摘要" 以辣椒品種羊角椒為試驗(yàn)材料，從中分離篩選內(nèi)生真菌，并通過形態(tài)學(xué)觀察和序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，考察不同碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖及可溶性淀粉）、氮源（氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀、酵母膏和蛋白胨）、促進(jìn)劑（吐溫-80和油酸）及pH（5.0～12.0）對(duì)該菌株生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，從羊角椒中分離出的內(nèi)生真菌菌絲正面白色絨毛狀，無色素產(chǎn)生，氣生生長(zhǎng)，質(zhì)地疏松；有隔膜，擔(dān)孢子橢圓形，頂端鈍圓；基因序列大小為515 bp，與Bjerkandera adusta在同一個(gè)分支上，可初步鑒定為煙管菌，并命名為煙管菌LJ-1。該菌生長(zhǎng)的最適碳源為蔗糖、最適氮源為酵母膏、最適促進(jìn)劑為油酸、最適pH在6.0～8.0，上述條件下菌絲生長(zhǎng)速度較為理想，且呈現(xiàn)出良好的長(zhǎng)勢(shì)狀態(tài)。研究結(jié)果為辣椒內(nèi)生煙管菌的深入研究提供參考。

關(guān)鍵詞" 辣椒；內(nèi)生真菌；煙管菌；分離鑒定；條件優(yōu)化

中圖分類號(hào)" Q939.5 """"""文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼" A"""""" 文章編號(hào)" 1007-7731（2025）05-0018-05

DOI號(hào)" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.05.005

Isolation， identification and optimization of growth conditions of endophytic fungi of Bjerkandera adusta in pepper

OU Mingyun""" SONG Min""" HE Jia""" FENG Siyan""" HU Xiuhong

（School of Life and Health Science， Kaili University， Kaili 556011， China）

Abstract" The endophytic fungi was isolated and screened from" pepper variety Yangjiaojiao， and identified by morphological observation and sequence analysis. The effects of different carbon sources （glucose， maltose， sucrose， lactose and soluble starch）， nitrogen sources （ammonium chloride， ammonium sulfate， potassium nitrate， yeast extract and peptone）， accelerators （Tween-80 and oleic acid）， and pH （5.0-12.0） on the growth of this strain were investigated. The results showed that the front side of the endophytic fungi mycelium isolated from the pepper was white fluffy-like， no pigment production， air growth and loose texture. Septate， spore-bearing oval， apical obtuse; The gene sequence size was about 515 bp， and it was on the same branch as Bjerkandera adusta， which can be preliminarily identified as Bjerkandera adusta and named Bjerkandera adusta" LJ-1. The optimal carbon source for the growth of the bacteria was sucrose， the optimal nitrogen source was yeast extract， the optimal accelerator was oleic acid， and the optimal pH was 6.0-8.0. Under the above conditions， the mycelium growth rate was ideal and showed a good growth state. The results provide a reference for further study of Bjerkandera adusta.

Keywords" pepper; endophytic fungi; Bjerkandera adusta; isolation and identification; optimizing conditions

煙管菌（Bjerkandera adusta），又稱黑管菌，屬擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）煙管菌屬（Bjerkandera），是一種木腐型真菌[1]。多數(shù)大型真菌的子實(shí)體不易被病菌或昆蟲侵襲[2]，且受傷后的子實(shí)體能產(chǎn)生大量具有抗菌、殺蟲等效果的活性代謝產(chǎn)物[3]，可作為生物防治植物病蟲害的重要資源。Dománski等[4]研究表明，煙管菌可有效防治在櫟樹上發(fā)生的褐腐病。汪華等[5]和張旭輝[6]報(bào)道指出，煙管菌對(duì)紋枯病菌、黃萎病菌和青枯病菌等具有較好的防治效果，以該菌株制備的散粒劑可以防治番茄青枯病、立枯病，棉花根腐病、黃萎病以及西瓜根腐病等。

