摘 要：【目的】研究不同抗性楊樹品種響應鹽堿脅迫的轉錄水平，挖掘楊樹耐鹽堿相關基因，為后續(xù)深入探討楊樹響應鹽堿脅迫的分子機制及后續(xù)遺傳轉化提供理論支撐。【方法】以楊樹耐鹽堿品種‘遼胡1號’和鹽堿敏感品種‘中遼1號’為材料，采用盆栽法，加入 NaHCO3溶液模擬鹽堿脅迫，利用轉錄組測序技術、生物信息學等方法分析鹽堿脅迫下不同抗性楊樹品種的轉錄水平，篩選與鹽堿脅迫相關的差異表達基因，隨機選取6個差異表達基因進行實時熒光定量PCR試驗，驗證轉錄組數(shù)據(jù)的準確性?！窘Y果】轉錄組測序結果表明，鹽堿脅迫下不同抗性楊樹品種之間共獲得5 273個差異表達基因，其中上調表達2 709個，下調表達2 564個。GO分析結果發(fā)現(xiàn)，共有4 203個差異基因被注釋到3大類37條通路中。KEGG分析結果發(fā)現(xiàn)，共有3 616個差異基因被注釋，差異基因顯著富集在植物信號轉導途徑（植物與病原體相互作用、植物激素信號轉導）、代謝途徑（淀粉與蔗糖代謝、碳代謝）和生物合成途徑（苯丙素的生物合成、氨基酸的生物合成）。鹽堿脅迫下MYB、ABC、WRKY、bHLH是差異基因較多的基因家族，篩選出CBL4、SOD2、bHLH35、ABCC10、CYP736A12、P5CS等差異基因表達顯著上調。qRT-PCR結果驗證轉錄組數(shù)據(jù)結果可靠?！窘Y論】本研究通過轉錄組測序技術對鹽堿脅迫下不同抗性楊樹品種進行比較分析，挖掘出與耐鹽堿性相關差異表達基因，為后續(xù)基因克隆和遺傳轉化奠定理論基礎。

關鍵詞：楊樹；鹽堿脅迫；轉錄組測序；差異基因

中圖分類號：S792.11 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2025）02-0122-09

基金項目：國家科技創(chuàng)新2030-重大項目（2023ZD0405603）；遼寧省農業(yè)科學院院長基金項目（2023QN2416）。

Transcriptome analysis of different resistant poplar varieties under salt alkali stress

LI Wenying， LI Xiaoyu， YANG Chengchao

（Poplar Research Institute of Liaoning Province， Gaizhou 115200， Liaoning， China）

Abstract：【Objective】To study the transcriptional levels of different resistant poplar varieties in response to salt alkali stress， explore the genes related to salt alkali tolerance in poplar， and provide theoretical support for further exploration of the molecular mechanisms of poplar response to salt alkali stress and subsequent genetic transformation.【Method】Using poplar salt alkali tolerant variety P. simonii×P.euphratica and salt alkali sensitive variety P.×canadensiscv.‘Zhongliao1’as materials， using the potted plant method， NaHCO3 was added to simulate salt alkali stress. Transcriptome sequencing technology， bioinformatics， and other techniques were used to analyze the transcription levels of different resistant poplar varieties under salt alkali stress. Differential expression genes related to salt alkali stress were screened， and six differentially expressed genes were randomly selected for real-time fluorescence quantitative PCR testing to verify the accuracy of transcriptome data.【Result】Through transcriptome sequencing， it was found that under salt alkali stress， different resistant poplar varieties obtained a total of 5 273 differentially expressed genes， of which 2 709 were upregulated and 2 564 were downregulated. GO analysis results revealed that a total of 4 203 differentially expressed genes were annotated into 37 pathways across three major categories. The KEGG analysis results showed that a total of 3616 differentially expressed genes were annotated， and the differentially expressed genes were significantly enriched in plant signal transduction pathways （plant pathogen interaction， plant hormone signal transduction）， metabolic pathways （starch and sucrose metabolism， carbon metabolism）， and biosynthetic pathways （phenylpropanoid biosynthesis， amino acid biosynthesis）. MYB， ABC， WRKY， and bHLH are gene families with more differentially expressed genes under salt alkali stress. CBL4， SOD2， bHLH35， ABCC10， CYP736A12， P5CS and other differentially expressed genes were significantly upregulated through screening. The qRT PCR results validate the reliability of transcriptome data.【Conclusion】This study compared and analyzed different resistant poplar varieties under salt alkali stress using transcriptome sequencing technology， and identified differentially expressed genes related to salt alkali tolerance， laying a theoretical foundation for subsequent gene cloning and genetic transformation.

