摘 要 為了明確李屬壞死環(huán)斑病毒（prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）在甘肅省蘋果部分產(chǎn)區(qū)的發(fā)生及遺傳變異情況，對采自5個地區(qū)表現(xiàn)花葉癥狀和無明顯癥狀的93份蘋果葉片樣品進行檢測，通過RT-PCR在天水和蘭州蘋果樣品中檢測到PNRSV。分別克隆了5個PNRSV分離物的外殼蛋白（coat protein，CP）基因。序列分析結果表明，5個PNRSV分離物間核苷酸和氨基酸序列一致率分別為97.3%～99.4%和" 95.5%～99.1%。5個PNRSV分離物與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他21個PNRSV分離物的核苷酸和氨基酸序列一致率分別為91.5%～100%和89.6%～100%。利用PNRSV CP基因序列構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，26個PNRSV分離物共分成3個組，本研究中的5個PNRSV分離物與美國分離物AF013287聚集在一起?；蚪涣鞣治霰砻鳎遥≒runus persica）和巴旦木（P.dulcis）的PNRSV分離物種群之間存在頻繁的基因交流，桃（P.persica）和西梅（P.cerasifera）分離物之間容易發(fā)生遺傳漂變。

關鍵詞 蘋果病毒； PNRSV；遺傳多樣性；基因交流

李屬壞死環(huán)斑病毒（prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）屬于雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒屬（IIarvirus）。其病毒粒子為等軸對稱二十面體到準等軸對稱顆粒，無包膜，有3種大小，直徑為26～35 nm，偶爾呈桿菌狀。該病毒為多分體病毒，基因組由3條線性正義單鏈RNA組成。RNA1和RNA2分別編碼復制酶蛋白P1和P2，RNA3編碼運動蛋白（movement protein，MP）和外殼蛋白（coat protein，CP）。RNA3含有2個開放閱讀框，5′端編碼32 ku的MP，3′端編碼26 ku的CP，MP和CP基因間由一段短的非編碼的基因間隔區(qū)分開[1-4]。PNRSV主要通過嫁接、種子和花粉等方式傳播，目前尚未發(fā)現(xiàn)其昆蟲傳播介體[5-6]。PNRSV可侵染47個屬的189種植物，其自然寄主主要為薔薇科李屬核果類果樹及一些觀賞植物，如桃（Prunus persica）、李（Prunus domestica）、杏（Prunus armeniaca）、櫻桃（Prunus avium）和玫瑰（Rosa rugosa Thunb）等，人工接種可侵染煙草（Nicotiana tabacum）、西瓜（Citrullus lanatus）、甜瓜（Cucumis melo）和向日葵（Helianthus annuus）等植物[7-8]。

PNRSV是Cochran等[9]于1941年首次在桃樹和李子上發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)已廣泛分布于亞洲、非洲、北美洲、南美洲、歐洲及大洋洲的40多個國家和地區(qū)[10-12]，已經(jīng)在不同寄主植物上檢測到PNRSV[13-16]。于1996年在中國陜西、山東和遼寧等地首次發(fā)現(xiàn)PNRSV的存在[17-19]，近年來通過對國內(nèi)多地區(qū)進行植物病毒檢測，相繼在北京、陜西、新疆以及遼寧等地檢測出PNRSV[20-23]。上述研究結果表明，李屬壞死環(huán)斑病毒已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)發(fā)生并蔓延。甘肅省是中國重要的蘋果產(chǎn)區(qū)之一，其產(chǎn)量居全國第二位[24]。近年來，甘肅省蘋果栽培受到季節(jié)、種植區(qū)、品種以及病蟲害的影響，隨著蘋果栽培面積的增加，其中蘋果病毒病已經(jīng)成為威脅甘肅省蘋果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素[25]。PNRSV可能為引起蘋果花葉病毒的病原[26-27]，但關于PNRSV在甘肅的發(fā)生還未報道。因此，本研究對PNRSV在甘肅省蘋果部分產(chǎn)區(qū)的發(fā)生情況進行了調(diào)查，克隆了PNRSV分離物的CP基因序列，分析了PNRSV分離物的分類地位及遺傳變異情況，旨在為該病毒的防治工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

PrimeScriptTM Ⅳ 1st strand cDNA Synthesis MIX（TaKaRa）；克隆載體pMD19-TVector（TaKaRa）；DH5α感受態(tài)細胞、瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收、DL5000 Plus DNA Marker、無核糖核酸酶水等購自北京天根生化科技有限公司；高純度質粒小量快速提取試劑盒購自艾德萊生物技術有限公司；引物由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成。

