摘要：亞硝酸鹽氧化細菌（Nitrite Oxidizing Bacteria，NOB）是全球氮循環(huán)過程中的關鍵微生物，主要功能是將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽。近十年來基于現(xiàn)代分子生態(tài)技術的發(fā)展，NOB的研究取得了很大的進展，主要包括：NOB的碳氮代謝途徑及多樣性遠遠超過以往的認知，如NOB不僅可以氧化亞硝酸鹽，也可以氧化尿素、氨以及氰酸鹽獲取能量；豐富了NOB與環(huán)境因素的響應及生態(tài)位分化特征的研究，其中Nitrospira 更偏好于低氧的貧營養(yǎng)環(huán)境，中溫的富營養(yǎng)環(huán)境更有利于Nitrobacter 的生存；對NOB Nitrospira與全程氨氧化細菌（Complete Ammonia Oxidizer，comammox Nitrospira）之間的聯(lián)系與差異進行了初步探索，二者雖然同屬于Nitrospira 譜系并且都具備亞硝酸鹽氧化能力，但comammox Nitrospira 對亞硝酸鹽的親和力較低而對氨具有較高的親和力，主要分布在低氨的寡營養(yǎng)生境，而NOB Nitrospira 對亞硝酸鹽有較高親和力，主要分布在低亞硝酸鹽環(huán)境。本文基于上述最新研究進展進行了介紹與總結，并對該領域今后的研究進行了展望：在今后的研究中土壤環(huán)境或許可以成為NOB研究的新切入點；迫切需要探究縮短NOB分離和培養(yǎng)的方法并結合分子生態(tài)技術揭示NOB代謝多樣性的實際依據以及NOB在碳氮循環(huán)中的真正貢獻；探究NOB在代謝和生物化學方面的新機制，為揭示和預測NOB在環(huán)境中的響應提供理論支持。

關鍵詞：亞硝酸鹽氧化細菌；亞硝酸鹽氧化；代謝多樣性；全程氨氧化細菌；土壤

中圖分類號：X172 文獻標志碼：A 文章編號：2095-6819（2025）01-0011-11 doi： 10.13254/j.jare.2023.0791

氮循環(huán)是生態(tài)系統(tǒng)中物質能量轉化的重要組成部分，與生物代謝有著密不可分的關系[1]。而硝化作用是將氮的最低價態(tài)（NH3）轉化為最高價態(tài)（NO-3）的唯一過程[2]。在經典的兩步硝化理論中，硝化作用是一個兩步過程：第一步氨氧化反應是限速步驟，由氨氧化古菌（Ammonia Oxidizing Archaea，AOA）和氨氧化細菌（Ammonia Oxidizing Bacteria，AOB）將NH3 氧化為NO-2[3-5]；第二步亞硝酸鹽氧化作用將NO-2 氧化成NO-3，由亞硝酸鹽氧化細菌（Nitrite-Oxidizing Bacteria，NOB）催化[3，5]。傳統(tǒng)的觀念認為NOB代謝功能單一，對于NOB的代謝特點研究較少。事實上，NOB是全球氮循環(huán)過程中的關鍵微生物，在生態(tài)系統(tǒng)的氮素生物地球化學循環(huán)中具有重要作用[6]。亞硝酸鹽的去向決定了被活化的氮是留在土壤里還是被釋放到大氣中，并且NOB的豐度和活性是影響土壤中氮素固持的重要生物因素，對于維持土壤肥力具有重要意義，所以NOB 在氮循環(huán)中的重要調節(jié)作用不容忽視[6-7]。在過去的幾十年里，不斷有新的氮循環(huán)過程和氮循環(huán)功能微生物被發(fā)現(xiàn)，使人們對全球氮循環(huán)的理解發(fā)生了革命性的變化[3，5]。在NOB的Nitrospira 譜系Ⅱ（Cluster Ⅱ）中，全程氨氧化細菌（Complete Am?monia Oxidizers，comammox Nitrospira）的發(fā)現(xiàn)，即單個生物可以單獨完成將氨氧化為硝酸鹽[3，5]，打破了傳統(tǒng)的兩步硝化理論，使人們再次意識到NOB的物種多樣性和生理代謝機制復雜性。近年來，學者獲得了越來越多的Nitrospira 純培養(yǎng)物或富集培養(yǎng)物[3，5，8-9]，并發(fā)現(xiàn)了NOB類群中的部分菌株具備全新的代謝功能。近10 年來，新型生物檢測技術的發(fā)展推動了NOB的研究進展，NOB生理生態(tài)功能單一、代謝受限的認知也被打破，NOB 的系統(tǒng)發(fā)育多樣性和潛在的能量代謝功能得到了更多的重視。

