摘要" 為探討西北部分地區(qū)密點麻蜥的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以甘肅、寧夏和內(nèi)蒙古的8個采樣區(qū)域的密點麻蜥線粒體ATP6基因和線粒體控制區(qū)（D-loop）序列為分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴增并送樣測序，利用MEGA-X和DnaSP 6.1.2軟件分析不同種群密點麻蜥ATP6基因和D-loop區(qū)序列以及遺傳多樣性，以最大鄰接法（NJ）和最大似然法（ML）分別構(gòu)建NJ樹和ML樹，探討不同密點麻蜥種群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果表明，PCR擴增ATP6基因和D-loop目的條帶大小分別在400～600 bp和650～800 bp，條帶清晰符合預(yù)期；序列分析表明，ATP6基因序列的A+T= 55.6%，C+G= 44.4%，D-loop區(qū)序列的A+T= 61.7%，C+G=38.3%，堿基組成具有偏倚性。遺傳多樣性結(jié)果表明，寧夏陶樂地區(qū)密點麻蜥的ATP6基因單倍型數(shù)量（h）為8個，單倍型多樣性（Hd）為0.933，核苷酸多樣性（π）為0.013 78；D-loop在該地區(qū)h為6個，Hd為0.844，π為0.007 77，該區(qū)密點麻蜥種群的遺傳變異程度較高。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，在甘肅、寧夏和內(nèi)蒙古的8個采樣區(qū)域的密點麻蜥種群中均存在一定程度的基因交流。研究結(jié)果為密點麻蜥種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞" 密點麻蜥；線粒體DNA；系統(tǒng)發(fā)育分析；遺傳多樣性

中圖分類號" S813.24 """文獻(xiàn)標(biāo)識碼" A """文章編號" 1007-7731（2025）05-0047-06

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.05.011

Genetic diversity and phylogenetic analysis of Eremias multiocellata based on mitochondrial ATP6 gene and D-loop zone sequence

CAI Lei1 CHEN Wenhan1 XU Youhuang1 ZHANG Junzhe1 MA Yu1 LI You1，2

（1College of Life Sciences and Engineering， Northwest Minzu University， Lanzhou 730100， China;

2Gansu Tech-Innovation Centre of Animal Cell， Biomedical Research Centre， Northwest Minzu University，

Lanzhou 730030， China）

Abstract" To investigate the genetic diversity and phylogenetic relationship of Eremias multiocellata in some areas of Northwest China， mitochondrial ATP6 gene and mitochondrial control region （D-loop） sequence of 8 sampling areas in Gansu， Ningxia and Inner Mongolia were amplified by PCR and sent for sample sequencing. MEGA-X and DnaSP 6.1.2 software were used to analyze the ATP6 gene and D-loop zone sequences and genetic diversity of different populations of Eremias multiocellata. NJ and ML trees were constructed by maximum adjacency method （NJ） and maximum likelihood method （ML）， respectively， to explore the phylogenetic relationships among different populations of Eremias multiocellata. The results showed that the bands of ATP6 gene and D-loop amplified by PCR were 400-600 bp and 650-800 bp respectively， and the bands were clear and consistent with expectations. Sequence analysis showed that A+T=55.6%， C+G=44.4% in ATP6 gene sequence， A+T=61.7%， C+G=38.3% in D-loop zone sequence， with base composition bias. The genetic diversity results showed that the number （h） of ATP6 gene was 8， the haplotype diversity （Hd） was 0.933， and the nucleotide diversity （π） was 0.013 78. D-loops h was 6， Hd was 0.844， π was 0.00 777 in this area. The genetic variation of the population was higher in this area. Phylogenetic analysis showed that there were different degrees of gene exchange in 8 populations of Eremias multiocellatain in Gansu， Ningxia and Inner Mongolia. The results of this study provide a reference for the conservation and development of the germplasm resources of Eremias multiocellata.