近年來，相關(guān)研究表明煙管菌對(duì)番茄灰霉病菌[7]、柑橘炭疽病菌[8]、小麥赤霉病菌[9]、西瓜蔓枯病菌[10]和油菜菌核病菌[11]等植物病原菌均有良好的抑制作用。基于此，本研究從貴州地區(qū)的植物辣椒中分離、篩選并鑒定出一株煙管菌，探究不同碳源、氮源、促進(jìn)劑及pH對(duì)該菌株生長(zhǎng)的影響，為進(jìn)一步開發(fā)防治多種植物病害的生物制劑提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PDA培養(yǎng)基（分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；羊角椒，采購(gòu)于貴州省黔東南州凱里經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái)（上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司）；BGZ-246型電熱鼓風(fēng)干燥箱和LDZX-50kbs型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；光學(xué)顯微鏡和倒置光學(xué)顯微鏡（日本OlympusPCR）；Gel DOC XT凝膠成像系統(tǒng)儀 （美國(guó)BIO-RAD）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離純化 無菌條件下，將洗凈的新鮮羊角椒切成小塊（5 mm×5 mm），依次放入1%次氯酸鈉溶液中30 s后取出吸干，再放入75%乙醇中消毒20 s，最后用無菌水漂洗3次，吸干表面水分。將消毒好的辣椒組織小塊呈“品”字形置于PDA固體培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱于28 ℃培養(yǎng)3～5 d。待菌落長(zhǎng)出后，從中選取典型的白色單菌落進(jìn)行多次劃線分離培養(yǎng)，直至獲得純菌種。

1.2.2 菌株的分類鑒定 觀察平板培養(yǎng)中的菌株菌落形態(tài)特征，測(cè)定其生長(zhǎng)速率，于顯微鏡下觀察其孢子及菌絲形態(tài)特征。按照SK8259試劑盒操作步驟提取真菌基因組DNA，采用真菌通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：ITS（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），由上海生工合成。擴(kuò)增體系為25 μL：10×PCR Buffer 5 μL，50 mmol/L MgSO4 5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5 U/μL TaqDNA酶0.5 μL，正反向引物（10 μmol/L ITS1和ITS4）各1 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)定：預(yù)變性 95 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s，退火57 ℃，30 s，延伸72 ℃，90 s，30個(gè)循環(huán)；后延伸 72 ℃，10 min，4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中的BLAST對(duì)測(cè)序所獲的ITS序列進(jìn)行同源性比對(duì)，下載數(shù)據(jù)庫(kù)中相似度較高的同源序列，通過MEGA 5.0軟件采用Neighbor-joining法（檢驗(yàn)值Bootstap為1 000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[12-13]。

1.2.3 菌株生長(zhǎng)條件優(yōu)化 參照文獻(xiàn)[14]將菌種活化后，加入2 mL/L的吐溫-80孢子洗脫液，以接種環(huán)輕刮菌落表面反復(fù)吹打，之后將洗脫液保存在離心管中，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再用孢子洗脫液將濃度調(diào)至1×106/mL，備用。以碳源、氮源、促進(jìn)劑及pH為考察因素，探討不同碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖及可溶性淀粉）、氮源（氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀、酵母膏和蛋白胨）、促進(jìn)劑（吐溫-80和油酸）及pH（5.0～12.0）條件下菌株的生長(zhǎng)情況。配制不同的真菌液體培養(yǎng)基時(shí)，分別將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的20 g葡萄糖換算成有效成分含量相當(dāng)?shù)钠渌荚?、氮源或促進(jìn)劑物質(zhì)，調(diào)節(jié)pH，添加20 g/L瓊脂粉制成固體培養(yǎng)基；以不添加任何碳源或氮源物質(zhì)的培養(yǎng)基為對(duì)照組。平板接種后置于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)，并開始每天對(duì)不同生長(zhǎng)條件下的菌絲生長(zhǎng)速度進(jìn)行測(cè)量，直至菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)平皿，平行試驗(yàn)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

將純化獲得的菌株編號(hào)為L(zhǎng)J-1，該菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)第1天菌落直徑為17～18 mm，第2天菌落直徑為41～45 mm，第3天菌落直徑為72～74 mm；菌落整體呈圓形，菌絲正面白色絨毛狀，無色素產(chǎn)生，氣生生長(zhǎng)，質(zhì)地疏松（圖1A～B）；顯微鏡下菌絲具有隔膜，擔(dān)孢子橢圓形，頂端鈍圓（圖1C）。

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)測(cè)序，菌株LJ-1的基因序列大小約為515 bp。由圖2可知，LJ-1的基因序列與Bjerkandera adusta 在同一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最近，序列相似性為82%，與Trichoderma harzianum親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。初步判斷LJ-1菌株可能為Bjerkandera adusta，并命名Bjerkandera adusta LJ-1。

2.3 菌株的生長(zhǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 碳源 由圖3可知，同一菌株在不同碳源條件下的菌絲生長(zhǎng)速度有所不同。當(dāng)蔗糖為碳源時(shí)，菌株菌絲生長(zhǎng)速度最快，平均為2.27 cm/d，當(dāng)葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉為碳源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度較快，分別為2.17、2.10和2.04 cm/d；當(dāng)乳糖為碳源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度較慢，平均為1.58 cm/d，與蔗糖碳源組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。由此可知，菌株在固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的最適碳源為蔗糖。

