摘要：猴痘是一種人畜共患的以皮膚出疹為特征的病毒性傳染病。隨著全球?qū)锒徊《镜年P(guān)注度不斷提高，對(duì)猴痘病毒檢測(cè)技術(shù)的需求也日益增強(qiáng)。本文將對(duì)猴痘病毒演變過(guò)程及目前主要使用的猴痘病毒的檢測(cè)方法，進(jìn)行歸納并對(duì)其檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)和發(fā)展方向進(jìn)行概述。

關(guān)鍵詞：猴痘；進(jìn)化；檢測(cè)方法；優(yōu)缺點(diǎn)

猴痘（MPXV）是一種脫氧核糖核酸病毒，國(guó)際病毒分類委員會(huì)將猴痘病毒分類為脊索病毒亞科、正痘病毒屬。猴痘潛伏期通常為7～14 d，最多可達(dá)21 d。猴痘病毒的感染期有三個(gè)階段，分別是潛伏期、發(fā)病期和皮疹期。從MPXV發(fā)現(xiàn)以來(lái)，病原學(xué)和血清學(xué)的檢測(cè)方法占主導(dǎo)地位，本文將對(duì)猴痘病毒演變過(guò)程及重點(diǎn)介紹常見(jiàn)的猴痘病毒檢測(cè)方法，并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行歸納總結(jié)，最后對(duì)猴痘病毒檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向進(jìn)行闡述。

1 猴痘病毒的進(jìn)化

1.1 病毒的起源與分類

1958年首次在實(shí)驗(yàn)猴體內(nèi)分離得到，嚙齒類動(dòng)物包括非洲松鼠、睡鼠、岡比亞袋鼠等都疑似是其自然宿主。1970年首次在剛果的一名男嬰體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，隨后確認(rèn)了人與人之間的傳播。猴痘病毒是由兩個(gè)遺傳支系組成：支系I（中非或剛果盆地支系）和支系II（西非支系），后者被認(rèn)為是2022年全球非地方性流行區(qū)暴發(fā)的主要亞型，病死率較低，而其中剛果盆地分支毒力更強(qiáng)，更容易導(dǎo)致人際傳播。據(jù)記載，猴痘病毒西非分支的病死率約為1%，其剛果盆地分支的病死率可能達(dá)10%。支系II又分為lla和llb，Clade l分為傳統(tǒng)的l和最新出現(xiàn)的變異株lb。

1.2 病毒的傳播與變異

猴痘病毒主要通過(guò)直接接觸感染動(dòng)物的病變滲出物、血液、其他體液，或被感染動(dòng)物咬傷、抓傷而傳播給人類。人與人之間則主要通過(guò)密切接觸傳播，也可通過(guò)飛沫傳播，接觸被病毒污染的物品也有可能感染。猴痘病毒暴發(fā)主要集中在男男性行為者，截至2024年7月31日，在WHO報(bào)告中，85.5%為男性（見(jiàn)

圖1），2024年2月1日—8月27日?qǐng)?bào)告的病例報(bào)告表中，95%（367/386）的病例自稱是與男性發(fā)生性行為的男性。在已報(bào)告的所有傳播類型中，性接觸傳播最為常見(jiàn)，占所有報(bào)告的388起傳播事件中的363起（93.6％）（見(jiàn)圖2）。

2023年，猴痘病毒出現(xiàn)了新的變異株，如“分支Ib”變異株。變異株lb出現(xiàn)在DRC，并迅速傳播到鄰國(guó)，這是譚德塞第二次宣布PHEIC的主要原因。根據(jù)非洲CDC的報(bào)告，DRC報(bào)告的猴痘病例中，有2.9%的病死率。這種變異株的傳播能力更強(qiáng)，甚至可以通過(guò)呼吸道飛沫傳播，增加了防控的難度。

1.3 全球疫情的發(fā)展

猴痘病毒起初在非洲西、中部的熱帶雨林地區(qū)流行，直到2003年第一次在美國(guó)報(bào)道，這是第一次在除非洲以外的地方暴發(fā)的猴痘疫情。2022年5月開(kāi)始，許多國(guó)家陸續(xù)通報(bào)了猴痘確診病例，區(qū)域范圍遍布于歐洲、美洲、非洲以及東南亞。至此，人們才真正意義上認(rèn)識(shí)到猴痘。WHO數(shù)據(jù)顯示，2022年1月1日開(kāi)始，非洲20個(gè)會(huì)員國(guó)向世衛(wèi)組織報(bào)告了猴痘病例。截至2024年9月1日，共6 294例實(shí)驗(yàn)室確診病例，包括54例死亡，已向世衛(wèi)組織報(bào)告。新毒株分支lb比2022年流行的分支ll毒株更具傳播性。不僅在剛果內(nèi)部傳播，還擴(kuò)散至布隆迪、肯尼亞、盧旺達(dá)和烏干達(dá)等先前從未報(bào)告過(guò)猴痘病例的國(guó)家或地區(qū)。