Keywords" Eremias multiocellata; mitochondrial DNA; phylogenetic analysis; genetic diversity

密點麻蜥（Eremias multiocellata）屬有鱗目（Reptilia）蜥蜴亞目（Squamata）蜥蜴科（Lacertidae）麻蜥屬（Eremias），是卵胎生變溫動物，主要以昆蟲為食[1]，常見于北部和西北部的荒漠草原和半荒漠草原[2]。該物種不僅在維持生態(tài)平衡方面具有重要作用，還是一種具有較大開發(fā)潛力的動物藥[3]。目前，有關(guān)其藥用作用的研究越來越多，如應(yīng)用密點麻蜥治療肝炎肝纖維化已取得較好療效，其可有效改善患者癥狀[4]；其具有較好的抑制人胃癌MKN45細(xì)胞鐵死亡的作用[5]，因此加強對野生密點麻蜥種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實意義。

線粒體DNA作為重要的遺傳信息載體之一，具有相對分子量低、結(jié)構(gòu)簡單、拷貝數(shù)高、母系遺傳和無重組等特點，常用于物種鑒定、母系數(shù)量、系統(tǒng)發(fā)育和起源分析等[6]。線粒體ATP6基因在細(xì)胞能量代謝、遺傳穩(wěn)定性、疾病相關(guān)性、編輯位點多樣性和單拷貝性等方面發(fā)揮著重要作用，使細(xì)胞能夠高效產(chǎn)生能量、準(zhǔn)確傳遞遺傳信息、適應(yīng)不同環(huán)境和生理條件，以及維持細(xì)胞功能的正常進(jìn)行。另外，ATP6編碼的ATP合酶a亞基對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與作用的研究具有重要價值。線粒體控制區(qū)（D-loop）位于tRNAPro和rRNAPhe基因之間，不參與編碼蛋白，是mtDNA序列中變異較大的區(qū)域，進(jìn)化速度快，適用于親緣關(guān)系較近群體間的比較和種群水平的差異研究[7]。本研究以甘肅、寧夏和內(nèi)蒙古地區(qū)的8個采樣區(qū)域共計42只密點麻蜥為研究對象，對其線粒體ATP6基因和D-loop區(qū)序列進(jìn)行擴增，然后進(jìn)行遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析，以補充西北部分地區(qū)的密點麻蜥基礎(chǔ)遺傳資源，為保護(hù)和開發(fā)其種質(zhì)資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣本采自甘肅、寧夏和內(nèi)蒙古的8個區(qū)域，共采集了42只密點麻蜥的肌肉樣本（表1）。將采集的樣本置于無水乙醇與生理鹽水（1∶1）制成的組織保存液中，-20 ℃保存，用于后續(xù)分子生物學(xué)實驗。

1.2 試驗試劑與儀器

DNA提取試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；Premix Taq（Takara）；紫外分光光度計、Tanon 1600 凝膠成像儀器（上海天能科技有限公司）。

1.3 基因組提取與擴增

使用DNA提取試劑盒提取樣本DNA，并置于-20 ℃保存。使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳測定DNA濃度。根據(jù)GenBank中的密點麻蜥線粒體全序列，利用Primer Premier 5.0、Primer-BLAST和DNASTAR軟件分別設(shè)計2對引物，并參考得分值，選擇最優(yōu)引物（表2）。引物合成由湖南艾科瑞生物工程有限公司完成。

ATP6基因的PCR擴增體系（25 μL）：模板DNA 2 μL，濃度50 ng/μL；上、下游引物各1.5 μL，濃度10 mmol/L；Premix Taq 12 μL，濃度5 U/μL；無菌水8 μL。D-loop區(qū)序列的PCR擴增體系（25 μL）：模板DNA 2 μL，濃度50 ng/μL；上、下游引物各0.5 μL，濃度10 mmol/L；Premix Taq 12.5 μL，濃度5 U/μL；無菌水9.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55.1 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物使用1.4%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，使用Tanon 1600凝膠成像儀器觀察獲得的PCR擴增產(chǎn)物條帶是否達(dá)到目標(biāo)亮度，條帶中是否存在引物二聚體和假陽性的情況，并將擴增成功的PCR產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Geneious2024.0.5（https：//www.geneious.com）對測序結(jié)果進(jìn)行處理，將對應(yīng)的上下游測序結(jié)果序列拼接到一起，經(jīng)過人工校對得到密點麻蜥ATP6基因和D-loop區(qū)序列各42條。從GenBank上下載其他麻蜥屬蜥蜴的D-loop和ATP6基因序列，作為外群物種序列（表3），與校對完成的42條密點麻蜥的樣本序列進(jìn)行對比分析，最終確定D-loop序列的長度為712 bp，ATP6基因序列的長度為489 bp。將分析結(jié)果以fasta格式導(dǎo)出，做下一步分析。