Keywords： poplar tree； salt alkali stress； transcriptome sequencing； differentially expressed genes

由于自然因素如氣候干旱，以及人為因素如灌溉方式不合理、排水不暢、大量施用化肥等，使得鹽堿地面積日益擴大[1]。鹽堿脅迫是一種非常復雜且嚴重的非生物脅迫，當土壤含鹽量達到0.3%以上時，土壤中的植物就會遭受傷害，嚴重影響植物的生長和發(fā)育[2]。據(jù)統(tǒng)計，目前全球鹽堿地面積約為9.5×108 hm2，我國鹽堿地面積近1億hm2，約占全球鹽堿地面積的10%[3]，且分布較廣，從東北松嫩平原、東部濱海沿岸到西北內陸干旱、半干旱地區(qū)均有分布[4]，特別是東北松嫩平原是我國北方土壤鹽堿化最廣泛和最嚴重的地區(qū)。其中堿性鹽（NaHCO3）所造成的土壤鹽堿化要比中性鹽（NaCl）造成的土壤鹽堿化問題更加嚴重[5]，導致生態(tài)系統(tǒng)的平衡被破壞，森林資源和農作物的產量降低，對人類的生產和生活造成了嚴重的不良影響。

楊樹Populus L.具有生長速度快、易成活等特點，可以適應不同的氣候和土壤環(huán)境，在干旱、貧瘠、鹽漬的環(huán)境下也可以正常生長，是我國北方平原地區(qū)和沙區(qū)營造防護林和用材林的主要樹種，在生態(tài)林的建設中占有重要地位[4-5]。隨著高通量測序技術的發(fā)展，轉錄組學研究在植物相關機理研究、優(yōu)異功能基因的挖掘、分子標記開發(fā)等方面已有較廣泛的應用[6]。李菡[7]在對鹽堿脅迫下不同耐鹽性小麥進行轉錄組測序時，挖掘出38個表達趨勢相反的差異表達基因，這些基因可能是響應小麥鹽堿脅迫的關鍵基因，為小麥抗逆育種及鹽堿地小麥栽培管理提供了理論依據(jù)。呂博文等[8]在對蕨麻Potentilla anserine響應鹽堿脅迫的形態(tài)及轉錄組分析時發(fā)現(xiàn)，ERF、MYB、NAC、WRKY、MYB和bZIP是差異基因最多的轉錄因子家族。在鑒定油茶Camellia oleifera中WRKY基因家族在高鹽脅迫下的表達模式發(fā)現(xiàn)，CoWRKY11、CoWRKY14、CoWRKY20、CoWRKY29 和CoWRKY56基因在高鹽脅迫下均被誘導表達[9]。目前關于鹽堿脅迫下楊樹的響應分子機制已有研究報道，如84k楊PagERF114[10]、銀中楊Populus alba × P. Berolinensis的PabCIPK24等基因均被證實參與了植株的耐鹽性[11]，這些研究結果和數(shù)據(jù)都為探究楊樹在響應鹽堿脅迫的分子機制提供了理論基礎。

本研究對鹽堿脅迫下不同抗性楊樹品種進行轉錄組測序，分析差異基因變化差異，挖掘楊樹耐鹽堿相關基因，為深入研究楊樹耐鹽堿的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地選在遼寧省蓋州市，以楊樹耐鹽堿品系‘遼胡1號楊’P. simonii×P.euphratica（以下用LH表示）和鹽堿敏感品系‘中遼1號楊’P.×canadensis cv. ‘Zhongliao1’（以下用ZL表示）為材料，采用盆栽方法進行試驗。選取當年生扦插苗，截取直徑 1.6 cm、長20 cm左右的穗材，于2023年4月扦插到裝有河砂與珍珠巖比例為5∶1的花盆中，扦插后每個花盆重4.5 kg，加入60 mmol/L NaHCO3溶液模擬鹽脅迫，以加蒸餾水為對照（CK），每4 d澆一次鹽溶液和蒸餾水，37 d后分別采集同一高度位置新鮮葉片樣品，設3次獨立生物學重復，裝至凍存管于液氮速凍后，置于超低溫冰箱（-80 ℃）進行保存，分別記為ZL60-1，ZL60-2，ZL60-3和LH60-1，LH60-2，LH60-3。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取和檢測

委托百邁客（青島）有限公司完成轉錄組測序。采用試劑盒方法提取樣品總RNA，使用NanoDrop 2000分光光度計和Agient2100生物分析儀檢測提取RNA的濃度、純度（OD260/OD280）和完整性。

