摘 要： 旨在探討類固醇5α還原酶 2（steroid 5 alpha reductase" SRD5A2）對(duì)新西蘭母兔卵巢顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）的增殖、凋亡以及合成類固醇激素基因表達(dá)的影響。本研究選取健康的4～6月齡性成熟的雌性新西蘭白兔，分離兔卵巢GCs，利用FSHR進(jìn)行鑒定，進(jìn)行SRD5A2基因的過(guò)表達(dá)和干擾，利用CCK-8、流式細(xì)胞技術(shù)和qRT-PCR方法檢測(cè)GCs增殖、凋亡和類固醇激素合成相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兔 SRD5A2基因CDS全長(zhǎng)為765 bp，編碼252個(gè)氨基酸。在GCs中過(guò)表達(dá)/敲低SRD5A2后，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HIF1A的表達(dá)水平極顯著降低/升高，INHBB、HSD17B1、GDF9、BMP15的表達(dá)水平極顯著升高/降低（P＜0.01）。進(jìn)一步，過(guò)表達(dá)/敲低SRD5A2后顯著促進(jìn)/抑制GCs增殖，并抑制/促進(jìn)凋亡（P＜0.05）。結(jié)果表明，SRD5A2基因影響了合成類固醇激素基因的表達(dá)和顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，并參與新西蘭兔卵泡發(fā)育過(guò)程。

關(guān)鍵詞： SRD5A2；顆粒細(xì)胞；卵巢；增殖；凋亡

中圖分類號(hào)：S829.1"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）01-0259-10

Effect of SRD5A2 on the Expression of Genes Related to Proliferation， Apoptosis

and Steroid Hormone Synthesis in Rabbit Granulosa Cells

WANG" Lei BAI" Shaocheng WANG" Sen BAO" Zhiyuan CAI" Jiawei LIU" Yan2，"" ZHAO Bohao WU" Xinsheng CHEN" Yang^1*

（1.College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009，" China;

2.Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 31002" China）

Abstract： "The purpose of this study was to investigate the effects of steroid 5 alpha reductase 2 （SRD5A2） on proliferation， apoptosis of granulosa cells， and the expression of genes related to steroid hormone synthesis in granulosa cells （GCs） of New Zealand White female rabbits. Healthy sexually mature female New Zealand White rabbits aged 4 to 6 months were selected. GCs were isolated from the rabbit ovaries and identified using follicle-stimulating hormone receptor （FSHR）. Overexpression and knockdown of the SRD5A2 gene were performed. The proliferation， apoptosis of GCs， and the expression of genes related to steroid hormone synthesis were detected using CCK-8， flow cytometry， and quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） methods. The full-length coding sequence （CDS） of the rabbit SRD5A2 gene was 765 bp， encoding 252 amino acids. After overexpressing/knocking down SRD5A2 in GCs， qRT-PCR analysis revealed that the expression level of HIF1A was extremely significantly decreased/increased， while the expression levels of INHBB， HSD17B GDF9， and BMP15 were extremely significantly increased/decreased （Plt;0.01）. Furthermore， overexpressing/knocking down SRD5A2 significantly promoted/inhibited GCs proliferation and inhibited/promoted apoptosis （Plt;0.05）. These findings indicate that the SRD5A2 gene affects the expression of genes related to steroid hormone synthesis， as well as the proliferation and apoptosis of GCs， and is involved in the follicular development process in New Zealand White rabbits.

Key words： SRD5A2; granulosa cells; ovary; proliferation; apoptosis

*Corresponding author：CHEN Yang， E-mail： yangc@yzu.edu.cn

雌性的生育潛力主要由卵巢卵泡的發(fā)育和生長(zhǎng)決定。相較于生殖潛力較低的動(dòng)物，生殖潛力較高的動(dòng)物卵巢中通常展現(xiàn)出更成熟的卵泡和更高的排卵率^［1］。顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）被認(rèn)為是女性生殖系統(tǒng)中的關(guān)鍵細(xì)胞，參與卵泡的正常生長(zhǎng)以及雌激素的產(chǎn)生，是影響母畜生育能力的重要因素之一^［2-3］。GCs促進(jìn)卵泡生成并維持卵巢內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定性^［4-5］，其功能活動(dòng)異常可能會(huì)對(duì)繁殖效率產(chǎn)生重大影響^［6］。研究發(fā)現(xiàn)山羊卵巢GCs發(fā)生增殖或凋亡現(xiàn)象會(huì)顯著影響卵泡的發(fā)育過(guò)程^［7］。SMAD7基因可抑制山羊卵巢GCs的增殖，促進(jìn)其凋亡，從而影響卵泡發(fā)育^［8］。