1.4.1 序列分析 采用MEGA-X軟件對序列進(jìn)行多重比較，分析ATP6基因和D-loop區(qū)序列的堿基組成、變異位點等信息[8]。

1.4.2 遺傳多樣性分析 采用DnaSP" 6.1.2軟件對序列的遺傳多樣性進(jìn)行分析，統(tǒng)計序列的單倍型（h），單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（π）和Tajima’sD值等[9]。

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 使用MEGA-X軟件，Bootstrap（自展值）設(shè)為1" 000次，以最大鄰接法（NJ）和最大似然法（ML）分別構(gòu)建NJ樹和ML樹，在使用NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹中，采用p-distance法計算遺傳距離。在使用ML法構(gòu)建進(jìn)化樹中，首先需要使用Find" Best" DNA/Protein" Models（ML）的功能，找到BIC分?jǐn)?shù)最低的模型作為最佳模型，基于該模型構(gòu)建ML進(jìn)化樹。通過該功能可以得知，基于ATP6基因構(gòu)建ML樹的最佳模型為TN93（Tamura-Nei）+I，基于D-loop區(qū)序列構(gòu)建ML樹的最佳模型為HKY（Hasegawa-Kishino-Yano）+G+I。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增

由圖1可知，目的條帶符合預(yù)期大?。〝U增的ATP6基因和D-loop區(qū)序列目的條帶大小分別在400～600 bp和650～800 bp且清晰，條帶中不存在引物二聚體和假陽性的干擾，以部分樣品在2種擴增體系中的電泳結(jié)果為例。

2.2 序列分析

2.2.1 ATP6序列 在ATP6基因序列中A、T、G、C的平均含量分別為26.5%、29.1%、31.9%、12.5%，A+T=55.6%，C+G=44.4%；A+T含量高于G+C含量，堿基組成具有偏倚性。ATP6基因序列中包含保守位點363個，變異位點111個，單態(tài)突變位點36個，簡約信息位點75個，插入或缺失位點15個。

2.2.2 D-loop區(qū)序列 D-loop區(qū)序列中A、T、G、C的平均含量分別為34.4%、27.3%、26.1%、12.2%，A+T= 61.7%，C+G=38.3%，A+T含量顯著高于G+C含量，堿基組成具有偏倚性。D-loop區(qū)序列中包含保守位點618個，變異位點54個，單態(tài)突變位點12個，簡約信息位點42個，插入或缺失位點40個。

2.3 遺傳多樣性分析

由于B、F、G和H區(qū)域采集的樣本數(shù)較少，因此僅對A、C、D和E 4個采樣區(qū)域的密點麻蜥種群進(jìn)行遺傳多樣性分析。由表4可知，基于ATP6基因，A點的密點麻蜥單倍型數(shù)量（h）為3個，單倍型多樣性（Hd）為0.500，核苷酸多樣性（π）為0.006 93，平均核苷酸差異（k）為3.307 69，Tajima’s D值為-2.082 26lt;0。C點的密點麻蜥h為5個，Hd為0.709，π為0.012 12。k為5.781 82，Tajima’s D值為-2.105 80lt;0。D點的密點麻蜥h為8個，Hd為0.933，π為0.013 78，k為6.533 33，Tajima’s D值為-0.755 88lt;0。E點的密點麻蜥h為3個，Hd為0.833，π為0.008 39，k為4.000 00，Tajima’s D值為-0.824 07lt;0。