世界衛(wèi)生組織最新全球猴痘趨勢(shì)報(bào)告顯示，全球受影響最嚴(yán)重的10個(gè)國(guó)家合計(jì)占80%全球報(bào)告的病例。自2022年1月1日起，世衛(wèi)組織所在的6個(gè)區(qū)域已有121個(gè)成員國(guó)向世界衛(wèi)生組織報(bào)告了猴痘病例。截至2024年7月31日，共向世衛(wèi)組織報(bào)告了103 038例實(shí)驗(yàn)室確診病例和186例可疑病例，包括53例死亡。

2 MPXV的檢測(cè)方法

2.1 電鏡觀察

電子顯微鏡（EM）可用來(lái)觀察皮疹、水皰液和結(jié)痂中的病毒顆粒，在電子顯微鏡下，猴痘病毒直徑（200～250 nm）相對(duì)較大，被脂蛋白包膜和線性雙線DNA基因組包裹。因此，使用電子顯微鏡對(duì)新病毒的發(fā)現(xiàn)是非常重要的，可以為進(jìn)一步鑒定作出指示。

電鏡觀察的優(yōu)點(diǎn)也在于不需要使用特異性生物試劑就可直接觀察，但其敏感度較低，且要求樣本中有足夠量的病毒顆粒，另外，電鏡技術(shù)需要配備昂貴的儀器設(shè)備并需要專業(yè)操作人員，且考慮到樣品制備不僅耗時(shí)還復(fù)雜，大規(guī)模樣品檢測(cè)上不適用。因此，該方法不適合用作MPXV的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。

2.2 病毒分離培養(yǎng)

病毒分離培養(yǎng)法是檢測(cè)病毒性疾病的傳統(tǒng)方法。病毒分離培養(yǎng)方法主要用于動(dòng)物接種、雞胚接種和組織培養(yǎng)，該方法可以確定病毒的分類。猴痘病毒可來(lái)源自兔子、大鼠、老鼠和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物等。研究表明，MPXV在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中生長(zhǎng)良好，接種病毒后通過(guò)EM進(jìn)行觀察，隨后可使用免疫熒光和特異性抗體識(shí)別病毒顆粒。因此，病毒分離與鑒定對(duì)于研究新疾病、新病毒以及疫苗的研發(fā)有一定的研究意義。

病毒分離培養(yǎng)的結(jié)果雖然準(zhǔn)確，但檢測(cè)周期較長(zhǎng)。MPXV對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生物安全要求較高，需要有專業(yè)技術(shù)人員在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行分離培養(yǎng)操作。因此，一般不建議開(kāi)展MPXV病毒培養(yǎng)。

2.3 血清學(xué)檢測(cè)方法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）在多種細(xì)菌和病毒等疾病的診斷中應(yīng)用最廣。ELISA可用作檢測(cè)MPXV血清抗體的首選方法。雖然ELISA方法操作簡(jiǎn)單，不需要特殊設(shè)備，但操作時(shí)也需要注意抗體濃度、孵育時(shí)間以及環(huán)境溫度等對(duì)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生影響的因素。有關(guān)研究表明，ELISA對(duì)于檢測(cè)猴痘病毒感染的5 d和8 d后血清中的特異性IgM和IgG抗體相對(duì)較好。但MPXV與痘病毒之間存在抗原交叉反應(yīng)，其特異性較差，該方法對(duì)于大規(guī)模高危人群的血清流行病學(xué)調(diào)查有一定的指導(dǎo)性作用。

早在1971年，ELISA首次被報(bào)道建立。ELISA對(duì)于醫(yī)護(hù)人員等保護(hù)性較好，而且操作簡(jiǎn)便，能夠快速檢測(cè)大量樣本，而缺點(diǎn)是特異性相對(duì)較低，容易受到其他病毒感染的干擾，出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。

2.4 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

2.4.1 PCR檢測(cè)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是猴痘病毒確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”。它具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)。早在1995年，Ropp等[1]就發(fā)現(xiàn)編碼血凝素（HA）蛋白的基因組序列可以作為靶標(biāo)，利用該區(qū)域特異性的PCR引物鑒定正痘病毒（OPV）。然而，由于所有OPV都含有血凝素，因此該方法不能特異性地鑒定MPXV。為了改進(jìn)傳統(tǒng)PCR對(duì)MPXV的檢測(cè)，Meyer