1 NOB在氮循環(huán)的其他途徑中具有代謝多樣性

傳統(tǒng)的研究認為NOB依賴亞硝酸獲得能量并利用無機碳合成有機物[10]，具有高度功能特異性，自身代謝多樣性低，是嚴格的自養(yǎng)硝化微生物，而環(huán)境中的亞硝酸鹽累積較少，因此對NOB的研究并未受到過多重視。2006 年和2008 年，Starkenburg 等[11-12]對Nitrobacter 基因組序列的分析揭示了NOB 的基因組組成，發(fā)現(xiàn)Nitrospira 類群存在多種能量代謝的功能基因序列，推動了NOB 代謝功能相關研究的發(fā)展。而comammox Nitrospira 的發(fā)現(xiàn)[3，5]更加驗證了NOB的Nitrospira 類群在硝化過程中發(fā)揮的重要作用。

1.1 NOB具有尿素代謝活性

以往的研究認為亞硝酸鹽是NOB 的唯一底物，維系著NOB的亞硝酸鹽氧化能力[10]。而最近的研究卻發(fā)現(xiàn)，NOB還可以利用尿素為底物。2015年，Koch等[8]分析了Nitrospira 譜系Ⅱ的代表菌群N. moscoviensis基因組，并在Nitrospira 基因組中發(fā)現(xiàn)了尿素轉運蛋白和脲酶的編碼基因[8]。進一步將N. moscoviensis 純培養(yǎng)物置于含有1 mmol尿素的液體礦物培養(yǎng)基中孵育，幾小時后培養(yǎng)基上清液中游離氨濃度的升高證實了N.moscoviensis 的尿素代謝活性[8]。NOB 對尿素的利用這一重要發(fā)現(xiàn)打開了硝化微生物生存策略新視角：具有尿素代謝活性的NOB反過來可以為氨氧化微生物提供底物來源，而氨氧化微生物又為NOB提供亞硝酸鹽作為能量底物，維持了硝化微生物之間穩(wěn)定的共生機制[8]。2017 年，Ushiki 等[13]對活性污泥中分離得到的Nitspira sp. ND1基因組序列分析也發(fā)現(xiàn)了脲酶活性位點。2020 年，Kitzinger 等[14]利用13CCO2和15N-尿素、15N-銨態(tài)氮、15N-氰酸鹽及15N-亞硝態(tài)氮穩(wěn)定同位素核酸探針技術和單細胞測序技術，結合宏基因組學和轉錄亞組學，監(jiān)測了墨西哥灣海洋中的Nitrospinae 細胞對不同氮源的原位同化作用及細胞生長速率，結果證明Nitrospinae 主要利用銨和尿素來滿足同化氮的需求，并將獲得的能量主要用于自身的生長。NOB在氮代謝過程中的多樣性證明其在地球氮循環(huán)過程中具有舉足輕重的作用。作為Nitrospi?ra 中的一員，comammox Nitrospira 基因組中同樣含有脲酶基因，因此可通過降解尿素獲得氨[15]，這與部分AOA 和AOB 功能相似[16]。但不同的是，comammoxNitrospira 具有多個不同的尿素轉運體，除了高親和力的尿素ABC 轉運體[17]，還有兩個額外的尿素轉運體——外膜孔蛋白（fmdC）和尿素羧化轉運體（uctT），能夠參與對極低濃度短鏈酰胺和尿素的吸收[18]。另外，comammox Nitrospira 基因組還包括ureABCDFG 脲酶操縱子和urtABCDE 尿素轉運系統(tǒng)，表明comammoxNitrospira 具有對尿素的高親和力攝取系統(tǒng)[19]。這種特性可支持comammox Nitrospira 在尿素濃度低或波動較大的環(huán)境中生長，例如森林土壤[20]、污水處理廠[21]和反應器[22]。2021年，Li等[23]利用尿液廢水成功富集培養(yǎng)了三種包含完整尿素分解基因的comam?mox Nitrospira 富集物，并指出尿素可能是comammoxNitrospira 能夠選擇性富集的關鍵因素。然而，在分離的AOA 菌株N. viennensis[24]和N. gargensis[25]以及一些AOB菌株[26]中也發(fā)現(xiàn)了編碼脲酶和尿素轉運蛋白的基因。這些發(fā)現(xiàn)表明，comammox Nitrospira 將直接與AOA 和AOB 競爭環(huán)境中的尿素，并提高comammoxNitrospira 在氮代謝競爭中的優(yōu)勢。

NOB 對氰酸鹽（[OCN]-）的利用與尿素類似，N.gargensis 能夠通過氧化氰酸鹽為NH3 和CO2 獲得能量，同時形成的NH3 也可以為氨氧化微生物提供底物[27]。2020年，Kitzinger等[14]在墨西哥灣的研究也表明，NOB中的Nitrospinae 更傾向于同化利用銨和尿素而不是亞硝酸鹽，超過半數的Nitrospinae 細胞氮需量是來自尿素和氰酸鹽。因此以尿素或氰酸鹽為底物的生境有利于維持AOA/AOB-NOB共生體系[28]。

