摘 要 為了揭示綿羊DFAT細(xì)胞特性及其誘導(dǎo)成脂分化過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)，以實(shí)驗(yàn)室前期獲得的不同年齡阿勒泰羊尾部脂肪組織DFAT細(xì)胞為試驗(yàn)材料，對(duì)其細(xì)胞增殖能力、誘導(dǎo)成脂分化能力及其誘導(dǎo)成脂分化過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行深入研究。結(jié)果表明：來(lái)源于6、12和24月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織的第3代DFAT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均呈典型的“S”形曲線，細(xì)胞增殖速度未見明顯差異；細(xì)胞連續(xù)傳代20代后仍保持良好的細(xì)胞形態(tài)和增殖速度，且不同代次細(xì)胞之間未見明顯差異；采用誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)交替進(jìn)行的誘導(dǎo)成脂分化體系（體系Ⅲ），其誘導(dǎo)成脂分化效率極顯著優(yōu)于持續(xù)誘導(dǎo)分化體系（體系Ⅰ）和先誘導(dǎo)然后維持培養(yǎng)的誘導(dǎo)分化體系（體系Ⅱ） （Plt;0.01）；不同年齡來(lái)源DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化能力差異不顯著（Pgt;0.05）；在DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化過程中，啟動(dòng)成脂分化的關(guān)鍵基因PPARγ和C/EBPα，脂質(zhì)沉積關(guān)鍵基因ADIPOQ、 FSP27、 FABP4和LPL，脂質(zhì)分解關(guān)鍵基因HSL 、ATGL和Leptin，以及前體脂肪細(xì)胞標(biāo)志性基因 CD142和 ICAM1均先出現(xiàn)極顯著上調(diào)（Plt;0.01），然后又出現(xiàn)極顯著下調(diào)（Plt;0.01），但脂肪細(xì)胞祖細(xì)胞標(biāo)志性基因 DPP4的表達(dá)量在誘導(dǎo)分化的第2天以后出現(xiàn)極顯著下調(diào)（Plt;0.01），且在此后的整個(gè)誘導(dǎo)分化期間均保持極低的表達(dá)水平。研究結(jié)果證明在阿勒泰羊生命周期的很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，其DFAT細(xì)胞均保持了良好的增殖及成脂分化能力。

關(guān)鍵詞 綿羊；阿勒泰羊；DFAT細(xì)胞；誘導(dǎo)；成脂分化；脂肪細(xì)胞

去分化脂肪細(xì)胞（dedifferentiated fat cells，DFAT）具有和前體脂肪細(xì)胞相似的分子特征和分化潛力[1-2]，且其細(xì)胞來(lái)源豐富，去分化培養(yǎng)技術(shù)路線成熟，是體外研究脂肪細(xì)胞發(fā)育和脂質(zhì)沉積分子調(diào)控機(jī)制的理想細(xì)胞模型。揭示綿羊DFAT細(xì)胞特性及其成脂誘導(dǎo)分化過程中關(guān)鍵基因表達(dá)規(guī)律，對(duì)綿羊脂肪沉積調(diào)控機(jī)制的研究及低脂肪肉羊品種的培育具有重要意義。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已針對(duì)絨山羊[3]、人[4]、豬[5]和牛[6]等家畜建立了DFAT細(xì)胞培養(yǎng)體系。王歡歡等[7]對(duì)豬DFAT細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，連續(xù)誘導(dǎo)3 d后細(xì)胞中出現(xiàn)小脂滴，至誘導(dǎo)12 d后細(xì)胞內(nèi)的小脂滴融合為大脂滴，細(xì)胞顯示出成熟脂肪細(xì)胞的形態(tài)。誘導(dǎo)分化過程中成熟脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因過氧化物酶體增殖物活化受體（PPARγ）和脂肪酸結(jié)合蛋白 4 （FABP4）的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（Plt;0.05）。高霞等[8]研究結(jié)果表明豬DFAT誘導(dǎo)12 d后80%以上的細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒熘炯?xì)胞，在誘導(dǎo)分化過程中Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2（Krüppel-like transcription factor 2，KLF2）出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，而PPARγ基因呈上調(diào)趨勢(shì)。但劉敏等[9]對(duì)“馬身豬”的研究結(jié)果表明，其皮下前體脂肪細(xì)胞在誘導(dǎo)成脂過程中PPARγ、FABP4、FABP3、LPL和HSL基因表達(dá)量先極顯著上調(diào)（Plt;0.01），隨后又開始下降，至誘導(dǎo)分化第10天時(shí)其表達(dá)量與第0天時(shí)無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）。張清月等[3]利用成年絨山羊脂肪細(xì)胞獲得了DFAT細(xì)胞，經(jīng)過12 d的誘導(dǎo)分化，90%的DFAT細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)橹炯?xì)胞。已有的研究結(jié)果表明，成熟脂肪細(xì)胞去分化為DFAT細(xì)胞具有物種保守性，且DFAT細(xì)胞均可誘導(dǎo)再分化為成熟脂肪細(xì)胞，但誘導(dǎo)成脂分化過程中相關(guān)基因的表達(dá)模式可能存在物種差異。