類固醇5α還原酶（steroid 5 alpha reductase，SRD5A）位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，主要作用是將睪酮轉(zhuǎn)化為具有更強(qiáng)生物活性的二氫睪酮^［9］。SRD5A存在兩種同工酶，即SRD5A1和SRD5A2^［10-11］。類固醇5α 還原酶2（steroid 5 alpha reductase" SRD5A2）基因表達(dá)相對(duì)具有組織或細(xì)胞特異性，與生殖系統(tǒng)和前列腺組織的發(fā)育有關(guān)^［12］。Cheng等^［13］研究了中國(guó)14例5α還原酶缺乏癥患者，大多數(shù)患者表現(xiàn)為生殖器官發(fā)育不良。研究發(fā)現(xiàn)，SRD5A缺乏后男性表現(xiàn)為性別畸形癥狀，女性則表現(xiàn)出生育能力減弱^［14］，或者生殖器性別不清^［15］。通過(guò)分析不同生育階段黑山羊和藏山羊的卵巢組織表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)SRD5A2可能與黑山羊的高繁殖力有關(guān)^［16］。但SRD5A2基因?qū)ν寐殉睪Cs增殖和凋亡的調(diào)控功能尚不清楚。本試驗(yàn)旨在探究SRD5A2對(duì)新西蘭母兔GCs增殖、凋亡及合成類固醇激素相關(guān)基因的影響，分析該基因在母兔卵巢中的潛在影響和調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞分離與鑒定

試驗(yàn)動(dòng)物選擇健康的4～6月齡性成熟的雌性新西蘭白兔。采集卵巢組織，收集含有GCs的卵泡穿刺液，低速離心后，倒掉上清液。向離心管中加入DMEM/F12培養(yǎng)基（15%胎牛血清；1%雙抗），轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5% CO 2條件下培養(yǎng)。

利用FSHR免疫化學(xué)法鑒定GCs細(xì)胞。將分離細(xì)胞接種到6孔板上培養(yǎng)，室溫條件下，4%多聚甲醛固定30 min，然后用TritionX-100處理，室溫條件下再用1% BSA封閉1 h。加入1∶250稀釋后的Anti-FSHR，4 ℃孵育過(guò)夜。加入1∶2 000稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h，DAPI對(duì)細(xì)胞核染色，并在熒光顯微鏡下觀察。

1.2 SRD5A2過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建與siRNA合成

為構(gòu)建SRD5A2的過(guò)表達(dá)載體，對(duì)擴(kuò)增的SRD5A2基因片段和pcDNA3.1（+）質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切（EcoRⅠ和XbaⅠ），將回收的SRD5A2基因片段與線性化的pcDNA3.1（+）載體片段按一定比例混合，利用Exane ^"Ⅱ進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中，進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，并提取質(zhì)粒備用。同時(shí)，設(shè)計(jì)兔SRD5A2 siRNA序列3條，由蘇州吉瑪基因（上海）合成（表1）。

1.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

進(jìn)一步利用網(wǎng)站和相關(guān)軟件對(duì)SRD5A2蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，包括蛋白質(zhì)理化特性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位情況、磷酸化位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)等，具體信息見(jiàn)表2。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

GCs生長(zhǎng)密度達(dá)到70%時(shí)，接種到24孔板中。按照說(shuō)明書(shū)配制轉(zhuǎn)染試劑A和轉(zhuǎn)染試劑B。轉(zhuǎn)染試劑A為Opti-MEM加pcDNA3.1-SRD5A2質(zhì)?；騭iRNA，轉(zhuǎn)染試劑B為 Opti-MEM加lip 2000。配制好后靜置5 min，隨后將A和B試劑混合并吹打混勻，靜置20 min。加入到細(xì)胞中，進(jìn)行CCK-8、流式細(xì)胞和qRT-PCR等相關(guān)試驗(yàn)。