1.2 NOB在硝化過程中具有更廣泛的代謝多樣性

在硝化作用中，NOB 主要參與硝化作用中的第二個過程[4，27]，即催化亞硝酸氧化為硝酸鹽。研究發(fā)現(xiàn)歸屬于Nitrospira 譜系的comammox Nitrospira，不僅具有亞硝酸鹽氧化能力和尿素代謝能力，在comammox Nitrospira 細胞內還包含了硝化過程所需的氨單加氧酶（Ammonia Monooxygenase，AMO）、羥胺氧化還原酶（Hydroxylamine Oxidoreductase，HAO）和亞硝酸鹽氧化還原酶（Nitrite Oxidoreductase，NXR），能將NH3完全氧化成硝態(tài)氮[29]。2018年，Palomo等[30]對comammox Nitrospira 的基因組進行分析，并指出其關鍵代謝功能是進行全程硝化過程。為了驗證comammox Nitrospira 在不同生態(tài)環(huán)境中對硝化作用的貢獻，目前應用最多的研究方法是通過抑制劑法和穩(wěn)定性同位素核酸探針技術（DNA/RNA-based StableIsotope Probing，DNA / RNA - SIP）測定comammoxNitrospira 的活性[29]。多個研究團隊先后采用氯酸鉀（KClO3）和辛烷（C8H14）的雙抑制劑法評估了comammox Nitrospira 對旱地農田土壤和濕地沉積物氨氧化的貢獻[31-33]，其中KClO3主要是抑制亞硝酸氧化過程及硝酸鹽還原過程，C8H14 則可以在不影響AOA活性的情況下抑制AOB中amoA 基因的活性，從而達到選擇性抑制AOB 的效果[34]。但目前為止，KClO3 和C8H14 的雙抑制劑法對comammox Nitrospira的抑制機理尚未得到很好的研究，因此該方法對測定comammox Nitrospira 在硝化作用的貢獻仍存在局限性，需要進一步探究選擇抑制劑以確定comammoxNitrospira 對硝化作用的貢獻率。微宇宙培養(yǎng)試驗結合DNA-SIP技術同樣是驗證微生物代謝活性的重要方法。2019 年，Wang 等[35]利用微宇宙培養(yǎng)試驗結合13CO2 DNA-SIP技術證實了comammox clade B參與了森林和水稻土的硝化過程。2023年，Zheng等[36]利用13CO2 DNA-SIP技術證明了comammox Nitrospira 在三個典型污水處理廠的活性污泥中參與氨氧化，并且根據目前可用的代表性物種動力學參數量化了硝化微生物對硝化作用的相對貢獻，結果表明comammoxNitrospira 對氨氧化的貢獻是AOB的5～106倍，這不僅證明了comammox Nitrospira 在生態(tài)環(huán)境中的普遍存在，更佐證了comammox Nitrospira 在實際環(huán)境中對底物NH3的直接利用。穩(wěn)定性同位素核酸探針技術在探究活性硝化微生物中起到關鍵作用，其不僅包括DNA-SIP 還包括RNA-SIP，這兩者對于鑒定關鍵活性微生物同樣重要，而在大多數研究中只單獨應用其中一種技術，DNA-SIP 技術可以檢測微生物吸收同化的同位素，而RNA-SIP 則可以檢測具有活性的潛在緩慢生長或非生長細胞。在今后的研究中若可以結合兩種SIP技術并通過進一步的測序技術檢測標記的微生物類群分類情況，將更有助于提高研究的分類分辨率并以更確鑿的證據證明硝化過程中起關鍵作用的硝化微生物。

本文匯總了NOB的氮代謝功能多樣性，見圖1。傳統(tǒng)觀點認為，由于碳源不足，N2O主要在異養(yǎng)反硝化過程中產生[37]，而大量研究證明，硝化作用除了產生硝態(tài)氮之外，還能夠產生溫室氣體N2O[38-39]。自2016年以來，已有多個研究指出AOB 和AOA 是N2O的生產者[39-41]，在comammox Nitrospira 基因組中同樣包含了與N2O產生有關的HAO和NXR[3]，而沒有關于comammox Nitrospira 產生N2O 的明確報道。直到2019 年，Kits 等[42]報道comammox N.inopinata 可能通過非生物羥胺途徑轉化產生N2O，其釋放的N2O水平與AOA 相當，但遠低于AOB。N2O 的大量釋放將影響全球氣候變化，若是利用comammox Nitrospira 與AOA、AOB的競爭，在土壤和其他生態(tài)環(huán)境中采用更利于comammox Nitrospira 而不是AOB的生長條件，或許可以減少因硝化作用產生的N2O排放。因此在今后的研究中若能將comammox Nitrospira 耦合其他脫氮過程，或許可以在深度脫氮、降低成本、減少溫室氣體（N2O）排放等方面發(fā)揮重要作用。

2 NOB的碳代謝多樣性

碳循環(huán)也是生態(tài)系統(tǒng)中最重要的物質循環(huán)之一，NOB在調控和驅動碳循環(huán)的過程中同樣發(fā)揮著不可替代的作用[43]。以亞硝酸鹽為唯一電子源，二氧化碳為唯一碳源，氧為終端電子受體，NOB能夠進行自養(yǎng)碳固定過程[10]。