目前，中國(guó)肉脂兼用型地方綿羊品種的選育提高及瘦肉型肉羊新品種培育已成為綿羊育種的重要方向。利用DFAT細(xì)胞深入研究綿羊脂肪沉積的調(diào)控機(jī)制，將為瘦肉型肉羊育種提供可靠的理論基礎(chǔ)，但綿羊DFAT細(xì)胞的相關(guān)研究仍鮮有報(bào)道?；诖耍狙芯恳孕陆r(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院草食家畜種質(zhì)資源研究與開發(fā)利用課題組前期通過改進(jìn)型“天花板”培養(yǎng)法獲得的阿勒泰羊DFAT細(xì)胞為研究對(duì)象，探索其細(xì)胞特性、成脂誘導(dǎo)分化體系及分化過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)，旨在為后續(xù)的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

阿勒泰羊DFAT細(xì)胞為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北畜禽健康養(yǎng)殖技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存細(xì)胞，胎牛血清（Gibco，美國(guó)），DMEM（Gibco，美國(guó)），胰酶（Gibco，美國(guó)），雙抗（索萊寶，中國(guó)），PBS（索萊寶，中國(guó)），MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（索萊寶，中國(guó)），3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（ 3-Isobutyl-1-methylxanthine， IBMX，Sigma，美國(guó)），地塞米松（dexamethasone， DEX，Sigma，美國(guó)），牛胰島素（insulin from bovine pancreas， INS，Sigma，美國(guó)），羅格列酮（rosiglitazone， RSG，Sigma，美國(guó)），油酸（索萊寶，中國(guó)），油紅O染色試劑盒（索萊寶，中國(guó)），TRIzol（Thermo Fisher，美國(guó)），去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，日本），TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TAKARA，日本）。

1.2 不同年齡阿勒泰羊DFAT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

DFAT細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[3]。取來(lái)源于6、12和24月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織的第3代DFAT細(xì)胞，使用完全細(xì)胞培養(yǎng)基（89%DMEM+10%FBS+1%雙抗）將細(xì)胞密度調(diào)整至1×10 mL-1。每塊96孔板分3組，每組8孔，分別接種調(diào)整好密度的3種DFAT細(xì)胞懸液，每孔200 μL，共接種12塊板。將接種細(xì)胞的96孔板置于37 ℃、5% CO 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h取出1塊板，使用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， MTT）法測(cè)定細(xì)胞數(shù)，即小心吸去培養(yǎng)基，每孔加入90 μL完全培養(yǎng)基，再加入10 μL MTT溶液，置于37 ℃、5% CO 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后吸去培養(yǎng)基，每孔加入110 μL Formazan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，然后在490 nm波長(zhǎng)處讀取各孔OD值。以加入110 μL Formazan溶解液空白孔調(diào)零，每種細(xì)胞計(jì)算8孔OD值的平均值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.3 不同年齡阿勒泰羊DFAT細(xì)胞增殖能力