1.2 供試材料

2020年5月-10月對甘肅省蘭州市、隴南市、天水市、平?jīng)鍪泻桶足y市等5個地區(qū)進行了李屬壞死環(huán)斑病毒病發(fā)生情況調(diào)查，并采集了93份蘋果葉片樣品進行后續(xù)分子檢測。

1.3 樣品總RNA提取

蘋果葉片樣品總RNA提取參照Li等[28]和Song等[29]的方法，提取的總RNA溶解于50 μL無核糖核酸酶水中，采用超微量分光光度計（Thermo Fisher，美國）測定濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性后，保存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.4 PNRSV的分子檢測

以提取的總RNA為模板進行反轉錄。反轉錄程序和體系參照PrimeScriptTM Ⅳ 1st strand cDNA Synthesis MIX試劑盒說明書進行，對PNRSV的發(fā)生情況進行分子檢測。采用邢飛等[27]文獻中PNRSV CP基因序列引物PNRSV-CP-F/R（PNRSV-CP-F：5′-AACTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAA-3′；PNRSV-CP-R：5′-GCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC-3′），利用引物對PNRSV-CP-F/R，擴增PNRSV CP基因片段。反應體系為cDNA 2 μL、Forward Primer（10" μmol/L）1 μL、Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL、TaqMix 12 μL、ddH2O補至" 25 μL。PCR擴增程序為94 ℃預變性3 min，" 94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。反應結束后取5 μL擴增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于紫外燈下觀察電泳結果并照相記錄。

1.5 PNRSV CP全長序列克隆測序

2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收，與pMD19-T Vector（TaKaRa）連接，后轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含50 mg/L Amp LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，將PCR鑒定為陽性的菌液送往西安擎科澤西生物科技有限責任公司測序，每個分離物測序的陽性質粒為3個重復。

1.6 序列一致性及系統(tǒng)發(fā)育

采用Vector NTI Advance 11（Invitrogen Corporation，CA，USA）軟件對測序結果進行校正和拼接，將得到的PNRSV CP基因片段與GenBank登錄的21個來源不同的PNRSV分離物基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用SDTv1.2軟件中的Clustal W算法進行核苷酸和氨基酸一致性分析。以蘋果花葉病毒（apple mosaic virus，ApMV）CP基因序列（登錄號：L03726）作為外群。利用MEGA 7軟件中的CLUSTAL W算法比對序列，用鄰接法（Neigh-bour-joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹。自展值設置為1 000，系統(tǒng)進化樹顯示閾值為50%。

1.7 基因重組分析

應用RDP3軟件對PNRSV各分離物進行重組分析，分析過程中采用RDP、GENECONV、BOOTSCAN、MAXCHI、CHIMAERA、SISCAN和3SEQ等7種方法，分子類型選擇線性。只有當P＜1.0×10-5時，序列被5種或以上的方法同時檢測到，重組事件才認為是可靠的。

1.8 種群遺傳距離分析和基因交流分析

使用MEGA 7.0軟件中Max ximum Composite Likelihood模型計算PNRSV CP分離物不同分組之間的遺傳距離，Gamma參數(shù)默認為1。

使用DnaSP v5軟件分析PNRSV CP分離物不同寄主之間的基因交流，以種群基因差異Fst值和基因流Nm值為參考來衡量種群間的遺傳分化程度和基因交流。若Fst=0，則兩種群基因型完全相似；Fst＜0.33，說明兩種群基因交流頻繁；若Fst=1，則兩種群完全隔離。當Nm＜1，表明這兩個分組之間很容易發(fā)生遺傳漂變；當Nm＞1，表明這兩個分組之間存在可以基因交流的渠道。

2 結果與分析

2.1 PNRSV的檢測結果

以cDNA為模板，利用特異性引物進行RT-PCR檢測，擴增出5條大小為675 bp的目標條帶（圖1）。在甘肅省蘋果部分產(chǎn)區(qū)PNRSV的平均檢出率為11.8%，蘭州地區(qū)和天水地區(qū)的平均檢出率分別為9.5%和22.2%。93份蘋果樣品中，富士、花牛中PNRSV的平均檢出率分別為" 11.1%和9.5%（62份‘富士’，12份‘花?！?，10份‘蜜脆’）（表１）。