2.1 NOB具有多途徑的固碳模式

基因組分析顯示，Nitrobacter 利用卡爾文循環(huán)（Calvin Benson Bassham，CBB）進行碳固定，但Nitrospira 的固定途徑未確定[11，44]。直到2012 年，Sorokin 等[45] 在研究中指出Nitrospira 中的Nitrospinagracilis 通過還原性三羧酸（Reverse Tricarboxylic AcidCycle，rTCA）循環(huán)進行碳固定。2016年，Daims等[4]在NOB 菌株基因組學和細胞生理生態(tài)研究中再次指出，NOB存在多種固碳模式，包括rTCA循環(huán)及CBB循環(huán)，其中Nitrospira、Nitrospina、Candidatus Nitromaritima以及新發(fā)現(xiàn)的comammox Nitrospira均利用微需氧的rTCA循環(huán)進行碳固定，而Nitrobacter、Nitrococcus 、Thiocapsa、Ca. Nitrotoga和Nitrolancea 則利用耐氧的CBB循環(huán)進行自養(yǎng)碳固定[12，45-47]。相比之下，rTCA循環(huán)進行碳固定消耗的ATP更少，能源利用效率更高[4]。不同的碳固定方式也反映出NOB進化的多元性。

而在深海中，化能自養(yǎng)微生物的固碳作用對全球海洋內部的碳循環(huán)和生態(tài)環(huán)境具有重要影響[48]。2017年，Pachiadaki等[49]通過單細胞組學和宏基因組學研究指出Nitrospinae 是海洋中的優(yōu)勢NOB，在深海化能自養(yǎng)過程中起重要作用，促進了海洋中的碳氮耦合。同一研究還指出包括Nitrospinae 和Nitrospirae 在內的多種NOB單擴增組裝基因組都包含了三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶（ATP Citrate Lyase，ACL）和其他指示參與rTCA碳固定的基因，表明這些NOB在海洋碳循環(huán)中可能發(fā)揮著重要作用[49]。研究者利用放射性溶解無機碳（14DIC）孵育培養(yǎng)結合顯微放射自顯影技術與催化報告沉積熒光原位雜交技術指出，Nitrospi?nae 主要依靠亞硝酸鹽氧化產能固定了北大西洋西部中遠海15%～45%的無機碳，在深海固碳過程中發(fā)揮了重要作用[49]。那么NOB如何參與土壤中的固碳過程、貢獻率大小還需要進行進一步的探究。雖然該研究為探索NOB在固碳領域的研究提供了參考，但目前學者對于Nitrospinae 進行CO2 固定的貢獻仍存在爭議[14，22]，主要還是因為缺乏具有代表性的富集培養(yǎng)物。

2.2 NOB的其他碳代謝多樣性

Nitrobacter 并不是嚴格意義上的化能自養(yǎng)生物，在缺少亞硝酸鹽時，Nitrobacter 可以利用甲酸鹽或者丙酮酸進行碳同化維持生長[4]。從海洋生態(tài)系統(tǒng)和活性污泥中獲得的一些Nitrospira 也可以利用丙酮酸、甲酸鹽、甘油等簡單有機碳源代謝產能[50-51]。在重建的Ca. N. defluvii完整基因組中也發(fā)現(xiàn)了編碼代謝降解醋酸鹽、丙酮酸鹽和甲酸鹽同化的途徑[28]。2021 年，Bayer 等[52] 發(fā)現(xiàn)在海洋環(huán)境中的Nitrospiramarina Nb-295T能以甲酸為能源進行生長，并非完全的自養(yǎng)微生物。一氧化碳脫氫酶（Carbon MonoxideDehydrogenase，CODH）能夠催化CO 氧化為CO2 的反應或其逆反應，在微生物的代謝途徑中發(fā)揮關鍵作用[53]。2020年，Zhang等[48]在200 m和3 000 m深度海洋Nitrospina 的宏基因組中發(fā)現(xiàn)了大量編碼CODH的基因轉錄本，在北太平洋和南太平洋的轉錄組中同樣發(fā)現(xiàn)了CODH基因的高度表達，因此推測CO可以作為NOB的替代能源，支持NOB在海洋中的生存。