取來(lái)源于6、12和24月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織的第3代DFAT細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔的密度接種至6孔板中，加入完全細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳20代，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。取傳代至10、15和20代DFAT細(xì)胞繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以比較不同代數(shù)細(xì)胞的增殖能力。

1.4 阿勒泰羊DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化體系

取來(lái)源于6月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織的第3代DFAT細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔的密度接種至6孔板中，加入完全細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO 2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%匯合時(shí)，分別采用以下3種誘導(dǎo)成脂分化體系進(jìn)行誘導(dǎo)分化。體系Ⅰ：加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（89%DMEM+10%FBS+1%雙抗+80 μmol/L油" 酸+0.25 mmol/L IBMX+5 μmol/L DEX+8 μmol/L INS）培養(yǎng)，每2 d換液1次，直至完成誘導(dǎo)分化；體系Ⅱ：加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2 d換1次液，至第4 天時(shí)更換為維持培養(yǎng)基（89% DMEM/F12+10% FBS+1%雙抗+5 μmol/L INS），此后每2 d換1次維持培養(yǎng)基，直至完成誘導(dǎo)分化；體系Ⅲ：加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2 d換1次液，至第4 天時(shí)更換為維持培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d后再更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，如此誘導(dǎo)和維持反復(fù)循環(huán)，直至完成誘導(dǎo)分化。

分別在誘導(dǎo)分化的第0天、2天 、4天、6天、8天、10天和12天使用油紅O染色法比較不同誘導(dǎo)體系DFAT細(xì)胞的脂肪沉積量，以分析其成脂分化能力。油紅O染色操作按照試劑盒說明進(jìn)行，然后移除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加油紅O固定液固定20～30 min，棄去固定液，PBS清洗2次，加入60%異丙醇浸洗20～30 s，棄去60%異丙醇后加入新配制好的油紅O染色液，浸染10～20 min，棄去染色液，60%異丙醇漂洗" 20～30 s至間質(zhì)清晰，蒸餾水清洗2～5次，確保無(wú)多余染液，加入Mayer蘇木精染色液復(fù)染核" 1～2 min，棄去染色液后用蒸餾水清洗2～5次，加入油紅O緩沖液孵育1 min，棄去緩沖液后加入3 mL蒸餾水覆蓋細(xì)胞，并在顯微鏡下觀察拍照；拍照后棄去蒸餾水，每孔細(xì)胞加入1 mL異丙醇萃取油紅O，測(cè)定510 nm處的OD值；萃取油紅O后的細(xì)胞使用酚-氯仿-異戊醇抽提法提取DNA，通過測(cè)定260 nm處的OD值計(jì)算DNA量，然后通過計(jì)算油紅O OD510/DNA OD260比較誘導(dǎo)分化細(xì)胞脂肪沉積量。

1.5 不同年齡阿勒泰羊DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化能力差異

取來(lái)源于6、12和24月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織的第3代DFAT細(xì)胞，使用體系Ⅲ進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，分別在誘導(dǎo)分化的第0天、2天、4天、6天、8天、10天和12天使用油紅O染色法比較不同年齡阿勒泰羊DFAT細(xì)胞的脂肪沉積量，以分析其成脂分化能力差異。

1.6 阿勒泰羊DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化過程中關(guān)鍵基因表達(dá)量

取來(lái)源于6月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織的第3代DFAT細(xì)胞，使用體系Ⅲ進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，分別在誘導(dǎo)分化的第0天、2天、4天、6天、8天、10天和12天消化細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以18S為內(nèi)參，誘導(dǎo)分化第0 天的表達(dá)量為對(duì)照，采用RT-qPCR對(duì)脂質(zhì)合成、分解關(guān)鍵基因及前體脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量，以研究DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化過程中相關(guān)基因的表達(dá)變化規(guī)律。