基于D-loop區(qū)序列，A點的密點麻蜥h為4個，Hd為0.603，π為0.002 83，k為1.923 08，Tajima’s D值為-1.849 23lt;0。C點的密點麻蜥h為5個，Hd為0.618，π為0.005 85，k為3.963 64，Tajima’s D值為-2.032 39lt;0。D點的密點麻蜥h為6個，Hd為0.844，π為0.007 77，k為5.288 89，Tajima’s D值為1.114 91gt;0。E點的密點麻蜥h為3個，Hd為0.833，π為0.005 14，k為3.500 00，Tajima’s D值為-0.817 34lt;0。其中，只有D點密點麻蜥的Tajima’s D值大于0，說明其密點麻蜥的單倍型數(shù)大于變異位點數(shù)，稀有等位基因較少，該地區(qū)的密點麻蜥種群可能沒有經(jīng)歷過種群擴張。

綜合4個采樣區(qū)域，D點的密點麻蜥ATP6基因和D-loop區(qū)序列的h，Hd和π的值均最大，表明該區(qū)域的密點麻蜥種群的遺傳變異程度最高

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4.1 ATP6基因 基于ATP6基因構(gòu)建的NJ樹和ML樹基本一致，所有密點麻蜥樣本位于同一分支上，天山麻蜥、準(zhǔn)噶爾麻蜥與密點麻蜥樣本聚為一支，說明其親緣關(guān)系較近；尤其是準(zhǔn)噶爾麻蜥，與C點的密點麻蜥樣本聚為一小支，親緣關(guān)系更為接近。而麗斑麻蜥、山地麻蜥和快步麻蜥聚為另外一支，且麗斑麻蜥和山地麻蜥聚為一小支，三者為明顯外群，與樣本密點麻蜥的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。密點麻蜥樣本分為明顯兩支，甘肅地區(qū)為一支，寧夏和內(nèi)蒙古地區(qū)為一支。在甘肅地區(qū)的密點麻蜥樣本中，A點的密點麻蜥樣本除M34以外全部位于同一分支上，C點的密點麻蜥樣本除了M52以外全部位于同一分支上，親緣關(guān)系密切。而M34與M52與A點的樣本聚為一支，表明與其親緣關(guān)系接近。M37（B）則與寧夏地區(qū)的密點麻蜥樣本聚為一支，與甘肅地區(qū)的密點麻蜥樣本親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，在內(nèi)蒙古地區(qū)的密點麻蜥樣本中，M96（G）和M100（H）聚為一支，親緣關(guān)系密切，并且與寧夏地區(qū)的密點麻蜥樣本親緣關(guān)系較為接近。在寧夏地區(qū)的密點麻蜥樣本中，M177（F）按采樣區(qū)域獨立分布，而E和D點的樣本均聚為一支，M74、M76和M87（E）聚為一小支，表示親緣關(guān)系更為密切，但M75（E）與D點的部分密點麻蜥樣本聚為一小支，表示兩者間樣本親緣關(guān)系更近。以上聚類結(jié)果說明寧夏和內(nèi)蒙古地區(qū)的密點麻蜥之間可能存在頻繁交流（圖2）。

2.4.2 D-loop區(qū)序列 由圖3可得，基于D-loop區(qū)序列構(gòu)建的NJ樹和ML樹基本一致，與ATP6基因相比，樣本在不同進(jìn)化樹中的位置和關(guān)系也基本相似。有所不同的是，從物種間關(guān)系上來看，在基于D-loop區(qū)序列構(gòu)建的NJ樹中，麗斑麻蜥和密點麻蜥不在同一分支上，與密點麻蜥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其余麻蜥均與密點麻蜥位于同一分支上，并且山地麻蜥和天山麻蜥聚為一小支，親緣關(guān)系更近。而在基于D-loop區(qū)序列構(gòu)建的ML樹中，除準(zhǔn)噶爾麻蜥與C樣本點的密點麻蜥樣本聚為一小支外，其余不同麻蜥種間沒有聚為一小支。