3 NOB在碳氮循環(huán)外的代謝多樣性

研究發(fā)現(xiàn)Nitrospira moscoviensis 的生長不僅只依靠氨氧化或硝酸鹽還原微生物提供的亞硝酸鹽，同時還可以通過氧化氫來進行呼吸作用[54]。2020年，Park等[10]在海洋沉積物中得到的NOB富集物中發(fā)現(xiàn)了編碼氫化酶（Hydrogenase，H2ase）的基因，這種酶具有氧化氫作為替代電子源的基因組潛力，可促進海洋NOB在厭氧條件下存活。并且以氧化氫氣產能進行代謝生長所獲得的能量（ΔG0=-237 kJ·mol-1 H2）要高于傳統(tǒng)氧化亞硝酸鹽體系所獲得的能量（ΔG0=-74kJ·mol-1 NO-2）[54]。在生物膜的基底區(qū)、海洋沉積物、地下含水層、稻田、深海熱液區(qū)沉積物和溫泉等低氧生態(tài)位中，好氧氫氣氧化可以提供額外的能量，并使至少一部分NOB獨立于氨氧化或硝酸鹽還原微生物提供的亞硝酸鹽[54]，有助于NOB 在環(huán)境中的廣泛分布。2020年，Park等[10]在海洋中富集培養(yǎng)得到的兩組NOB 中還發(fā)現(xiàn)了可能具有產生鈷胺素（又稱維生素B12）的遺傳潛力，因此可能在海洋沉積物鈷胺素的再循環(huán)中發(fā)揮重要作用。此外，comammox Nitrospira基因組還含有一個額外的胍丁胺酶（Agmatinase，AGM）基因，可以水解胍丁胺產生腐胺和尿素，這是comammox Nitrospira 區(qū)別于典型的硝化螺旋菌（Nitrospira spp.）系統(tǒng)的一個獨特性質[55]。尤為重要的是，全程氨氧化細菌基因組中缺乏一種同化亞硝酸還原酶（nirA）或octaheme 細胞色素C（OctahemeCytochrome C，OCC）的基因[17]，所以在以亞硝酸鹽作為唯一氮源時，comammox Nitrospira 將無法作為NOB生長。而當comammox Nitrospira inopinata 以氨氧化微生物生長在適宜的環(huán)境時，亞硝酸鹽可以在其細胞內累積，從而克服這種明顯的缺陷。NOB 的代謝多樣性使其能在缺乏亞硝酸鹽期間維持NOB 種群生長，以穩(wěn)定硝化作用并占據新的生態(tài)位。

4 NOB在環(huán)境中具有明確的生態(tài)位分化特征

對替代底物的代謝能力反映了NOB對缺乏氨和亞硝酸鹽環(huán)境的生態(tài)適應，而這種對波動環(huán)境條件的適應和響應也推動了NOB在不同生態(tài)系統(tǒng)中的廣泛分布[56]。目前大部分研究都集中于氨氧化過程的影響因素，而對亞硝酸鹽氧化過程的影響因素研究較少，主要是因為NOB 純菌分離培養(yǎng)的難度大，時間長，一般需要4～12年[28]。不同NOB之間存在基因組差異，可能使NOB 在環(huán)境中的生態(tài)位分化[2]。由于NOB生長速度對各種環(huán)境因素敏感[57]，因此不同環(huán)境因子也顯著影響著NOB的生態(tài)位分化。在NOB中，Nitrospira 和Nitrobacter 在環(huán)境中發(fā)揮著重要作用[58-59]，目前對NOB 的研究也主要集中于Nitrobacter和Nitrospira[60-61]。

4.1 養(yǎng)分有效性是影響NOB分布的重要因子

目前的共識是，亞硝酸鹽是NXR的首選底物，因此對亞硝酸鹽的親和力研究一直是NOB 的研究重點。NOB之間的生態(tài)位分化差異主要是因為對亞硝酸鹽的親和力不同，在環(huán)境中亞硝酸鹽并不容易累積，而具有高亞硝酸鹽親和力的Nitrospira 適應于低亞硝酸鹽濃度，這有助于Nitrospira 在自然生態(tài)系統(tǒng)中廣泛分布[28]。與之相反的是，Nitrobacter 具有更低的底物親和力，因此在富氮環(huán)境（接近腐爛的尸體、落葉后土壤、施肥土壤等）占主導地位時，豐度可能遠遠超過Nitrospira[60]。研究發(fā)現(xiàn)長期施用氮肥能顯著提高土壤Nitrobacter 的豐度[62]。與單施無機肥（NPK）相比，施用有機無機混合肥更能顯著提高土壤中Nitro?bacter 的豐度以及亞硝酸鹽氧化勢[7]。2018 年Han等[7]在對湖南亞熱帶地區(qū)的長期施肥實驗點研究中發(fā)現(xiàn)長期施用有機無機混合肥能顯著提高Nitrobacter的豐度，而Nitrospira 卻顯著受到施肥效應的抑制。然而，2020 年Ouyang 等[63]在美國猶他州的一個農用地中發(fā)現(xiàn)Nitrospira 是優(yōu)勢NOB，其占比大于97%。因此，施肥會對NOB 的群落結構產生影響，整體而言，富含氮素的環(huán)境可能更利于Nitrobacter 的生長，其豐度值遠遠超過Nitrospira。