RT-qPCR引物使用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。RT-qPCR擴(kuò)增采用20 μL體系，即TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL， 上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，ddH2O 8 μL，cDNA 1 μL。退火溫度為60[KG*3]℃的引物采用兩步法RT-qPCR擴(kuò)增，退火溫度為55 ℃的引物采用三步法RT-qPCR擴(kuò)增。兩步法RT-qPCR程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)60 ℃延伸結(jié)束后采集熒光信號(hào)。三步法RT-qPCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性" 30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸" 10 s，共40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)72 ℃延伸結(jié)束后采集熒光信號(hào)。熔解曲線分析程序：95 ℃ 5 s，" 60 ℃"" 1 min，然后95 ℃變性并持續(xù)收集熒光信號(hào)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。RT-qPCR試驗(yàn)使用2-ΔΔct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 20.0軟件包中One-way ANOVA對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，" Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年齡阿勒泰羊DFAT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

來(lái)源于6、12和24月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織的第3代DFAT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均呈典型的“S”形曲線（圖1），且不同月齡羊尾部脂肪組織DFAT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本吻合，說明阿勒泰羊DFAT細(xì)胞的分裂增殖能力與其年齡無(wú)明顯的相關(guān)性。

2.2 不同年齡阿勒泰羊DFAT細(xì)胞增殖能力

對(duì)來(lái)源于6、12和24月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織的第3代DFAT細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化并繪制了傳代至第10、15和20代DFAT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖2）。3個(gè)年齡階段阿勒泰羊的DFAT細(xì)胞傳至第20代時(shí)均保持著良好的分裂增殖能力，細(xì)胞的貼壁速度和貼壁的牢固程度未見明顯下降，細(xì)胞的折光性保持良好，細(xì)胞呈梭形，邊緣清晰明確，細(xì)胞培養(yǎng)基仍保持清澈。且不同年齡、不同傳代次數(shù)DFAT細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線基本吻合，仍呈典型的“S”形曲線。這從另一個(gè)角度證明阿勒泰羊DFAT細(xì)胞的分裂增殖能力與其年齡無(wú)明顯的相關(guān)性。

2.3 不同體系誘導(dǎo)阿勒泰羊DFAT細(xì)胞成脂分化效率

分別使用3種不同的誘導(dǎo)成脂分化體系，對(duì)來(lái)源于6月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織的第3代DFAT細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)成脂分化，并使用油紅O染色法測(cè)定誘導(dǎo)分化的0 d 、2 d 、4 d 、6 d 、8 d 、" 10 d和12 d不同誘導(dǎo)體系的脂肪沉積量，以分析其誘導(dǎo)成脂分化效率（圖3）。體系Ⅲ的誘導(dǎo)成脂分化能力明顯優(yōu)于體系Ⅰ和體系Ⅱ（圖3-A和圖3-B），至誘導(dǎo)分化第4天和6 d，體系Ⅲ誘導(dǎo)細(xì)胞的脂肪沉積量顯著高于體系Ⅱ（Plt;0.05），極顯著高于體系Ⅰ（Plt;0.01）；誘導(dǎo)分化至8 d后，體系Ⅲ誘導(dǎo)細(xì)胞的脂肪沉積量均極顯著高于體系Ⅰ和體系Ⅱ（Plt;0.01） （圖3-C）。所以選擇體系Ⅲ開展后續(xù)的相關(guān)研究。

2.4 不同年齡阿勒泰羊DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化能力差異

使用誘導(dǎo)體系Ⅲ對(duì)來(lái)源于6、12和24月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織的第3代DFAT細(xì)胞成脂分化能力進(jìn)行了比較。經(jīng)過12 d的誘導(dǎo)分化，3個(gè)年齡階段細(xì)胞中均出現(xiàn)大量脂滴（圖4-A和4-B），且在整個(gè)誘導(dǎo)分化期間不同年齡來(lái)源細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積量未見顯著差異（Pgt;0.05） （圖4-C）。說明阿勒泰羊DFAT細(xì)胞的誘導(dǎo)成脂分化能力與其年齡無(wú)顯著相關(guān)性。