1.2.2 文庫構建和測序

樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，隨后片段化，以mRNA為模板，合成cDNA鏈并進行純化；純化的cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，最后通過PCR富集得到cDNA文庫，文庫檢測合格后，利用Illumina高通量測序平臺對cDNA文庫進行測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)質控和序列比對

為了保證數(shù)據(jù)分析的質量及可靠性，使用fastp軟件對測序所得到的原始數(shù)據(jù)（Raw data）進行過濾質控，得到干凈數(shù)據(jù)（Clean data），去除含有接頭和低質量的數(shù)據(jù)（Reads），再經原始數(shù)據(jù)過濾、測序錯誤率檢測、GC含量分布檢查，最終得到高質量的有效數(shù)據(jù)（Clean reads）。使用HISAT2軟件將Clean reads比對到已公開發(fā)表的毛果楊Populus trichocarpa參考基因組上，獲取reads在參考基因組上的定位信息[12]。

1.2.4 差異表達基因篩選

新轉錄本組裝后，使用TPM（Transcripts per million）法計算基因表達量，利用DESeq軟件對基因進行差異分析，差異表達基因檢測過程中，通過統(tǒng)計學模型進行假設檢驗概率的計算，對差異顯著性P值進行校正得到錯誤發(fā)現(xiàn)率（False discovery rate，F(xiàn)DR），將差異倍數(shù)Fold change（Fc）≥2且FDR<0.01作為差異基因的篩選標準。為了方便比較，將差異倍數(shù)取對數(shù)值，以log2Fc表示，log2Fc的絕對值越大，F(xiàn)DR值越小的基因在2組樣本中的差異變化越明顯。將篩選得到的差異表達GO、KEGG數(shù)據(jù)庫中進行注釋[21]，分析差異表達基因在不同數(shù)據(jù)庫中的分布，以圖形和表格的形式展示不同功能的差異基因數(shù)目及其生物學功能。

1.2.5 差異表達基因的熒光定量PCR驗證

轉錄組測序分析完成后，隨機挑選6個差異表達基因進行熒光定量驗證。以UBQ基因為內參基因，使用Primer5軟件設計特異性引物（表1），按如下反應體系進行配制，依次加入PowerUp SYBR Green Master Mix 5 μL，上游引物（Primer F）0.2 μL，下游引物（Primer R）0.2 μL，cDNA 1 μL，加ddH2O水至10 μL。PCR反應體系為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min。將各樣品的目的基因和內參分別進行 Real Time PCR 反應，每個樣本檢測3個復孔，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析。

2 結果與分析

2.1 提取RNA濃度檢測

提取的樣本RNA濃度在504～838 ng/μL，OD260/OD280值在2.13～2.14，完整性（RIN）均值為7.51，檢測結果均為A，綜上結果表明提取RNA 濃度較高，完整性好，符合質量要求（表2）。

2.2 轉錄組測序數(shù)據(jù)質控結果分析

對原始序列進行過濾和質控處理后，各處理樣本有效數(shù)據(jù)均達到5.81 G，質控過程中GC含量保持在44%左右，Q30堿基百分比在92.79%及以上。通過將reads數(shù)據(jù)比對到參考基因組上，獲得各個樣本的基因組比對情況，比對比例在85%以上，表明測序質量良好（表3）。

2.3 差異表達基因在不同數(shù)據(jù)庫分布

以Fold change（Fc）≥2且FDR<0.01作為差異基因的篩選標準，統(tǒng)計‘中遼1號’和‘遼胡1號’在NaHCO3脅迫后的差異表達基因的表達情況，共有5 273個差異表達基因，其中上調表達2 709個，下調表達2 564個。差異基因在各數(shù)據(jù)庫中的注釋情況如表4所示，在各數(shù)據(jù)庫中均有注釋，其中在NR（5 134條）、GO（4 203條）、KEGG（3 616條）數(shù)據(jù)庫中差異基因分布較多。

2.4 差異表達基因GO注釋分析

通過對差異基因進行GO注釋分析，共有4 203條差異基因分別注釋到生物學過程（Biological process）、細胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecular function）3大類的37個功能組中。在生物學過程中涉及的差異基因共分成21個功能組，其中差異基因在細胞過程（Cellular process）、代謝過程（Metabolic process）、生物調節(jié)（Biological regulation），對刺激的響應（Response to stimulus）等顯著富集。細胞組分中涉及的差異基因分成3個功能組，富集在細胞解剖實體（Cellular anatomical entity）、細胞內（Intracellular）和蛋白質復合物（Protein-containing complex）。分子功能中涉及的差異基因共分成13個功能組，其中差異基因在結合物（Binding）和催化活性（Catalytic activity）中顯著富集（圖1）。

