，wereannotated，primarily distributed withintheLSCand SSC.（3）P.menghaiensis belonged to thesect.VerrucosaeL.F.Fuamp;Y.G.Weiof Pilea，was phylogeneticallyclose to P.sinofasciata，with whichitshared similar morphological characteristics.This studyenriches thegeneticinformationof the chloroplast genome of P .menghaiensis，providinga basis fordeveloping molecular markersand studying genetic diversity. It also serves as a reference for exploring species evolution within the genus Pilea.

Key words：chloroplast genome，phylogeneticanalysis，Pilea，sect.Verrucosae L.F.Fuamp;Y.G.Wei， Pilea sinofasciata

冷水花屬（PileaLindl.）是蕁麻科（Urticaceae）中物種多樣性最豐富的屬，約有715種，廣泛分布于熱帶與亞熱帶地區(qū)，少數(shù)分布在溫帶地區(qū)，具有重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值（Monro，2004；Lietal.，2021；Fuetal.，2022a）。該屬具有兩個分布中心：一個是美洲熱帶地區(qū)，約600種，集中分布在西印度群島地區(qū)；另一個是亞洲東南部熱帶和亞熱帶地區(qū)，約150種（陳家瑞，1982，1995；Chenamp;Monro，2003）。

前人在對冷水花屬進行系統(tǒng)學研究的過程中，由于取樣不足，尤其是缺乏一些具有代表性的基部類群樣品，導致該屬的單系性并未得到充分的驗證（Monro，2006；Wuetal.，2013）。Fu等（2022a）針對冷水花屬進行了世界范圍取樣，結合3個DNA片段（ 的序列數(shù)據(jù)，在前人構建的屬下分類系統(tǒng)基礎上進行了補充完善，并且為維持冷水花屬的單系性，對冷水花屬進行了重新界定，提出了8組屬下分類系統(tǒng)，分別為冷水花組（sect.Pilea）全緣冷水花組（sect.PlatanifloraeL.F.Fuamp;Y.G.Wei）疣果冷水花組（sect.VerrucosaeL.F.Fuamp;

Y.G.Wei）、四萼組（sect.Tetrameris C.J.Chen）、圓瓣冷水花組（sect.AngulataeL.F.Fuamp;Y.

G.Wei）、托序冷水花組（sect.LecanthoidesC.J.

Chen）、三萼組（sect.TrimerisY.G.Weiamp;A.

K.Monro）、四葉冷水花組（sect.Tetraphyllae L.

F.Fuamp;Y.G.Wei）（Fu et al.，2022a）。

亞洲東南部熱帶和亞熱帶地區(qū)作為冷水花屬第二大分布中心，比最大的美洲熱帶分布中心更具代表性且中國該屬分布數(shù)量占該分布中心物種數(shù)一半以上，約90種（陳家瑞，1982；Chenamp;Monro，2003；Chen et al.，2007；Monro et al.，2012；王文采，2016；Fu etal.，2017；Yang et al.，2018；韋毅剛，2018）。其中，特有種數(shù)量為54種，約占我國分布物種的 5 9 % ，而特有種中有33種由于無任何分子數(shù)據(jù)，因此其系統(tǒng)位置尚不明確（陳家瑞，1995；Chenamp;Monro，2003；Fuetal.，2022a）。勐海冷水花（Pileamenghaiensis）作為我國特有種之一，是陳家瑞（1982）依據(jù)兩份1936年采集的雄株標本描述發(fā)表，此后80余年間再無采集記錄，其雌株和果的特征未知，導致對該物種的分類學研究較少，進而阻礙了對該種的保護和植物資源開發(fā)與利用

2023年，筆者在中國科學院西雙版納熱帶植物園關注到2株于2019年引種自勐海曼稿保護區(qū)的形態(tài)獨特的冷水花屬植物，經(jīng)標本比對和形態(tài)比較，確認為“消失”許久的勐海冷水花，在隨后的2024年1月，在該種模式產(chǎn)地采集到雌株和果序標本。該文旨在利用分子和形態(tài)學證據(jù)對該種進行系統(tǒng)位置探討和形態(tài)補充描述，補充中國冷水花屬特有物種相關資料，加深對它們的認識，并為后續(xù)保護研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