2.5 阿勒泰羊DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化過程中關(guān)鍵基因表達(dá)

阿勒泰羊DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化期間，細(xì)胞啟動(dòng)成脂分化的關(guān)鍵基因PPARγ和" C/EBPα，脂質(zhì)沉積關(guān)鍵基因ADIPOQ、 FSP27、 FABP4和LPL，以及脂質(zhì)分解關(guān)鍵基因HSL 、ATGL和Leptin均先極顯著上調(diào)（Plt;0.01），然后又極顯著下調(diào)（Plt;0.01） （圖5-A～圖5-I）。但總體而言，脂質(zhì)沉積相關(guān)基因的上調(diào)幅度大于脂質(zhì)分解的相關(guān)基因。說明DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化過程中，脂質(zhì)合成反應(yīng)和脂質(zhì)分解反應(yīng)都得到了加強(qiáng)，但總體以脂質(zhì)合成為主。另外，脂肪細(xì)胞祖細(xì)胞標(biāo)志性基因 DPP4的表達(dá)量在誘導(dǎo)分化的第2天以后極顯著下調(diào)（Plt;0.01），且在此后的整個(gè)誘導(dǎo)分化期間均保持極低的表達(dá)水平（圖5-J）。而前體脂肪細(xì)胞標(biāo)志性基因 CD142和 ICAM1先是極顯著上調(diào)" （Plt;0.01），至誘導(dǎo)分化的第6 天以后又極顯著下調(diào)（Plt;0.01） （圖5-K和圖5-L）。說明在成脂誘導(dǎo)分化過程中，DFAT細(xì)胞改變了其干細(xì)胞特性，逐步轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒熘炯?xì)胞。

3 討 論

近年來(lái)，羊肉消費(fèi)市場(chǎng)逐漸轉(zhuǎn)向瘦肉型羊肉的消費(fèi)，肉羊胴體脂肪的過量沉積會(huì)使其商品價(jià)值大大降低。在此背景下，中國(guó)的肉脂兼用型地方綿羊品種亟待選育提高，以適當(dāng)降低其胴體脂肪含量，更好地適應(yīng)羊肉消費(fèi)市場(chǎng)。通過建立可靠的脂肪沉積細(xì)胞模型及高效誘導(dǎo)成脂分化體系，深入揭示肉羊脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制，將對(duì)瘦肉型肉羊品種的選育產(chǎn)生積極的推動(dòng)作用。