根據r/K選擇理論，根據NOB生長速度和對底物的親和力，其被劃分為r-策略者和K-策略者。一般來說，r型微生物對養(yǎng)分輸入反應迅速，在底物充足的環(huán)境中生長速度較快，但對底物親和力較低，在與其他微生物競爭有限資源時可能處于劣勢[64]；K型微生物具有較高的底物親和力，生長速率較慢，在面對有限的底物濃度時能更好地占據和維持生態(tài)位[62，64-65]?；贜itrobacter 和Nitrospira 對亞硝酸鹽的親和力不同，Nitrospira 可能屬于K-策略者[66]，在很低的亞硝酸鹽環(huán)境中也可以達到很高的數量。相比之下，Nitro?bacter 是r-策略者[32]，喜歡更高的亞硝酸鹽濃度并且比Nitrospira 生長更快[67]。然而，在2013 年，Ollivier等[68]就已經指出Nitrospira 與Nitrobacter 對氮素環(huán)境的偏好并非是絕對的，研究者在對施用糞肥后的草地研究中發(fā)現(xiàn)Nitrospira 更占優(yōu)勢，其豐度明顯要高于Ni?trobacter，可能是由于施肥后土壤AOB豐度以及活性受到有機糞肥的抑制，導致了土壤中亞硝酸鹽有效含量降低[68]。事實上，以往研究發(fā)現(xiàn)在亞硝酸鹽濃度較低環(huán)境下，Nitrospira 比Nitrobacter 更具競爭優(yōu)勢，且Nitrospira 豐度通常與較低亞硝酸鹽濃度呈正相關[69]。但是全程氨氧化細菌的純培養(yǎng)物comammox Nitrospi?ra inopinata 對亞硝酸鹽的親和力較低，comammox Ni?trospira inopinata 亞硝酸鹽半飽和常數與NOB 中的Nitrobacter 相當，卻是傳統(tǒng)NOB中Nitrospira 亞硝酸鹽半飽和常數的15.7～49.9倍[70-71]（表1）。

4.2 氧氣濃度對NOB的活性產生重要影響

亞硝酸鹽氧化作用是好氧過程，氧氣濃度可在抑制或增強NOB的活性方面發(fā)揮重要作用[74]，從而影響NOB 在生態(tài)系統(tǒng)中的生態(tài)位分化[75]。生物膜、沉積物、土壤以及海洋不同深度的氧梯度差異也可能為共存的NOB提供生態(tài)位分化條件。水稻生長過程中由淹水管理引起的氧濃度變化可能對NOB的豐度產生很大影響[6]。2013 年，Olliver 等[68] 在研究中發(fā)現(xiàn)Nitrobacter 更傾向于棲息在水稻根際，而土壤表面的Nitrospira 比根際更為豐富。在缺氧環(huán)境中觀察到添加高于0.6 μmol·L?1的O2抑制了NO-2的氧化，這表明適應缺氧環(huán)境的NOB 主導了亞硝酸鹽氧化過程[76]。研究者不僅在土壤中發(fā)現(xiàn)了NOB 對氧氣的偏好差異，在海洋氧氣最低區(qū)域的不同深度同樣發(fā)現(xiàn)了NOB 的生態(tài)位分化[76]，表明不同NOB 之間的O2 耐受性差異。Han 等[6]在油菜籽-水稻輪作試驗中得出，Nitrospira 中相同系統(tǒng)發(fā)育譜系的個體之間生理特性同樣存在差異。2015 年，F(xiàn)itzgerald 等[77] 也在Nitrospira-NOB中發(fā)現(xiàn)偏好低溶氧的類群（代表純菌為Nitrospira moscoviensis）和缺乏抗氧化防御機制酶的偏好高溶氧的類群（ 代表純菌為Nitrospiradefluvii），證明了Nitrospira 中不同菌種對氧有效性的不同偏好。在實際應用中，通過調節(jié)氧氣含量可在缺氧條件下選擇性抑制NOB，這是硝化反應器中調控AOB 與NOB 之間競爭以控制硝化作用的策略之一[78]。

對氧的親和力及產氧能力可能是影響不同NOB之間生態(tài)位分化和競爭的重要原因[59]。NOB 中Ca.N. defluvii的亞氯酸鹽歧化酶（Chlorite dismutase，Cld）已被證明可將亞氯酸鹽還原為氯化物和O2，而研究同樣指出水樣中增加的溶解氧（Dissolved Oxygen，DO）能抑制Ca. N. defluvii 的活性[75]。因此需要進一步的研究來檢測環(huán)境中產氧代謝對NOB代謝活性的影響[59]。此外，低氧水平被認為是comammox Nitrospi?ra 與其他硝化菌競爭的關鍵因素[79-80]，而Li等[23]在DO濃度高于4 mg·L?1時實現(xiàn)了comammox Nitrospira 的富集。2020年，一項研究調查了14個污水處理廠，結果表明氧水平與comammox Nitrospira 豐度之間并沒有明顯的相關性[81]，這些結果表明氧水平可能不是決定其他硝化微生物與comammox Nitrospira 之間競爭優(yōu)勢的關鍵因素。

4.3 溫度是影響亞硝酸鹽氧化過程的關鍵因素

溫度在亞硝酸鹽氧化的生物學過程中起著關鍵作用，溫度變化會造成微生物的生理學變化，不僅影響細胞膜的流動性以及酶的活性，還會影響NOB的生長速度，改變自然生境中NOB的群落結構[57]。例如污水處理廠（WWTP）的關鍵NOB是Nitrospira 支系Ⅰ和Ⅱ[82]，Nitrotoga 是工程系統(tǒng)[83] 中另一組重要的NOB，Nitrospira 能夠在很寬的溫度范圍內（10～28 ℃）生長，在南海海洋約4～29.3 ℃的溫度范圍內發(fā)現(xiàn)了Nitrospira 的廣泛分布，表明Nitrospira 對南海不同溫度具有較好的適應性[84]。在南海深海區(qū)發(fā)現(xiàn)了與Ni?trospira 高度相關的OTU，其相對豐度與溫度呈負相關，意味著南海中可能存在未知的耐低溫Nitrospira新物種[84]。