2.2 序列一致性及系統(tǒng)發(fā)育分析

從檢測為PNRSV陽性的樣品中分別克隆并測序了5個PNRSV的CP基因，序列全長均為675 bp。將所獲得的5條全長CP基因序列依次輸入到BLASTn程序中，在GenBank數(shù)據(jù)庫中依次進行同源性序列搜索，發(fā)現(xiàn)樣品基因序列均與PNRSV的CP基因序列同源，證明獲得的5條序列均為PNRSV CP基因序列。將5個分離物根據(jù)地區(qū)分別命名為：TS2、TS7、TS12、TS25和LZ4（Genbank登錄號為：OR497818～OR497822）。分離物CP基因之間核苷酸和氨基酸序列一致性分別為97.3%～99.4%和" 95.5%～99.1%，其中TS12和TS25的核苷酸一致性最高為99.4%，TS2和LZ4的核苷酸一致性最低為97.3%。5個PNRSV分離物與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他21個PNRSV分離物全長CP基因核苷酸及氨基酸序列的一致性分別為91.5%～100%、89.6%～100%。其中KU977377和KU977378、JQ005032和JQ005042、JQ005042和JQ005038、JQ005032和JQ005038以及JQ005054和JQ005057的核苷酸一致性最高為100%，AF013285和AF013287的核苷酸一致性最低為91.5%。

利用MAGE軟件將5個序列與GenBank登錄的21個PNRSV分離物基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。以ApMV的CP基因序列作為外群，通過分析構建的系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，26個分離物共分為3組，本研究中的5個PNRSV分離物與1個美國分離物AF013287聚集在一起，形成一個新組；其余PNRSV分離物分別被聚集于PGI和PGII（圖2）。系統(tǒng)發(fā)育分析明確了來源于甘肅蘋果上PNRSV株系的系統(tǒng)分類地位，雖然26個PNRSV分離物CP基因間具有較高的核苷酸一致性，但26個分離物被分到3個不同的組群。

2.3 基因重組分析

為了解PNRSV分離物中是否存在潛在的重組事件，借助RDP3軟件中的RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiS can和3SEQ算法（P≤0.05為顯著），將5條PNRSV分離物與21條已報道PNRSV分離物基因組序列進行重組分析。結果顯示，用RDP3的7種算法檢測到2個潛在的重組事件（表2）。重組事件1的重組位點在150～248 nt，最低P值為" 2.393×10-9（SiScan），重組事件2的重組位點在70～272 nt，最低P值為3.275×10-2（SiScan）。

2.4 種群遺傳距離分析和基因交流分析

不同寄主間PNRSV CP基因的遺傳距離為0.007～0.049，其中蘋果（Malus domestica）和巴旦木（Prunus dulcis）的遺傳距離最高為0.049，遺傳差異顯著；櫻桃（P.avium）和巴旦木" （P.dulcis）以及櫻桃（P.avium）和西梅" （P.cerasifera）的遺傳距離最低為0.007，遺傳差異不顯著（表3）。

不同寄主間PNRSV基因的遺傳差異Fst為0.315～0.837，說明不同寄主之間存在不同程度的基因分化。其中，桃（P.persica）和巴旦木" （P.dulcis）的遺傳差異Fst最低為-0.315，其數(shù)值" |Fst|lt;0.33，表明這2個寄主種群之間存在頻繁的基因交流，這與系統(tǒng)發(fā)育樹中的結果一致，玫瑰（R.rugosa Thunb）和櫻桃（P.avium）的遺傳差異Fst最高為0.837，其數(shù)值|Fst|gt;0.33，表明這兩個寄主種群基因交流的頻率很低，與系統(tǒng)發(fā)育分析結果一致。不同寄主種群之間PNRSV CP基因的基因流Nm為-5.842～16.417。其中，桃（P.persica）和西梅（P.cerasifera）的基因流Nm最低為-5.842，其數(shù)值Nmlt;1，表明這2個寄主種群之間很容易發(fā)生遺傳漂變，PNRSV容易發(fā)生突變并產(chǎn)生新的毒株來適應并利用新寄主；櫻桃（P.avium）和巴旦木（P.dulcis）的基因流Nm最高為16.417，其數(shù)值Nmgt;1，表明這2個寄主種群之間存在可以基因交流的通道（表4）。