DFAT細(xì)胞可以通過成年動(dòng)物體內(nèi)脂肪細(xì)胞去分化培養(yǎng)獲得，細(xì)胞來(lái)源非常豐富。且DFAT細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞[10]、軟骨細(xì)胞[10]、骨細(xì)胞[10]、肌細(xì)胞[11]、內(nèi)皮細(xì)胞[12]和神經(jīng)細(xì)胞[13]等多種終末分化細(xì)胞的多能性，是研究細(xì)胞發(fā)育及其分子調(diào)控機(jī)制的理想細(xì)胞模型，同時(shí)也可作為醫(yī)學(xué)上干細(xì)胞移植和組織工程的理想細(xì)胞來(lái)源[14]。所以，有關(guān)DFAT細(xì)胞的研究一直備受關(guān)注。到目前為止，DFAT細(xì)胞特性的研究大多來(lái)源于人和小鼠，針對(duì)綿羊的相關(guān)研究仍鮮有報(bào)道。Lessard等[15]對(duì)來(lái)自不同肥胖患者的網(wǎng)膜和皮下DFAT細(xì)胞特性進(jìn)行了研究，這些患者的年齡在29～66歲，體質(zhì)量在91.9～212 kg，包括13名女性和11名男性。研究結(jié)果表明，在連續(xù)傳代16代后，細(xì)胞的增殖能力和誘導(dǎo)成脂分化能力均未見明顯下降。Poloni等[16]對(duì)年齡為" 53～81歲無(wú)肥胖患者網(wǎng)膜和皮下脂肪細(xì)胞去分化能力的研究中也得到了同樣的結(jié)果。本研究對(duì)來(lái)源于6、12和24月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織的DFAT細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，傳代至第20代的細(xì)胞分裂增殖能力仍未見明顯下降，細(xì)胞形態(tài)亦保持良好，與Lessard等[15]和Poloni等[16]的研究結(jié)果一致，證明脂肪細(xì)胞在動(dòng)物生命周期中的很長(zhǎng)時(shí)間均保持著良好的去分化和增殖能力。以上研究中的DFAT細(xì)胞是在體外通過脂肪細(xì)胞去分化培養(yǎng)獲得的。也有研究表明，脂肪細(xì)胞去分化和再分化也存在于正常動(dòng)物體內(nèi)。小鼠乳腺中的脂肪細(xì)胞會(huì)隨著其妊娠、哺乳和斷奶的轉(zhuǎn)變而反復(fù)出現(xiàn)去分化和再分化[2，17]?？梢?，脂肪細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)不僅僅發(fā)揮儲(chǔ)存脂質(zhì)、調(diào)控能量代謝的作用，還可能作為一種多能干細(xì)胞儲(chǔ)備庫(kù)，在組織機(jī)能穩(wěn)定性維持中發(fā)揮重要作用，所以將脂肪細(xì)胞定義為一種終末分化細(xì)胞是否準(zhǔn)確仍待進(jìn)一步研究[18]。

已有的研究結(jié)果表明，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入IBMX、DEX、INS和RSG等試劑可有效誘導(dǎo)DFAT細(xì)胞和前體脂肪細(xì)胞的成脂分化，油酸的添加可提高誘導(dǎo)分化的效率[19]，成脂誘導(dǎo)體系可概括為三種：體系Ⅰ是使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基持續(xù)誘導(dǎo)，直至完成分化 [20-21]；體系Ⅱ是先用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞中出現(xiàn)脂滴后改為維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)[22-23]；體系Ⅲ是交替使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化[8，24]，但不同體系誘導(dǎo)成脂效率的差異尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究在前期研究基礎(chǔ)上對(duì)3種誘導(dǎo)體系的成脂分化效率進(jìn)行比較，結(jié)果表明體系Ⅲ誘導(dǎo)細(xì)胞的脂肪沉積量均極顯著高于體系Ⅰ和體系Ⅱ，說明持續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)和僅進(jìn)行1次誘導(dǎo)均不能高效誘導(dǎo)DFAT細(xì)胞的成脂分化。使用體系Ⅲ對(duì)來(lái)源于6、12和24月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織的第3代DFAT細(xì)胞成脂分化能力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同年齡來(lái)源細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積量未見顯著差異，與Lessard等[15]的研究結(jié)果一致，這也再次證明脂肪細(xì)胞可能是有機(jī)體一種重要的多能干細(xì)胞儲(chǔ)備庫(kù)，在動(dòng)物生命周期中的很長(zhǎng)時(shí)間不僅保持著良好的去分化和增殖能力，其再分化能力亦得到了很好的保持。