等[2]報(bào)道，在PCR檢測(cè)中，可以利用編碼A型包涵體蛋白（ATI）的基因?qū)PXV與其他 OPV區(qū)分開(kāi)來(lái)。后來(lái)，Neubauer等[3]在ATI基因中發(fā)現(xiàn)每個(gè)MPV毒株均含有8bp缺失，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，該缺失可用于PCR對(duì)MPXV的特異性檢測(cè)?？子穹降萚4]利用猴痘病毒的靶基因片段F3L保守區(qū)域，設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物和一條探針，成功建立了RT-PCR檢測(cè)方法，其重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)限為36.5 copies/μL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能有效檢測(cè)MPXV，與其他正痘病毒無(wú)交叉反應(yīng)。與傳統(tǒng)PCR相比，實(shí)時(shí)PCR具有更高的檢測(cè)速度、靈敏度和特異性。疑似病例樣本的實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)是通過(guò)核酸擴(kuò)增測(cè)試完成的[5]。結(jié)合感染MPXV患者的癥狀，就可以對(duì)此進(jìn)行初步診斷。然而，對(duì)于采集皮損以外的標(biāo)本對(duì)MPXV的診斷作用還不明確，但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示對(duì)多個(gè)部位樣本進(jìn)行檢測(cè)可以提高靈敏度并減少假陰性檢測(cè)結(jié)果。目前已經(jīng)有許多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始優(yōu)化實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)的檢測(cè)能力。Chelsky等[6]開(kāi)發(fā)了一種無(wú)核酸提取的PCR方法，以提高M(jìn)PXV檢測(cè)的可擴(kuò)展性。這種方法可減少與傳染源進(jìn)行直接接觸以及提取試劑盒使用的問(wèn)題。該方法保留了原始PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，使其更適用于大規(guī)模檢測(cè)MPXV。2022年9月，F(xiàn)DA授權(quán)Quest Diagnostics生產(chǎn)檢測(cè)猴痘試劑盒，這是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)MPXV檢測(cè)試劑盒，同時(shí)為預(yù)防和控制猴痘疫情提供了及時(shí)和有效的支持。

2.4.2 LAMP檢測(cè)技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）能在等溫（60～65℃）

條件下，檢測(cè)時(shí)間大約為1 h內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，LAMP方法是2000年后才新起，其結(jié)果只需要目或視比濁檢測(cè)，這種方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等的特點(diǎn)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性，目前已在疫病防控、檢驗(yàn)檢疫和食品安全等領(lǐng)域廣泛研究與推廣。雖然LAMP檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)單，但一般需要2對(duì)或3對(duì)引物，對(duì)于引物設(shè)計(jì)要求較高且復(fù)雜，也會(huì)引起非特異性擴(kuò)增和假陽(yáng)性結(jié)果，會(huì)造成污染風(fēng)險(xiǎn)提高，且與PCR方法不同的是它對(duì)儀器要求低，不需要大型或昂貴的儀器進(jìn)行操作，檢測(cè)成本與PCR方法相比較低。許曉琳等[7]利用MPXV保守區(qū)OPG002 基因片段設(shè)計(jì)特異性引物，其MPXV 保守區(qū)OPG002基因片段設(shè)計(jì)特異性引物，使用LAMP技術(shù)在64℃恒溫反應(yīng)60 min即可完成DNA檢測(cè)，該方法能特異性地檢出MPXV，其檢測(cè)限均為25 copies/μL，其靈敏度比傳統(tǒng)PCR方法高約20倍，為臨床檢測(cè)MPXV提供了有效的靶標(biāo)。研究表明，LAMP技術(shù)可用于檢測(cè)MPXV的快速鑒定診斷。

3 結(jié)論

早在1958年，從最初的在猴子中發(fā)現(xiàn)猴痘病毒到逐漸傳播至人類，再到全球范圍內(nèi)的疫情暴發(fā)，猴痘病毒不斷挑戰(zhàn)著人類的公共衛(wèi)生體系，同時(shí)很多研究學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了很多檢測(cè)方法的研究與探索。WHO建議用PCR檢測(cè)病毒DNA作為MPXV的首選實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。通過(guò)檢測(cè)方法的比較分析，從實(shí)驗(yàn)室“人、機(jī)、料、法、環(huán)”等的角度考慮，最終也推薦PCR檢測(cè)方法用作實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，但現(xiàn)有的PCR檢測(cè)方法依然存在著一些缺陷，未來(lái)希望有更方便、更快速的檢測(cè)方法能應(yīng)用到檢測(cè)中來(lái)。具體可根據(jù)樣品及來(lái)源地去選擇不同的MPXV檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)有GB/T 14926.64-2001和SN/T 3487-2013發(fā)布的ELISA、PCR和熒光PCR的檢測(cè)方法，適用于猴痘的流行病學(xué)調(diào)查和口岸檢疫。

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