2.5 差異表達基因KEGG分析

通過對差異基因進行KEGG注釋分析，共有3 616個差異基因定位到131個具體的代謝途徑分支中，其中差異基因在信號轉導途徑中富集較多，分別是植物與病原體相互作用（228條）和植物激素信號轉導途徑（150條），在代謝途徑和生物合成中也有富集，分別是淀粉與蔗糖代謝（104條）和碳代謝（78條）途徑，生物合成中的苯丙素（85條）和氨基酸的生物合成（72條）也顯著富集（表5）。

2.6 鹽堿脅迫下基因家族分析

在楊樹響應鹽堿脅迫時，MYB、bHLH、WRKY、bZIP、NAC、PYL和ABC等基因家族都發(fā)揮了作用，其中注釋較多的是MYB、ABC、WRKY和bHLH基因家族（表6）。

2.7 鹽堿脅迫相關基因篩選

篩選出楊樹鹽堿脅迫相關的差異表達基因，其中CBL4、SOD2、bHLH35、ABCC10、CYP736A12、WRKY72、WRKY31、P5CS、bZIP11、DIV、ABCB11等基因在楊樹耐鹽堿品種中表達上調，ABCG11、PYL4、NAC29基因在耐鹽堿品種中表達下調（表7）。這些基因可能是參與楊樹耐鹽堿性的關鍵基因。

2.8 差異表達基因qRT-PCR驗證

以鹽堿脅迫下的楊樹葉片轉錄組測序的cDNA為模板，對隨機選取的6個差異表達基因進行qRT-PCR驗證，熒光定量結果與轉錄組測序分析結果基本一致，進一步證明轉錄組測序結果的可靠性（圖2）。

3 討 論

土壤鹽堿化是影響植物生長和產量的一個世界難題，因此，探討植物耐鹽堿的分子機制具有重要的意義[13]。近年來，植物響應鹽堿脅迫的機制已成為不少學者研究的熱點，對大豆Glycine max[14]、駿棗[15]、藜麥Chenopodium quinoa[16]等植物分別從生長特性、生理指標、葉片結構、轉錄組、代謝組等方面對植物的耐鹽堿機制進行了研究，加深了人們對不同植物耐鹽機制的了解。

目前，關于楊樹耐鹽堿的分子機制研究較少，本研究以楊樹抗鹽堿性品種‘遼胡1號楊’和鹽堿敏感品種‘中遼1號楊’為材料，進行轉錄組測序，結果表明，鹽堿脅迫下2個楊樹品種共得到5 273條差異表達基因，其中表達上調2 709條，表達下調2 564條，對這些差異基因進行GO和KEGG富集分析，明確差異基因的生物功能和信號通路。GO功能注釋結果表明，差異基因在生物過程中的細胞過程和代謝過程顯著富集，在分子功能方面，差異基因在結合物和催化活性顯著富集。KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，差異基因富集到苯丙素生物合成、植物激素轉導、淀粉和蔗糖代謝等通路。這些通路可能是影響楊樹耐鹽堿性的重要因素，這與在對大豆耐鹽堿轉錄組測序結果一致[17]。碳代謝途徑在差異基因中也顯著富集，碳代謝包括植物呼吸作用和光合作用，為植物生長發(fā)育提供能量，有研究發(fā)現(xiàn)在50 mmol/L鹽濃度下，胡楊、新疆楊和小葉楊和胡楊的雜交種的光合呼吸作用會受到一定的促進作用[18]，以上結果表明這些功能和途徑在楊樹響應鹽堿脅迫中發(fā)揮重要作用。