1.5 總RNA的提取

GCs用預(yù)冷的PBS洗兩遍，加入RZ，常溫靜置5 min。加入200 μL氯仿，震蕩后靜置5 min。4 ℃、12 000 r·min^-1離心10 min，吸取最上面的水相。加入0.5倍體積無(wú)水乙醇混勻，離心30 s。加入500 μL去蛋白液RD后離心30 s，再加入500 μL漂洗液PW離心30 s，漂洗。12 000 r·min^-1 空離2 min，通風(fēng)晾干。溶解后，測(cè)定RNA濃度及純度，置 -80 ℃保存。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

根據(jù)NCBI上SRD5A2和HIF1A、 INHBB、HSD17B1、GDF9和 BMP15等相關(guān)基因的信息，設(shè)計(jì)定量引物（表3），GAPDH為內(nèi)參基因。采用2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒20 μL反應(yīng)體系，具體參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.7 細(xì)胞增殖

采用CCK-8法檢測(cè)GCs細(xì)胞增殖情況。將GCs細(xì)胞懸液均勻地分配到96孔板中，每孔分配100 μL。隨后，在0、24、48、72 h向每孔中加入10 μL的CCK-8試劑。放回培養(yǎng)箱中孵育2.5 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度（OD值）。

1.8 細(xì)胞凋亡

使用Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒檢測(cè)GCs的細(xì)胞凋亡水平。用TrypLE消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞。加入適量的結(jié)合緩沖液，吹打重懸細(xì)胞。加入Annexin V-FITC和PI染色液，輕輕混勻。室溫下避光孵育10 min，加 Binding Buffer，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。用FlowJo軟件統(tǒng)計(jì)Q2和Q4區(qū)域細(xì)胞數(shù)量來(lái)計(jì)算凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

qRT-PCR的數(shù)據(jù)利用2^-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。數(shù)據(jù)利用IBM SPSS Statistics 25中的單因素ANOVA方差分析和T檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，*P＜0.05為差異顯著，**P＜0.01為差異極顯著。用GraphPad prism 9制圖。

2 結(jié) 果

2.1 SRD5A2基因克隆和過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

經(jīng)凝膠電泳和測(cè)序發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增片段大小為765 bp，與目的片段大小一致，序列同源性100%（圖1A）。隨后構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切鑒定得到兩個(gè)條帶（約為5 000 bp和750 bp）（圖1B）。測(cè)序驗(yàn)證為目的條帶，表明pcDNA3.1-SRD5A2載體成功構(gòu)建。

2.2 生物學(xué)信息分析

基因CDS全長(zhǎng)765 bp，SRD5A2蛋白由252個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子式為C 1361H 2028N 334O 328S 9，蛋白分子量為28605.65，其中亮氨酸占比最高（13.8%），且疏水氨基酸多于親水氨基酸，表明其具有疏水性（圖2A）。理化特性上，SRD5A2蛋白的等電點(diǎn)為9.53，帶正電荷的氨基酸有22個(gè)，帶負(fù)電荷的有11個(gè)，脂肪族氨基酸指數(shù)高達(dá)98.78，穩(wěn)定性較好（不穩(wěn)定性指數(shù)39.54），親水性略低（總平均親水性0.437）。其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲和延伸鏈構(gòu)成（圖2B），三級(jí)結(jié)構(gòu)呈彎曲螺旋狀（圖2D）。磷酸化預(yù)測(cè)顯示，該蛋白有21個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)（圖2C）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，SRD5A2蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖2E）。通過(guò)CDD工具分析，發(fā)現(xiàn)它含有一個(gè)PMET家族的結(jié)構(gòu)域（圖2F）。將兔SRD5A2蛋白序列與牛、馬、豬等11個(gè)物種進(jìn)行同源性對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兔單獨(dú)為一支，與牛、豬、驢、馬、彌猴、人、黑猩猩較為接近，與雞最遠(yuǎn)（圖2G）。

2.3 兔卵巢顆粒細(xì)胞的分離與鑒定

采集兔卵巢組織，分離出GCs并培養(yǎng)，原代細(xì)胞呈梭形，傳代后細(xì)胞為多邊形。免疫熒光技術(shù)鑒定細(xì)胞膜上FSHR表達(dá)，證實(shí)所分離細(xì)胞為兔GCs（圖3）。