3 結(jié)論與討論

本研究中密點麻蜥ATP6基因和D-loop區(qū)序列的A+T含量分別為55.6%和61.7%，由于堿基A+T含量高的線粒體基因在進(jìn)化中更具優(yōu)勢[10]，因此相較于ATP6基因，D-loop在研究密點麻蜥的進(jìn)化關(guān)系中更具有優(yōu)勢。ATP6基因和D-loop的Tajima’s D值除陶樂地區(qū)的D-loop中密點麻蜥的Tajima’s D值大于0外，其他地區(qū)均小于0，表明陶樂地區(qū)密點麻蜥的單倍型數(shù)大于變異位點的個數(shù)，表示稀有等位基因是以低頻率存在，推斷該地區(qū)種群可能未經(jīng)歷過種群擴張。其他地區(qū)密點麻蜥的單倍型數(shù)小于變異位點的個數(shù)，表示稀有等位基因是以高頻率存在，推測在其他地區(qū)種群中低頻等位基因占主導(dǎo)作用。

遺傳多樣性是物種各水平多樣性的重要來源，也是生命進(jìn)化和物種進(jìn)化的基礎(chǔ)[11]。單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（π）是衡量遺傳多樣性的重要指標(biāo)，其值越高，代表了種群的遺傳多樣性較高[12]。在ATP6基因和D-loop區(qū)序列中Hd和π最高的是D點的密點麻蜥種群，ATP6基因中Hd=0.933，π=0.013 78；D-loop區(qū)序列中Hd=0.844，π=0.007 77，表明該地區(qū)的密點麻蜥樣本的遺傳變異程度相比其他地區(qū)更高。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，密點麻蜥樣本種群與其他5種麻蜥屬麻蜥存在不同程度的親緣關(guān)系，且明顯聚為兩支，甘肅地區(qū)為一支，寧夏和內(nèi)蒙古地區(qū)為一支。在甘肅地區(qū)的密點麻蜥樣本中，A和C區(qū)域之間部分樣本親緣關(guān)系較近，說明兩地之間可能存在基因交流現(xiàn)象，并且B區(qū)域中M37與寧夏地區(qū)的密點麻蜥樣本聚為一支，表明該地與寧夏地區(qū)的密點麻蜥樣本間可能存在基因交流。在寧夏地區(qū)的密點麻蜥樣本中，E和D的樣本均聚為一支，表明兩地之間存在頻繁的基因交流現(xiàn)象。在內(nèi)蒙古地區(qū)的密點麻蜥樣本中，雖然M96、M100均與寧夏地區(qū)的密點麻蜥聚為一支，但在進(jìn)化樹中的位置距離較遠(yuǎn)，推測內(nèi)蒙古地區(qū)的密點麻蜥樣本與寧夏地區(qū)的密點麻蜥樣本間可能存在輕度的基因交流。基因交流一方面可以促進(jìn)遺傳變異，影響群體遺傳多樣性，產(chǎn)生新的性狀組合；另一方面，過度的基因交流導(dǎo)致物種間差異減少、種群發(fā)生近交衰退和遺傳多樣性減少等，可能導(dǎo)致原始物種消失，造成優(yōu)良種質(zhì)資源不可逆地減少，從而破壞生態(tài)平衡。

綜上，本研究分析了不同地區(qū)密點麻蜥ATP6基因和D-loop區(qū)序列的遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果表明，相比于ATP6基因，D-loop在研究密點麻蜥的進(jìn)化關(guān)系中更具有優(yōu)勢，因此在未來有關(guān)密點麻蜥進(jìn)化關(guān)系的研究中可以偏向于D-loop；陶樂地區(qū)密點麻蜥樣本的遺傳變異程度相比其他地區(qū)更高，可以進(jìn)一步探索出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因；在甘肅、寧夏和內(nèi)蒙古地區(qū)的密點麻蜥種群間均存在基因交流，過度的基因交流在保護(hù)優(yōu)良的種質(zhì)資源上是不利的，但在一定程度上有利于增加物種的遺傳多樣性，因此，需要加強對密點麻蜥的遺傳多樣性監(jiān)測。

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（責(zé)任編輯：胡立萍）