3 討論與結論

本研究采用RT-PCR的方法檢測后發(fā)現(xiàn)，在甘肅省蘋果主產(chǎn)區(qū)PNRSV的平均檢出率為" 11.8%，富士和花牛品種的蘋果中PNRSV的檢出率差異不明顯。由于采集的品種數(shù)量有限，PNRSV的侵染是否與品種有關需進一步的研究。近年來的研究表明，蘋果壞死花葉病毒（apple necrotic mosaic virus，ApNMV）可能是引起中國蘋果花葉的主要病原[27]，本研究中的PNRSV和ApNMV都屬于雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬（Ilarvirus）subgroup 3成員，基因組為正單鏈RNA分子，但其基因組結構不同，可通過分子檢測手段區(qū)分[27，30]。

本研究中的5個PNRSV分離物與1個美國分離物AF013287聚集在一起，在李正男等[31]的研究中AF013287分離物可能代表一個新的PNRSV組，本研究中的5個PNRSV分離物也屬于該組。長期以來，研究者基于RNA3的CP和MP基因將PNRSV分為3個組，即PV32、PV96和PE5組[32-33]。最新研究表明，PV32-Ⅰ、PV96-Ⅱ和PE5-Ⅲ分別被稱為PGⅠ、PGⅡ和PGⅢ[34]?；趯NRSV CP基因全長序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，26個PNRSV分離物被分成3個組，其余PNRSV分離物分別被聚集于PGⅠ和PGⅡ，這與李正男等研究結果一致。

對不同寄主PNRSV分離物進行遺傳多樣性分析，不同寄主間PNRSV基因的遺傳差異Fst為0.315～0.837、Nm為-5.842～16.417，說明不同寄主之間存在PNRSV基因交流以及遺傳漂變的現(xiàn)象。有限的基因交流頻率促使種群間有較高的遺傳分化，這與甘海鋒等[35]的研究結論相似，PNRSV在不同寄主間的基因交流可能是由病毒顆粒通過傳播媒介進入不同寄主，或者是通過自然選擇和適應性演化導致的，PNRSV在不同寄主間存在基因交流現(xiàn)象，對病毒的遺傳變異和適應環(huán)境起著重要作用。PNRSV在不同寄主間容易發(fā)生遺傳漂變說明該病毒的遺傳變異速度較快，寄主與病毒之間的相互作用影響病毒的遺傳漂變特征，并且病毒的遺傳漂變對病毒傳播和適應性具有重要影響?；蚪涣骱突蚱兪侵参锊《驹谶m應環(huán)境、擴散和致病性方面的重要途徑[36-37]。

綜上所述，甘肅省蘋果主產(chǎn)區(qū)已經(jīng)有PNRSV的發(fā)生，并有進一步發(fā)生蔓延的可能性，且獲得PNRSV CP序列聚集在RNA3中的一個新組，極大地豐富了PNRSV在甘肅省的遺傳信息，通過PNRSV在不同寄主間的遺傳多樣性分析，可以為植物病毒的防控和病毒進化機制的研究提供重要的理論基礎。

參考文獻 Reference：

［1］洪 健，李德葆，周雪平.植物病毒分類圖譜[M].北京：" 科學出版社，2001：150-151.

[2]FRANCKI R I B.The Plant Viruses，Volume I：PolyhedralVirions with Tripartite Genomes[M].NewYork：Plenum Press，1985：3-6.

[3]SANCHEZ-NAVARRO J A，PALLAS V.Evolutionary relationships in theilarviruses：nucleotide sequence of prunus necrotic ringspot virus RNA3[J].Archives of Virology，1997，142（4）：749-763.

[4]NICHOL S T，BEATY B J，ELLIOTT R M，et al.Virus Taxonomy.Classification and Nomenclature of Viruses：8th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses[M].Oxford：Academic Press，2005：695-716.

[5]FIORE N，F(xiàn)AJARDO T V M，PRODAN S，et al.Genetic diversity of the movement and coat protein genes of South American isolates of prunus necrotic ringspot virus[J].Archives of Virology，2008，153 （5）：909-919.

[6]OLIVER J E，F(xiàn)REER J，ANDERSEN R L，et al.Genetic diversity of prunus necrotic ringspot virus isolates within a cherry orchard in New York[J].Plant Disease An International Journal of Applied Plant Pathology，2009，93（6）：599-606.