以勐海冷水花為實驗材料，材料采自中國科學院西雙版納熱帶植物園于2019年從勐海曼稿保護區(qū)引種的植株（引種號：00，2019，0699），葉片采摘后置于硅膠中干燥保存，用于總DNA的提取。

1.2方法

1.2.1形態(tài)觀察和瀕危狀況評估所有形態(tài)學特征均通過日本奧林巴斯SZX16雙目體式顯微鏡（Olympus SZX16 binocular stereo microscope）在采集樣本上觀察。對于瘦果形態(tài)，進行掃描電子顯微鏡（ZEISS EVO18，scanning electron microscope，SEM）觀察，并至少使用10個瘦果來確定其大小和表面裝飾。瘦果材料從樣本中收集，干燥后用雙面膠粘貼于樣品臺上并使用濺射儀進行真空鍍金，鍍金后在掃描電子顯微鏡下觀察和拍照。依據(jù)IUCN 標準（IUCN Species Survival commission，2001）對勐海冷水花進行了物種瀕?，F(xiàn)狀評估。1.2.2總DNA提取和測序取已干燥的勐海冷水花葉片，采用改良的CTAB法（陳林楊等，2014）提取總DNA，DNA提取產(chǎn)物用紫外分光光度計進行檢測。取 2 μ L DNA樣品，用Nanodrop分光光度計（ND-100O，ThermoFisherScientific，USA）檢測DNA的濃度和純度（A260/280值）。提取獲得的DNA產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行后續(xù)的文庫構建和基因組淺層測序，測序讀長為PE150，最終獲取約2Gb的數(shù)據(jù)量。

1.2.3基因組組裝和注釋通過GetOrganelle（v1.7.7.0）對得到的有效數(shù)據(jù)進行基因組的拼接與組裝以獲得完整的葉綠體基因組與核糖體基因組數(shù)據(jù)（Jinetal.，2020）。使用ITSx（v.1.1.3）進行ITS序列提?。˙engtsson-Palmeetal.，2013），利用在線注釋軟件CPGAVAS2（Shietal.，2019）以鏡面草（Pileapeperomioides）（GenBank登錄號為NC_054339.1）的葉綠體基因組作為近緣參考基因組進行注釋，使用OGDRAW（Greineretal.，2019）繪制勐海冷水花的葉綠體基因組圖譜。

1.2.4系統(tǒng)發(fā)育分析通過葉綠體基因組數(shù)據(jù)和一代測序數(shù)據(jù)分別構建2個數(shù)據(jù)矩陣進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并將所得結果相互印證。從Fu等（2022b）所使用的139個物種的基因組序列（包括19個大麻科、?？?、蕁麻科等其他科的物種數(shù)據(jù)作為外類群）中選取下載25個物種的葉綠體基因組序列，以Ficuscarica和Morusindica作為外類群，使用Phylosuite v1.2.3 軟件（Zhang et al.，2020;Chuanetal.，2023）基于包含勐海冷水花（GenBank登錄號為PP504911）在內的25個物種的葉綠體基因組序列，通過最大似然法（maximumlikelihood，ML）（Nguyen etal.，2015）和貝葉斯法（Bayesian inference，BI）（Ronquist et al.，2O12）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。在該數(shù)據(jù)基礎上新增厚葉冷水花（P.sinocrassifolia）（GenBank登錄號為ON557626.1）、丹霞冷水花（P.danxiaensis）（GenBank登錄號為ON557625.1）和勐海冷水花的ITS、rbcL與trnL-F基因片段數(shù)據(jù)。將3個數(shù)據(jù)矩陣分別進行比對后進行手動調整。對2個葉綠體基因片段（trnL-F、rbcL）聯(lián)合數(shù)據(jù)矩陣與ITS數(shù)據(jù)矩陣通過ML生成的系統(tǒng)發(fā)育樹進行比較，確認其拓撲結構是否存在沖突。基于ITS聯(lián)合葉綠體基因片段（trnL-F、rbcL）數(shù)據(jù)矩陣通過ML和BI進行系統(tǒng)發(fā)育分析，以得到支持率更高的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1葉綠體基因組結構、功能與序列特征