2.4 SRD5A2基因?qū)︻惞檀技に睾铣上嚓P(guān)基因的調(diào)控作用

為了進(jìn)一步分析SRD5A2的功能，在GCs中進(jìn)行了SRD5A2的過(guò)表達(dá)和敲低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-SRD5A2過(guò)表達(dá)載體和3對(duì)SRD5A2 siRNA均能極顯著調(diào)控SRD5A2在GCs中的表達(dá)（P＜0.0 圖4A，4C）。其中siRNA-508的敲低效果最好，故選此用于后續(xù)試驗(yàn)。在GCs中過(guò)表達(dá)和干擾SRD5A2后，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SRD5A2基因能夠極顯著下調(diào)HIF1A和上調(diào)INHBB、HSD17B1、GDF9、BMP15的表達(dá)（P＜0.0 圖4B）；而干擾SRD5A2基因極顯著上調(diào)HIF1A和下調(diào)INHBB、HSD17B1、GDF9、BMP15的表達(dá)（P＜0.0 圖4D）。

2.5 SRD5A2基因影響新西蘭兔GCs的增殖與凋亡

分析SRD5A2對(duì)GCs增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示，SRD5A2過(guò)表達(dá)后，顯著或極顯著增加了GCs在24～72 h的增殖水平（P＜0.05；P＜0.01），并極顯著抑制了GCs的凋亡水平（P＜0.0 圖5A）；而SRD5A2敲低后，顯著或極顯著降低了GCs在24～72 h的增殖水平（P＜0.05；P＜0.01），并極顯著提高GCs的細(xì)胞凋亡率（P＜0.0 圖5B）。說(shuō)明SRD5A2可以促進(jìn)卵巢GCs的增殖，抑制GCs凋亡。

3 討 論

類固醇激素是一類四環(huán)脂肪烴化合物，又稱甾體激素，是動(dòng)物體內(nèi)最主要的一類性腺激素，負(fù)責(zé)參與動(dòng)物的生殖調(diào)控。SRD5A2是一種位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的微粒蛋白，能催化睪酮轉(zhuǎn)化為二氫睪酮（DHT），在性別分化以及雄激素的生成中發(fā)揮重要作用。在雌性動(dòng)物中，DHT抑制顆粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)小腔卵泡的發(fā)育^［21-22］。當(dāng)該酶發(fā)生缺陷時(shí)會(huì)影響機(jī)體的生殖能力^［23］。本研究發(fā)現(xiàn)SRD5A2蛋白特性不穩(wěn)定、疏水且保守。

GCs在卵泡生長(zhǎng)、黃體形成中至關(guān)重要，其增殖與分化是檢查卵巢功能的重要指標(biāo)^［24］。在GCs中，SRD5A2的過(guò)表達(dá)與干擾可調(diào)控HIF1A、INHBB、HSD17B1、GDF9及BMP15等基因表達(dá)，這些基因在卵泡成熟^［25］、激素平衡^［26］、細(xì)胞凋亡^［27］及胚胎質(zhì)量^［28］等過(guò)程中發(fā)揮作用。HIF1A參與卵泡形成，通過(guò)調(diào)節(jié)卵泡血管發(fā)育來(lái)影響卵泡發(fā)育^［29］。INHBB由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，能調(diào)節(jié)卵泡刺激素（FSH）水平，進(jìn)而影響受精機(jī)會(huì)，同時(shí)在輸卵管和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要^［30］。HSD17B1基因敲除小鼠繁殖力下降，黃體生成受阻，孕酮濃度降低^［31］。GDF9和BMP15作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族成員，在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用^［32］。GDF9由卵母細(xì)胞分泌，調(diào)控卵巢卵泡生長(zhǎng)發(fā)育^［33-34］。BMP15則是顆粒細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子，促進(jìn)GCs增殖和生殖干細(xì)胞分化，與繁殖性狀緊密相關(guān)^［35-36］。研究發(fā)現(xiàn)，SRD5A2在GCs中的表達(dá)變化直接影響上述基因的表達(dá)模式，影響母兔卵泡發(fā)育。