Merrick等[25]對(duì)小鼠和人的研究表明，脂肪細(xì)胞均來(lái)源于 DPP4+祖細(xì)胞，這類細(xì)胞分布在脂肪組織周邊由結(jié)締組織構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。機(jī)體啟動(dòng)脂肪沉積后， DPP4+細(xì)胞分化為 CD142+ 和" ICAM1+兩類命運(yùn)決定的前體脂肪細(xì)胞，并進(jìn)入脂肪組織開始沉積脂質(zhì)，最終轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒熘炯?xì)胞。因此，機(jī)體脂肪組織生長(zhǎng)時(shí)脂肪細(xì)胞數(shù)量和體積同時(shí)增加。本研究中DFAT細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)成脂再分化， DPP4基因出現(xiàn)極顯著下調(diào)（圖5-J）， CD142和 ICAM1先是極顯著上調(diào)然后又極顯著下調(diào)（圖5-K和圖5-L），同時(shí)成熟脂肪細(xì)胞相關(guān)基因ADIPOQ和FSP27極顯著上調(diào)并保持較高的表達(dá)水平（圖5-C和圖5-D），細(xì)胞中也出現(xiàn)了大量的脂滴（圖4-B），說明DFAT細(xì)胞由脂肪細(xì)胞的祖細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榍绑w脂肪細(xì)胞及成熟脂肪細(xì)胞，與Merrick等[25]的研究結(jié)果相一致。本研究中DFAT細(xì)胞在誘導(dǎo)分化期間調(diào)控脂肪沉積的基因PPARγ、C/EBPα、ADIPOQ、 FSP27、 FABP4和LPL的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上調(diào)再下調(diào)的趨勢(shì)，與劉敏等[9]在‘馬身豬’，陳濤等[23]在新西蘭兔，以及徐小春等[24]在灘羊中的研究結(jié)果基本一致。以上結(jié)果也說明，脂肪細(xì)胞的發(fā)育以及脂質(zhì)沉積過程中相關(guān)基因的表達(dá)在物種間有很強(qiáng)的保守性。PPARγ和C/EBPα基因在脂肪細(xì)胞啟動(dòng)脂質(zhì)沉積過程中發(fā)揮著重要作用[26]，李戡等[27]的研究結(jié)果表明，AMPK信號(hào)通路的激活可極顯著降低綿羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中PPARγ和C/EBPα基因的表達(dá)，細(xì)胞的成脂分化能力也被抑制。前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化過程中， PPARγ和C/EBPα基因首先被激活，表達(dá)量迅速上調(diào)，然后伴隨著其他脂質(zhì)沉積相關(guān)基因ADIPOQ、 FSP27、 FABP4和LPL等表達(dá)量的上調(diào)[26， 28-29]。本研究及其他相關(guān)研究[9， 23， 28]中均檢測(cè)到，前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化過程中脂質(zhì)分解相關(guān)基因HSL、ATGL和Leptin等也出現(xiàn)極顯著上調(diào)，提示前體脂肪細(xì)胞啟動(dòng)脂質(zhì)沉積過程中也同時(shí)伴隨著脂質(zhì)分解強(qiáng)度的增加。

4 結(jié)" 論

本研究結(jié)果表明，來(lái)源于6、12和24月齡阿勒泰羊尾部脂肪組織DFAT細(xì)胞的分裂增殖能力和誘導(dǎo)成脂分化能力與其年齡無(wú)明顯的相關(guān)性；使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基交替培養(yǎng)，可更為高效地誘導(dǎo)DFAT細(xì)胞的成脂分化；阿勒泰羊DFAT細(xì)胞誘導(dǎo)成脂分化過程中，脂質(zhì)沉積和脂質(zhì)分解關(guān)鍵基因均呈先極顯著上調(diào)，然后又極顯著下調(diào)的趨勢(shì)，但脂質(zhì)沉積相關(guān)基因的上調(diào)幅度大于脂質(zhì)分解相關(guān)基因；阿勒泰羊DFAT細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)成脂分化，脂肪細(xì)胞的祖細(xì)胞標(biāo)志性基因 DPP4表達(dá)量極顯著下調(diào)，而前體脂肪細(xì)胞標(biāo)志性基因 CD142和 ICAM1先極顯著上調(diào)，然后又極顯著下調(diào)，DFAT細(xì)胞脫離其干細(xì)胞狀態(tài)，逐步轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒熘炯?xì)胞。

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Properties of Sheep DFAT Cells and Expression of Key Genes in Induced" Adipogenic Differentiation