細胞色素P450參與植物體內內源激素合成以及次生代謝[19] ，有研究發(fā)現(xiàn)人參Panax ginseng中細胞色素P450編碼的PgCYP736A12基因在Nacl脅迫后表達上調，該基因參與了除草劑的代謝[ 20]。本研究中CYP736A12基因表達上調，表明該基因在鹽堿脅迫下發(fā)揮一定的作用。CBL蛋白被鑒定為擬南芥Arabidopsis thaliana和水稻Oryza sativa鈣信號通路中的鈣離子傳感器，由CBL和其受體CIPKs形成的復雜信號網絡系統(tǒng)，在鈣離子的介導下能夠使植物遭受逆境脅迫時做出應答[21]。有研究表明，楊樹在遭受寒冷、干旱、鹽脅迫等非生物脅迫時CBL基因家族發(fā)揮重要的調節(jié)作用，在煙草中過表達MsCBL4能夠提高轉基因株系的耐鹽堿能力[22]；瞬時過表達ThCBL4基因提高剛毛檉柳Tamarix hispida耐鹽能力[23]；本研究中，PsCBL4在耐鹽堿性品種中表達上調，推測該基因在楊樹耐鹽堿性上發(fā)揮積極作用，但其具體功能還需進一步研究。ABCB和ABCC都是ABC轉運蛋白家族的一個亞家族蛋白，參與植物體內的跨膜轉運過程。水稻中的OsABCB11的基因表達受到 IAA、PEG及NaCl的誘導，在生長素及響應脅迫的過程中均發(fā)揮作用[24]；有研究發(fā)現(xiàn)在對水稻進行鹽誘導后，OsABCC10基因隨鹽脅迫濃度的升高及脅迫時間的延長，表達量也逐漸增加，并鑒定出OsABCC10是耐鹽基因[25]。本研究中，PsABCC10基因在耐鹽性強品種中表達上調，推測該基因是楊樹響應鹽堿脅迫的關鍵基因。P5CS基因是植物體內脯氨酸生物合成的關鍵酶，過表達P5CS 基因能有效提高植物的耐鹽性，有研究發(fā)現(xiàn)將大豆中的P5CS基因成功轉入水稻，并在NaCl脅迫后，轉入P5CS基因的水稻中的脯氨酸含量明顯提高，且耐鹽性得到增強[26]。本研究中PsP5CS基因在耐鹽性強品種中表達上調，推測在耐鹽堿性上發(fā)揮重要作用，可為后續(xù)挖掘利用P5CS基因并深入研究其功能奠定基礎。WRKY、bHLH、bZIP基因家族參與植物生長發(fā)育、組織分化等生物過程，在植物響應鹽堿脅迫的過程中也發(fā)揮重要作用[27]。本研究中PsWRKY72基因在耐鹽性強楊樹品種中表達上調，推測該基因是耐鹽堿的關鍵基因，有研究證實了這一點，對不同鹽脅迫下甘薯Ipomoea batatas進行轉錄組測序，挖掘到耐鹽相關基因 IbWRKY72，并對其表達模式進行了分析發(fā)現(xiàn)鹽脅迫誘導IbWRKY72 在甘薯根部的表達[28]。本研究中PsWRKY31在耐鹽堿性強楊樹品種中上調表達，有研究將歐美楊Populus×euramericana中WRKY31基因轉入到煙草中能增強植物的耐鹽能力[29]，可為后續(xù)遺傳轉化奠定基礎。PsbHLH35基因在楊樹鹽堿脅迫下也發(fā)揮關鍵作用，在本研究中，在鹽脅迫下耐鹽堿強品種中PsbHLH35表達量上調，bHLH35是一種鹽誘導的基因，主要集中在發(fā)芽種子和幼苗。OsbHLH35分別通過ABA依賴性和ABA非依賴性途徑介導發(fā)芽，減輕鹽脅迫下 ABA 對水稻發(fā)芽的抑制作用[30]。由此推測該基因具有調控植物抗鹽脅迫的功能，可為后續(xù)培育轉基因植株提供理論基礎。有研究對轉MsbZIP11基因下的擬南芥在抵御鹽堿脅迫方面的功能進行研究，發(fā)現(xiàn)在鹽誘導下轉MsbZIP11基因擬南芥相對野生型擬南芥根系更長，存活率更高[31]。本研究中PsbZIP11基因在鹽堿性強的品種中表達量高，推測PsMsbZIP11基因在楊樹響應鹽脅迫的應激反應過程中起到關鍵性作用。ABCG11[32]、PYL4[33]、NAC29[34]基因在植物響應鹽堿脅迫時也發(fā)揮重要作用。

本研究缺少對與鹽堿脅迫相關基因的生物學功能的深入研究，尚不清楚上述基因參與鹽堿脅迫的分子調控網絡。在后續(xù)研究中，將通過耐鹽堿相關基因克隆、功能驗證和遺傳轉化等試驗，探究上述基因在提升楊樹抗鹽堿能力的分子機制。

4 結 論

本研究通過轉錄組測序技術對鹽堿脅迫下不同抗性楊樹品種進行比較分析，獲得了質量較好的轉錄組數(shù)據(jù)和差異表達基因，并且篩選出與鹽堿脅迫相關的差異表達基因，為后續(xù)深入分析楊樹耐鹽堿的分子機理和遺傳轉化奠定了基礎。

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[本文編校：吳 彬]