勐海冷水花葉綠體基因組全長 ，GC總含量為 3 6 . 6 2 % ，呈環(huán)狀四分體結構（圖1），包括1個大單拷貝區(qū)（large single copyregion，LSC），長 （GC含量為 3 4 . 2 2 % ），1個小單拷貝區(qū)（small single copyregion，SSC），長 1 8 3 5 5 b p （GC含量為 3 0 . 4 7 % ），以及2個反向重復區(qū)（invertedrepeats，IRs），長25273bp（GC含量為 4 2 . 8 3 % ）。

在勐海冷水花葉綠體基因組中共注釋到132個基因（表1），包括87個蛋白編碼基因、37個tRNA基因和8個rRNA基因。位于IR區(qū)的基因共計20個，分別為8個蛋白編碼基因（ndhB、rpl2、rpl23、rps12、rps7、ycfl、ycf15、ycf2），4個rRNA基因（ r r n 1 6 S， r r n 2 3 S， r r n 4 . 5 S， r r n 5 S） 和8個tRNA基因（trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnS-GCU、trnV-GAC）。勐海冷水花中含有內含子的基因共有18個，其中rps12、clpP和ycf3基因含有2個內含子，其余15個基因僅含有1個內含子。

2.2形態(tài)補充描述

勐海冷水花圖2 Pilea menghaiensis C. J. Chen in Bull. Bot. Res.，Harbin 2（3）：67.1982；in Fl.Reip.Pop.Sin.23（2）：96.1995；Q. Lin et al.in Fl.China 5：104.2003.Type：云南（Yunnan）：佛海，今勐?？h（Fohai，now Menghai），王啟無（C.W.Wang）763144（holotype，Y?。籭sotypes，PE00023798！，LBG00070168！，HUH00240736！）.（Fig. 2）

Supplementary description of pistillate inflorescenceandachenes：Pistillate cymose inflorescence 1.1-2.7 cm long，80-100 flowers; peduncle 4-8 mm long， in diameter， glabrous；pedicel 1 - 2 m m long.Pistillate flowers ca. ，tepals3，subequal，triangular-ovateor ovate，glabrous，ca. ；achene ovoid， （0.58-0.67） ，verrucose.

雌花序、瘦果補充描述；雌聚傘花序長 1 . 1 ～ ， 8 0 ～ 1 0 0 朵花；花序梗長 ，直徑 ，無毛；花梗長 。雌花長約 ，花被片3，近等大，三角狀卵形或卵形，無毛，長約 0 . 3 m m ；瘦果卵球形， （ 0 . 5 8 ～ 0 . 6 7 ） mm× Ω

A.葉片；B.莖；C-E.雌花序；F、G.托葉；H.果序；I.瘦果（雙目體式顯微鏡）；J.瘦果（掃描電子顯微鏡）；K.瘦果表面 紋飾。

A.Leaves;B.Ste；C-.istlteifoesce;FGSiles;Hfrucee;s（ocreoe）；Je （SEM）；K. Ornamentation of achene surface.

（204號 （ 0 . 4 5 ～ 0 . 5 8 ） m m ，具有疣狀突起。

瀕危等級評估：在野外調查過程中調查到1個居群，位于云南西雙版納國家級自然保護區(qū)曼稿片區(qū)內，生于山谷林下，勐海冷水花成熟個體的數(shù)量在 至5000之間。在保護片區(qū)未觀察到明顯的威脅物種生存的因素或種群規(guī)模的持續(xù)下降。因此，將勐海冷水花暫時評估為無危（LC）。

憑證標本：中國（China），云南（Yunnan），勐海（Menghai），西雙版納國家級自然保護區(qū)曼稿片區(qū)， E， 。Alt. ，2024-07-19，殷建濤J.T.Yin240109（IBK?。?。