WANG Shiyin1， GUO Qinghe1， NING Chengcheng1， GAO Li1，

NIU Jia2， LU" Gang3， ZHANG Wei1 and" WANG Quande

（1. Xinjiang Agricultural Vocational Technical College， Key Laboratory of Livestock and Poultry Healthy Breeding Technology in Northwest China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Changji" Xinjiang 831100， China; 2. Western Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Science， Changji" Xinjiang 831100， China; 3.Xinjiang Taikun Group Co.， Ltd.， Changji" Xinjiang 831100， China ; 4.Agricultural Development Service Center of Regiment 103， 6th Division， Xinjiang Production and Construction Corps， Wujiaqu" Xinjiang 831300， China）

Abstract To" elucidate the characteristics of sheep DFAT cells and the expression of key genes during adipogenic differentiation， DFAT cells from tail fat tissue of Altay sheep at different ages were used as experimental materials.This study investigated their cell proliferation ability， adipogenic differentiation potential，and expression patterns of key genes during adipogenic differentiation. The results showed that the growth curves of the 3rd generation DFAT cells from the adipose tissue of Altay sheep at 6， 12 and 24 months old showed typical “S”" shapes， with no significant differences in cell proliferation rate. The cell morphology and proliferation rate remained stable after 20 generations， with no significant differences among different generations of cells.The efficiency of induced lipid differentiation system III， alternating induction and maintenance culture， was significantly superior to both system I （continuous induction） and system II （initial induction followed by maintenance culture） （Plt;0.01）. There was no significant difference in the adipogenic differentiation ability of DFAT cells from different ages （Pgt;0.05）. During induced adipogenic differentiation of DFAT cells， the key adipogenic differentiation genes PPARγ and C/EPBα， lipid deposition genes ADIPOQ， FSP27， FABP4 and LPL， lipid decomposition genes HSL， ATGL and Leptin， and the preadipocytes signature genes CD142 and ICAM1" were significantly up-regulated first （Plt;0.01） and then significantly down-regulated （Plt;0.01）.However， the expression of the adipocyte progenitor cells signature gene DPP4 was significantly down-regulated during the next day of induced differentiation （Plt;0.01） and remained extremely low expression levels throughout the induced differentiation period. This study demonstrates that DFAT cells of Altay sheep retain robust proliferation and adipogenic differentiation capabilities over a long period.The findings lay a foundation for further research on the biological functions of sheep adipocytes and breeding of lean meat sheep breeds.

Key words Sheep; Altay sheep;DFAT; Induce; Adipogenic differentiation; Adipocyte

Received 2024-03-30 Returned 2024-05-29

Foundation item Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous" Region（No.2022D01A92， No.2022D01E18）；Earmarked Fund for Sheep Industry Technology System of Xinjiang Modern Agricultural Industrial Technology System（No.XJARS-09）.

First author WANG" Shiyin， female， associate professor. Research area： molecular regulation mechanism of meat quality in herbivorous livestock. E-mail：wangshiyinxjnzy@163.com

Corresponding"" author ZHANG Wei， male， professor. Research area： functional genes and genetic improvement of herbivorous livestock. E-mail：zhangweigsau@163.com

WANG Quande， male， senior livestock specialist. Research area： livestock breed improvement technology. E-mail：252783957@qq.com

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）

收稿日期：2024-03-30 修回日期：2024-05-29

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2022D01A92，2022D01E18）；新疆現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（XJARS-09）。

第一作者：王世銀，女，副教授，主要從事草食家畜肉品質(zhì)分子調(diào)控機(jī)制研究。E-mail：wangshiyinxjnzy@163.com

通信作者：張 偉，男，教授，主要從事草食家畜功能基因及遺傳改良研究。E-mail：zhangweigsau@163.com王全德，男，高級(jí)畜牧師，主要從事畜禽品種改良技術(shù)研究。E-mail：252783957@qq.com