[7]MMINK G I，HOWELL W E，COLE A，et al.Three serotypes of prunus necrotic ringspot virus isolated from rugose mosaic-diseased sweet cherry trees in Washington[J].Plant Disease，1987，71（1）：91-93.

[8]崔紅光.李屬壞死環(huán)斑病毒遺傳多樣性分析和致病相關基因鑒定[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2013.

[9]COCHRAN L C，HUTCHINS L M.A severe ring spotvirosis on peach[J].Phytopathology，1941，31：860.

[10] 韓麗娟，劉文洪.侵染百合的李屬壞死環(huán)斑病毒病（PNRSV）的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2007，40（9）：1943-1951.

[11]張 濤，吳云鋒，曹 瑛，等.李屬壞死環(huán)斑病毒病研究進展[J].北方果樹，2012（1）：1-3.

[12]KIONTI W M，NANCARROW N，DANN A，et al.Updating the quarantine status of Prunus infecting viruses in Australia[J].Viruses，2020，12（2）：246.

[13]CUI H，HONG N，WANG G，et al.Molecular characterization of two prunus necrotic ringspot virus isolates from Canada[J].Archives of Virology，2012 （17）：999-1001.

[14]DEY KK，VELEZ-CLIMENT M，SORIA P，et al.First report of prunus necrotic ringspot virus infecting red mulberry （Morus rubra） in the USA[J].Plant Disease，2020，104（5）：1565.

[15]CHANDEL V，RANA T，HANDA A，et al.Incidence of prunus necrotic ringspot virus on Malus domestica in India[J].Journal of Phytopathology，2010，156（6）：382-384.

[16]NOORANI M S，BAIG M S，KHAN J A，et al.Whole genome characterization and diagnostics of prunus necrotic ringspot virus （PNRSV） infecting apricot in India[J].Scientific Reports，2023，13（1）：4393.

[17]王國平，洪 霓，張尊平，等.遼寧、山東葡萄與核果病毒的田間調(diào)查[J].中國果樹，1996（4）：39-41.

[18]ZHOU Y" Y.First report of sweet cherry viruses in China[J].Plant Disease，1996，80 （12）：1429.

[19]劉曉萌，張 磊，李小燕，等.葡萄病毒B內(nèi)蒙古分離物全基因組序列分析[J].果樹學報，2022，39（10）：1911-1921.

[20]張明福，張永江，黃 沖，等.北京懷柔地區(qū)櫻桃上發(fā)現(xiàn)李屬壞死環(huán)斑病毒[J].植物病理學報，2005，35（6）：552-554.

[21]張 濤，吳云鋒，曹 瑛，等.西安地區(qū)櫻桃李屬壞死環(huán)斑病毒病鑒定和田間發(fā)生規(guī)律[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2009，" 18（6）：319-323.

[22]周登攀.石河子地區(qū)設施櫻桃病毒病害調(diào)查及病原病毒種類鑒定與檢測[J].新疆農(nóng)業(yè)科學，2017，54（4）：715-724.

[23]李正男，張雙納，張尊平，等.李屬壞死環(huán)斑病毒遼寧桃樹分離物基因組分析[J].園藝學報，2017，44（12）：2275-2284.

[24]強艷玉.甘肅省蘋果產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)效率及影響因素分析[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2018.

[25]韓 健，陳 臻，徐秉良，等.甘肅省蘋果病蟲害發(fā)生情況初探[J].植物保護，2012，38（6）：134-139.

[26]梁鵬博，張志想，劉 斐，等.蘋果花葉病病原鑒定中遇到的問題及其可能的病原探究[J].果樹學報，2016，33（3）：332-339.

[27]邢 飛，王紅清，李世訪.中國蘋果花葉病病原研究現(xiàn)狀分析[J].果樹學報，2020，37（12）：1953-1963.

[28]LI ZH N，JELKMANN W，SUN PP，et al.Construction of the full-length infectious cDNA clones of apple stem groovingvirus using gibson assembly method[J].Virus Research，2020，276：197-790.

[29]SONG S，LIU H，ZHANG J，et al.Identification and characterization of complete genome sequence of alfalfa mosaic virus infecting gynostemma pentaphyllum[J].European Journal of Plant Pathology，2019，154：491-497.

[30]XING F，ROBE B L，ZHANG Z X，et al.Genomic analysis，sequence diversity，and occurrence of apple necrotic mosaic virus，a novel ilarvirus associated with mosaic disease of apple trees in China[J].Plant Disease，2018，102：1841-1847.