2.3系統(tǒng)發(fā)育重建

將蕁麻科的23個物種作為內類群和桑科的2個物種作為外類群構建葉綠體基因組矩陣，經(jīng)比對后用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。對葉綠體基因組編碼蛋白基因進行串聯(lián)，由表2可知，串聯(lián)后的葉綠體基因組矩陣長6 1 7 0 9 b p ，其中變異位點為 （占總長的 1 9 . 9 4 % ），有效信息位點為

100/1 外類群Outgroups 100/1 四葉冷水花組Sect.Tetraphyllae PileatetraphyllaJ287 回 三萼組Sect.Trimeris 托序冷水花組Sect.Lecanthoides 園 140/1 Pilea 冷水花Pileanotata NC072941 圓瓣冷水花組Sect.Angulatae 國 95.4/0.99 100/1 花葉冷水花P.cadiereiNC054343 四萼組Sect.Tetrameris C 94.4/0.94 94.3/1 赤車冷水花P.pellionioidesLCN052 100/1 疣果冷水花組Sect.Verrucosae 點乳冷水花P.gutberrm278265 87/9.96 勐海冷水花P.menghaiensis 89.7/0.96 粗齒冷水花P.sinofasciataP26 勐海冷水花P.menghaiensis 100/1 0.39C6 100/1 草Ppr 088 104/1 毛莖冷水花P.villicaulisLCN038 98.4/1 90.4/1 100/1 丹霞冷水花P.danxiaensis ON496932 心托冷水花P.cordistipulataLCN100 Pilea sp.LCN059 80.2/0.89 100/1 銳齒濕生冷水花P.aquarumsubsp.acutidentata 99.2/1 波緣冷水花P.cavalerieiNC057226 貴州冷水花P.guizhouensisLCN056 .20/- 疣果冷水花P.gracilis 0.27/ 100/1 透莖冷水花P.pumilaNC054345 權圓葉冷水花P.ellptilimba-92.6/1 99/1 P.thymifoliaNC054340 全緣冷水花組Sect.Plataniflorae 86/0.9 國 100/1 P.alpina OM877292 冷水花組Sect.Pilea 86.6/0.99

分支上的數(shù)字分別代表最大似然法的靴帶值 ≥ 6 0 % 和貝葉斯法的后驗概率 ? 0 . 8 。

Numbersunder thebranchesindicate thebootstrapvalues（ ? 6 0 % ）ofmaximumlikelihoodandtheposteriorprobability（ ofBI.

7 8 4 8 b p （占變異位點長的 6 3 . 7 8 % ）。由表3可知，核基因與葉綠體基因組序列串聯(lián)矩陣長1871bp，其中變異位點為 9 8 7 b p （占總長的 5 2 . 7 5 % ），有效信息位點為724bp（占變異位點長的7 3 . 3 5 % ）。通過ML和BI構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖3所示，所有節(jié)點均得到高支持率。其中，勐海冷水花嵌入冷水花屬分支內，與鏡面草、石筋草、丹霞冷水花等互為姐妹類群。

為進一步掌握勐海冷水花的系統(tǒng)位置，在前人所使用的139個物種的數(shù)據(jù)矩陣的基礎上（Fuetal.，2022a）新增部分數(shù)據(jù)和勐海冷水花的ITS、trnL-F與rbcL基因片段，同樣通過ML和BI分別進行系統(tǒng)發(fā)育分析。對比cpDNA（trnL-F、rbcL）和nrITS的系統(tǒng)發(fā)育樹后僅發(fā)現(xiàn)1個內類群物種（Pileasucculenta29043）位置不一致，但該物種并不影響內類群主要支系的關系（Fuetal.，2022a）。因此，聯(lián)合ITS與2個葉綠體基因片段進行系統(tǒng)發(fā)育分析，以獲得支持率和分辨率更高的發(fā)育樹，結果顯示勐海冷水花與粗齒冷水花（P.sinofasciata）聚為一支且支持率較高（ P P 1 . 0 / B S 1 0 0 % 。