2.3.2 氮源 以酵母膏和蛋白胨為氮源時(shí)，菌株在固體培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度較快，分別為2.41和1.97 cm/d，且兩者的菌絲長(zhǎng)勢(shì)均致密均勻；其次為硝酸鉀和硫酸銨，平均生長(zhǎng)速度分別為1.77和1.74 cm/d，但前者菌絲長(zhǎng)勢(shì)不良，菌絲體較稀疏，而后者菌絲長(zhǎng)勢(shì)均勻且密集；以氯化銨為氮源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最慢，為1.09 cm/d，長(zhǎng)勢(shì)較好，菌絲較均勻。酵母膏組、氯化銨組與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。綜合菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)可知，菌株生長(zhǎng)最適氮源為酵母膏（圖4）。

2.3.3 促進(jìn)劑 由圖5可知，同一菌株在不同促進(jìn)劑處理下的菌落生長(zhǎng)速度有所不同，在以油酸為促進(jìn)劑的固體培養(yǎng)基中菌絲平均生長(zhǎng)速度較快，為2.26 cm/d，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好，致密均勻；在以吐溫-80為促進(jìn)劑的固體培養(yǎng)基中菌絲平均生長(zhǎng)速度較慢，為1.77 cm/d，菌絲長(zhǎng)勢(shì)稀疏。綜合可知，菌株生長(zhǎng)最適促進(jìn)劑為油酸。

2.3.4 pH 由圖6可知，在pH 5.0～12.0的固體培養(yǎng)基上，菌株LJ-1具備一定的生長(zhǎng)能力。但其長(zhǎng)勢(shì)以及生長(zhǎng)速度存在一定的差異。在pH 6.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度較快，為1.61 cm/d，但菌絲生長(zhǎng)較稀疏不均勻；在pH為10.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度為1.59 cm/d，菌絲生長(zhǎng)致密均勻；pH為5.0和9.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度分別為1.54和1.52 cm/d，菌絲的分布極為稀疏且不均勻。在pH為11.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度為1.56 cm/d，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好且致密均勻；pH為12.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度較慢，為1.50 cm/d，菌絲長(zhǎng)勢(shì)不均勻，有的區(qū)域僅有少量菌絲勉強(qiáng)生長(zhǎng)，而大片的區(qū)域則完全沒有菌絲的蹤跡。與對(duì)照組相比，不同pH組間生長(zhǎng)速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。綜合考量菌絲的生長(zhǎng)速度以及長(zhǎng)勢(shì)情況，確定該菌株生長(zhǎng)的最適pH為 6.0～8.0。在這個(gè)pH范圍內(nèi)，菌絲生長(zhǎng)速度較為理想，且呈現(xiàn)出良好的長(zhǎng)勢(shì)狀態(tài)。

3 結(jié)論與討論

蔡文韜[15]從辣椒果肉中分離獲得一株解淀粉芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)辣椒疫霉病菌、辣椒黑霉病菌及辣椒炭疽病菌3種病原菌均有明顯的抑制作用。朱曉琴等[16]成功從辣椒內(nèi)生菌中篩選出1株解淀粉芽孢桿菌SQ6菌株，該菌株對(duì)膠孢炭疽菌呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。本研究從健康新鮮辣椒中分離獲得了1株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，初步確定該真菌為煙管菌，拓寬了辣椒內(nèi)生菌的種類。內(nèi)生菌來源不同、種屬不一，所需的營(yíng)養(yǎng)成分有所不同；其生長(zhǎng)的環(huán)境條件不同，導(dǎo)致各內(nèi)生菌的代謝途徑及產(chǎn)物、功能活性也必然存在差異[6，8，17]。因此，本研究從碳源、氮源、促進(jìn)劑及pH幾個(gè)因素探究了煙管菌 LJ-1生長(zhǎng)的最佳條件，發(fā)現(xiàn)該菌生長(zhǎng)的最適碳源是蔗糖，能夠?yàn)槠渖L(zhǎng)提供充足的能量來源；最適氮源為酵母膏，為其生命活動(dòng)提供關(guān)鍵的營(yíng)養(yǎng)支持；最適促進(jìn)劑是油酸，可有效促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育；最適 pH為6.0～8.0，在此條件下，其能夠良好地生長(zhǎng)繁殖。

綜上，本研究通過菌株的分離純化與鑒定，成功從辣椒上分離獲得了1株內(nèi)生真菌，命名為煙管菌LJ-1；該菌的最適碳源、氮源和促進(jìn)劑分別為蔗糖、酵母膏和油酸，最適pH為6.0～8.0。研究結(jié)果為辣椒內(nèi)生菌煙管菌的深入研究提供了參考，也為進(jìn)一步探索其生物學(xué)特性和應(yīng)用價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：胡立萍）