[31]李正男，董雅鳳，張雙納，等.遼西李屬壞死環(huán)斑病毒檢測及其多樣性分析[J].植物病理學報，2017，47（1）：15-25.

[32]APARICIO F，SANCHEZ-PINA M A，SANCHEZ-NAVARRO J A，et al.Location of prunus necrotic ringspot ilarvirus within pollen grains of infected nectarine trees：evidence from RT-PCR，dot-blot and in situ hybridisation[J].European Journal of Plant Pathology，1999，" 105（6）：623-627.

[33]APARICIO F，PALLAS V.The molecular variability"" analysis of the RNA3 of fifteen isolates ofprunus necrotic ringspot virus sheds light on the minimal requirements for the synthesis of its subgenomic RNA[J].Virus Genes，2002，25（1）：75-84.

[34]KINOTI W M，CONSTABLE F E，NARELLE N，et al.Analysis of intra-host genetic diversity of prunus necrotic ringspot virus （PNRSV） using amplicon next generation sequencing[J].Plos One，2017，12（6）.

[35]甘海鋒，陳 雯，陳夕軍，等.水仙黃條病毒和水仙退化病毒的種群結構及遺傳多樣性特征[J].植物保護學報，2020，47（1）：187-196.

[36]GARCIA-ARENAL F，F(xiàn)RAILE A，MALPICA J M.Variability and genetic structure of plant virus populations[J].Annual Review of" Phytopathology，2001，39（1）：157-186.

[37]JONES R.Plant virus ecology and epidemiology：historical perspectives，recent progress and future prospects[J].Annals of Applied Biology，2014，164（3）：320-347.

Detection of Prunus Necrotic Ringspot Virus and Analysis of Its Genetic Diversity

WANG" Luofan，ZHANG Taoxia，LI Yunlong，SONG Haoqi and" CHEN Yahan

（College of Plant Protection，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Abstract To elucidate the occurrence and genetic variability of prunus necrotic ringspot virus （PNRSV） in selected apple-producing regions of Gansu Province，93 apple leaf samples with mosaic symptoms and asymptomatic samples were collected from 5 distinct areas.PNRSV was detected in Tianshui and Lanzhou apple samples by RT-PCR.The coat protein （CP） genes of five PNRSV isolates were cloned and subsequently sequenced." Sequence analysis revealed that the nucleotide and amino acid sequence identities among the five PNRSV isolates ranged from 97.3% to 99.4% and 95.5% to 99.1%，respectively.Compared with 21 additional PNRSV isolates from the NCBI database indicated nucleotide and amino acid sequence identities ranging from 91.5% to 100% and 89.6% to 100%，respectively.The phylogenetic tree constructed using the CP gene sequence of PNRSV categorized the 26 PNRSV isolates into three distinct groups.The five PNRSV isolates from this study clustered together with the American isolate AF013287，suggesting potential phylogenetic relationships.Gene exchange analysis indicated" frequent genetic interactions among PNRSV isolates from peach （Prunus persica） and almond （P.dulcis） populations，while genetic drift was more likely to occur readily between isolates from peach and prune （P.cerasifera）.

Key words Apple virus; PNRSV; Genetic diversity; Gene communication

Received 2023-08-03 Returned 2023-10-07

Foundation item Talent" Startup Program of" Gansu Agricultural University （No.GAU-KYQD-2019-22）; National Natural Science Foundation of China （No.32160628）; Natural Science Foundation of Gansu Province（No.21JR7RA820）;Innovation Fund Program of Gansu Higher Education Institutions（No.2021B-117）.

First author WANG Luofan，female，master" student.Research area：plant pathology.E-mail：1796819423@qq.com

Corresponding"" author CHEN Yahan，female，doctoral student，associate professor.Research area：plant virus.E-mail：yahanch@163.com（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）

收稿日期：2023-08-03 修回日期：2023-10-07

基金項目：甘肅農(nóng)業(yè)大學人才啟動金（GAU-KYQD-2019-22）；國家自然科學基金（32160628）；甘肅省自然科學基金（21JR7RA820）；甘肅省高等學校創(chuàng)新基金（2021B-117）。

第一作者：王駱凡，女，碩士研究生，研究方向為植物病理學。E-mail：1796819423@qq.com

通信作者：陳雅寒，女，博士研究生，副教授，主要從事植物病毒研究。 E-mail：yahanch@163.com