不同NOB 對溫度的偏好也有差異，富集培養(yǎng)的Nitrotoga 菌株最適溫度和pH值分別為22 ℃和6.8，而Nitrospira defluvii（來自WWTP的Nitrospira 譜系Ⅰ）在32 ℃和pH 7.3下生長最好[85]。在溫度為15～30 ℃時，Nitrobacter 的活性隨著溫度的增加而增加[57]。在污水處理廠中，季節(jié)性的溫度變化也為適應中溫環(huán)境的Nitrospira 和偏好低溫的Nitrotoga 提供了共存條件[4]。2021 年，Sun 等[57]闡述了Nitrobacter 中N. wiogradskyi和N. hamburgensis 的共培養(yǎng)物對亞硝酸鹽氧化動力學與溫度的關系，研究指出培養(yǎng)物的最大活性（rmax）為93.58 mmol·L-1 ·g-1 ·d-1，生長速率常數（μmax）為1.311 d-1，最適溫度為30 ℃。該研究還指出共培養(yǎng)物的活性和亞硝酸鹽氧化能力對溫度敏感，當溫度為35 ℃時，共培養(yǎng)物的亞硝酸鹽氧化能力喪失，并且溫度對共培養(yǎng)物的影響是不可逆的，在溫度恢復至25 ℃后仍無法恢復共培養(yǎng)物的亞硝酸鹽氧化能力[57]。2013年一項Meta分析的結果表明，溫度對草地土壤的氮循環(huán)過程影響并不明顯[86]。2020年，Séneca等[87]在奧地利的一個高寒草原長期氣候變化實驗站開展的研究同樣支持這一觀點，研究指出溫度改變并不能影響土壤氨轉化過程，溫度升高后土壤中氮相關微生物的豐度、組成和活性并未受到影響。以上研究結果表明不同生態(tài)系統(tǒng)中的硝化微生物對溫度的敏感程度仍存在差異，還需后續(xù)進一步的研究探究不同NOB菌群對溫度的偏好。

4.4 pH是影響NOB富集組成的關鍵因素

pH也會顯著影響硝化微生物的活性以及硝化作用的強弱，同時pH值是調控NOB富集的重要因素[66]。pH值從根本上影響氨氧化微生物的底物NH3與NH+4的平衡，進而影響亞硝酸鹽氧化過程的底物有效性，最終影響NOB[88-89]，甚至pH還可能會對NOB細胞產生毒害作用[89]。與氨氧化細菌AOB相比，NOB對pH的敏感性似乎更高。研究發(fā)現(xiàn)NOB在中性或微偏堿性的環(huán)境中具有更高的活性，Nitrospira 最適生長pH為7.6～8.3[66]，Nitrobacter 最適生長pH 為7.6～8.2[90]，因此在過酸或者過堿的環(huán)境下亞硝酸鹽氧化作用均會明顯減弱[62]。前人的研究一直未找到嚴格嗜酸NOB，2006年，Hawkins等[91]在長期施用有機肥的紅壤中，發(fā)現(xiàn)了對pH值適應范圍更廣（4.83～6.54）的NOB類群，極大地拓寬了人們對亞硝酸鹽氧化作用在酸性環(huán)境下的理解。直到2012 年，Kuang 等[92]在一些強酸性（pH=2.6±0.45）的環(huán)境下也仍然發(fā)現(xiàn)有大量Nitrospira（Leptospirillum spp.）的分布，說明在Nitrospira 種群內也可能存在對pH有不同適應偏好的菌種。因此，在今后的研究中應該考慮到嗜酸或耐酸NOB存在的可能性。Liang等[93]在為期四年的田間試驗土壤樣品中發(fā)現(xiàn)土壤pH 值也是影響Nitrospira 群落結構的主要驅動因素。2021年，王智慧等[94]在三種pH紫色土中發(fā)現(xiàn)不同NOB 類群之間的生態(tài)位分化，其中Nitrospira在中性紫色土中豐度最高，而Nitrobacter 則偏好石灰性紫色土生境，驗證了在土壤環(huán)境中NOB對不同pH的偏好策略。

目前的研究多通過人為控制單一環(huán)境變量來探討單一因素對NOB的影響，而在實際環(huán)境中，各種環(huán)境因子之間也有著密不可分的聯(lián)系。同時土壤環(huán)境復雜多變，在土壤中究竟是單一因素還是不同環(huán)境因子之間的綜合作用（如拮抗作用或協(xié)同作用等）影響亞硝酸鹽氧化過程尚不能做出一個明確的判斷。在今后的研究中，還需要進行更進一步探索實際原位土壤環(huán)境中多個變量對NOB菌群影響的交叉研究。