3討論與結論

本研究對勐海冷水花葉綠體基因組的分析結果表明，其基因組大小和結構保守與目前已報道冷水花屬物種一致（Lietal.，2021；Fuetal.，2022b），這可能與該屬物種具有相對保守的生態(tài)位有關（Chenamp;Monro，2003；王文采，2014）。勐海冷水花葉綠體基因組的LSC和SSC區(qū)的GC含量均比IR區(qū)低，這一結果可能是由于IR區(qū)包含4個rRNA基因，其中16SrRNA在古細菌（archaea）中GC含量較高（ 6 5 . 0 %～6 5 . 5 % ）（Yamaneetal.，2011），該結果與蕁麻科水麻屬（Debregeasia）（Wanget al.，2020），以及其他陸生植物一致（Zebetal.，2020）。

勐海冷水花因葉具三出脈、雄花序不具花序托等形態(tài)特征而在《中國植物志》中被置于三萼組大葉冷水花系中（陳家瑞，1995）；然而，該組和該系在隨后的分子系統(tǒng)學研究中均被證實并非單系（Monro，2006；Fuetal.，2022a）。特別是在 F u 等（2022a）的研究中，通過結合分子與形態(tài)性狀，對冷水花屬進行了重新界定，提出屬下新的8組分類系統(tǒng)。本研究的分子系統(tǒng)學結果顯示，勐海冷水花隸屬于新分類系統(tǒng)的疣果冷水花組中，而該組的形態(tài)特征包括：托葉較短、葉緣具齒、雄花序分枝、雌花花被片3、雄花花被片4、瘦果不光滑等形態(tài)特征，其中瘦果不光滑和葉緣具齒是該組所具有的重要形態(tài)特征（Fuetal.，2022a）。通過電鏡的方式對勐海冷水花的瘦果進行觀察發(fā)現(xiàn)，瘦果不光滑，符合該組特征，因而形態(tài)上也支持分子系統(tǒng)學的結果。疣果冷水花組在全世界約有80種，主要分布于熱帶、亞熱帶、稀溫帶地區(qū)（ F u etal.，2022a），據(jù)統(tǒng)計，國內產(chǎn)有21種，本研究中涉及了該組目前已有的物種數(shù)據(jù)，包含勐海冷水花在內共15種（占國產(chǎn)總數(shù)的 7 1 . 4 3 % ）。本研究的分子系統(tǒng)學結果顯示，勐海冷水花與粗齒冷水花以及原大葉冷水花系中的點乳冷水花[Pileaglaberrima（Blume）Blume]等隸屬于疣果冷水花組分支，其中勐海冷水花與粗齒冷水花親緣關系最近，二者在形態(tài)上均葉緣具齒、雌花花被片3、雄花花被片4、瘦果表面不光滑，勐海冷水花葉緣為細圓鋸齒，托葉卵狀披針形，長 ，而粗齒冷水花葉緣為粗大牙齒或牙齒狀鋸齒，托葉三角形，長約 2 m m ，可以區(qū)別（陳家瑞，1982）。

此外，通過檢索NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），本研究發(fā)現(xiàn)冷水花屬物種已報道的二代測序DNA數(shù)據(jù)較少，特別是缺少托序冷水花組、三萼組、四葉冷水花組的數(shù)據(jù)，亟待補充上述代表類群的樣品，以進一步研究該屬的親緣關系與演化特征。

綜上所述，本研究通過野外考察、形態(tài)比較和分子系統(tǒng)學研究鑒定并重新發(fā)現(xiàn)了消失80余年的中國特有種勐海冷水花，并在此基礎上對該種的系統(tǒng)位置進行了探討，對其雌花序和瘦果進行了補充描述，加深了我們對該種的認識，研究結果支持前人提出的屬下分類系統(tǒng)，進一步驗證了冷水花屬的單系性。報道的葉綠體基因組為進一步研究該屬的進化特征和系統(tǒng)發(fā)育關系提供了基礎數(shù)據(jù)。

致謝特別感謝中國科學院西雙版納熱帶植物園賴菡博士和殷建濤老師在勐海冷水花植物照片、標本和材料獲取上提供的幫助。

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（責任編輯鄧斯麗）