5 comammox Nitrospira 與NOB Nitrospira 的生態(tài)位分化

雖然comammox Nitrospira 屬于NOB 中的Nitrospira 譜系[3，5]，但兩者在環(huán)境中可能具有明確的生態(tài)位分化。comammox Nitrospira 同時具有AMO和NXR編碼基因[3，5]，既可以發(fā)揮AOB的氨氧化功能也可以完成NOB 在亞硝酸鹽氧化過程中的作用。與NOB Nitrospira 相比較，comammox Nitrospira 在硝化過程中可以獲得更多的能量，而代價則是生長速率緩慢[3]。這些生理和代謝的差異意味著comammoxNitrospira 可能在不同的環(huán)境中占據優(yōu)勢，體現(xiàn)出生態(tài)位分化的特征。同時，硝化微生物之間又存在一種共存的關系：NOB 依賴于氨氧化微生物產生的亞硝酸鹽，而氨氧化微生物AOA、AOB 和comammoxNitrospira 同樣又得益于NOB 對亞硝態(tài)氮的解毒，因此硝化微生物之間是一種互利共生的關系，在同一環(huán)境中出現(xiàn)時會產生生態(tài)位分化以減少資源競爭[95]。2020年，Li等[96]研究指出comammox Nitrospira 與NOB對于長期施肥響應一致，有機肥的施用促進了comammox Nitrospira、Nitrobacter 和Nitrospira 群落之間的耦合聯(lián)系，提高了土壤硝化速率。comammoxNitrospira inopinata 以亞硝酸鹽為底物時的基質比利用率相較于NOB（Nitrospira 和Nitrobacter）要低1～2個數量級[70-71，97-98]，因此推測當comammox Nitrospirainopinata 進行亞硝酸鹽氧化過程時，其豐度至少為NOB的8.6倍才能與NOB競爭并在亞硝酸鹽氧化過程中發(fā)揮主要作用[98]?；赾omammox Nitrospira 在氮循環(huán)過程中功能多樣性，究竟是哪些因素保持comammox Nitrospira 的氨氧化速率和亞硝酸鹽氧化速率之間的平衡尚不清楚。今后的研究可以更具體地探究在何種條件下comammox Nitrospira 是作為氨氧化微生物進行活動，又是在何種條件下comammoxNitrospira 與NOB協(xié)同完成亞硝酸鹽氧化過程。

6 結論與展望

本文旨在強調亞硝酸鹽氧化細菌的代謝多樣性及NOB 對不同環(huán)境的偏好性。傳統(tǒng)意義上廣泛認為NOB的代謝功能單一，本文總結了NOB對一些替代能源的代謝能力，而對NOB潛在的新代謝能力預測和探究還需要進行進一步的探索。亞硝酸鹽氧化細菌具有進行亞硝酸鹽氧化作用和碳固定能力，可建立氮碳循環(huán)之間的橋梁，同時也表明了碳氮循環(huán)之間以復雜的方式交織在一起，并不是兩個完全獨立的過程。

（1）目前關于NOB 代謝能力的研究大多數都出自海洋環(huán)境，因此土壤環(huán)境或許可成為今后NOB研究的新切入點，為揭示NOB的作用機制和生態(tài)功能提供更多依據。

（2）純培養(yǎng)菌株對于確定NOB 的生理生化特點以及理解NOB的各類碳氮代謝運作機制至關重要。但是亞硝酸鹽氧化細菌的分離與純培養(yǎng)難度更高（NOB純菌分離培養(yǎng)需要4～12年），目前仍缺乏可以系統(tǒng)表征NOB的純培養(yǎng)菌株，因此對研究中所描述的NOB生態(tài)生理分析仍存在阻礙。因此迫切需要探究縮短NOB的分離和培養(yǎng)方法，并結合分子生態(tài)技術揭示NOB代謝多樣性的實際依據以及NOB在碳氮循環(huán)中的真正貢獻。

（3）新型硝化微生物comammox Nitrospira 的發(fā)現(xiàn)同樣帶來了很多未解決的問題，comammox Nitrospira具有氨氧化和亞硝酸鹽氧化的雙重功能，目前尚不清楚comammox Nitrospira 能否在氨氧化和亞硝酸鹽氧化兩種模式之間切換，功能切換的條件及原因又是什么？今后的研究應該關注于探究在何種條件下comammoxNitrospira 是作為氨氧化微生物進行活動，又是在何種條件下與NOB協(xié)同完成亞硝酸鹽氧化過程。

（4）與實驗室可進行精密培養(yǎng)條件調控相比，環(huán)境中的NOB暴露于復雜變化的條件中，其中底物濃度、含氧量、溫度、pH等條件會對NOB的生長和活性產生較大影響。而在自然環(huán)境中NOB如何調節(jié)自身以應對環(huán)境變化及其生存和繁衍需要依靠哪些類型的代謝仍存在許多知識空白。關于亞硝酸鹽氧化細菌在代謝和生物化學方面的新機制理解，如關鍵酶的活性及調節(jié)、亞硝酸鹽氧化細菌的結構和功能以及新的代謝途徑的發(fā)現(xiàn)，對于揭示和預測亞硝酸鹽氧化細菌在環(huán)境中的響應，以及環(huán)境因子如何共同影響環(huán)境中的硝化速率等都有很大的幫助。

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