在卵泡發(fā)育過(guò)程中，GCs的增殖促進(jìn)卵泡成熟，而GCs的凋亡會(huì)引發(fā)卵泡閉鎖^［37］。在形態(tài)學(xué)上，在閉鎖的早期階段，發(fā)生細(xì)胞凋亡的GCs主要位于顆粒層的內(nèi)表面，而不是精母細(xì)胞和卵母細(xì)胞的內(nèi)膜層和外膜層^［38］，表明GCs的凋亡在卵泡閉鎖中起作用^［39］。因此，GCs細(xì)胞是否凋亡決定了是否卵泡閉鎖，從而決定了母畜的生育能力是否降低。為了探究SRD5A2基因在新西蘭母兔卵巢GCs增殖與凋亡過(guò)程中的作用，本研究采用CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了GCs的增殖能力和凋亡比例。結(jié)果表明，當(dāng)SRD5A2基因過(guò)表達(dá)時(shí)，GCs的增殖顯著增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡則受到明顯抑制；而干擾該基因的表達(dá)，GCs的增殖受到抑制，凋亡則顯著提升。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SRD5A2顯著促進(jìn)了羊卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，這與本研究結(jié)果一致^［40］。研究進(jìn)一步揭示了該基因通過(guò)調(diào)控與類固醇激素合成相關(guān)的基因表達(dá)，進(jìn)而影響新西蘭母兔卵巢GCs功能，最終影響卵巢發(fā)育。

4 結(jié) 論

SRD5A2基因能夠促進(jìn)GCs的增殖且抑制其凋亡，并調(diào)控合成類固醇激素相關(guān)基因的表達(dá)，從而參與新西蘭母兔卵巢卵泡發(fā)育過(guò)程。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ ZHANG J B，XU Y X，LIU H L，et al.MicroRNAs in ovarian follicular atresia and granulosa cell apoptosis［J］.Reprod Biol Endocrinol，2019，17（1）：9.

［2］ LIU T，HUANG Y F，LIN H.Estrogen disorders：Interpreting the abnormal regulation of aromatase in granulosa cells （Review）［J］.Int J Mol Med，202 47（5）：73.

［3］ 張?jiān)聵?豬卵巢卵泡閉鎖過(guò)程中顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及Smad4表達(dá)定位研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

ZHANG Y Q.Morphological characteristics of granulosa cells during follicle atresia and the localization and expression of Smad4 in pig ovaries［D］.Nanjing：Nanjing Agricultural University，2018.（in Chinese）

［4］ ZHOU R T，LIU D.The function of exosomes in ovarian granulosa cells［J］.Cell Tissue Res，2023，394（2）：257-267.

［5］ 徐玲霞.姜黃素通過(guò)類銅死亡機(jī)制影響牛顆粒細(xì)胞類固醇激素的合成［D］.長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2024.

XU L X.Curcumin affects the synthesis of steroid hormones in bovine granulosa cells through a cuproptosis-like mechanism［D］.Changchun：Jilin University，2024.（in Chinese）

［6］ HUSSEIN M R.Apoptosis in the ovary：molecular mechanisms［J］.Hum Reprod Update，2005，11（2）：162-178.

［7］ 黃欣愛(ài)，王 潔，陳 明，等.湖羊PGR基因?qū)β雅蓊w粒細(xì)胞體外增殖與凋亡的影響［J］.畜牧與獸醫(yī)，202 53（4）：17-23.

HUANG X A，WANG J，CHEN M，et al.Effects of PGR on proliferation and apoptosis in vitro of Hu sheep graunlosa cells［J］.Animal Husbandry and Veterinary Medicine，202 53（4）：17-23.（in Chinese）

［8］ 李碧筠，黃思藝，王鈺錕，等.SMAD7對(duì)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖、凋亡的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2022，53（8）：2548-2557.

LI B Y，HUANG S Y，WANG Y K，et al.Effects of SMAD7 on proliferation and apoptosis of goat follicular granulosa cells［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2022，53（8）：2548-2557.（in Chinese）

［9］ AQUILA S，MONTANARO D，GUIDO C，et al.Human sperm molecular anatomy：the enzyme 5α-reductase （SRD5A） is present in the sperm and may be involved in the varicocele-related infertility［J］.Histochem Cell Biol，2015，144（1）：67-76.

［10］ ANDERSSON S，BISHOP R W，RUSSELL D W.Expression cloning and regulation of steroid 5α-reductase，an enzyme essential for male sexual differentiation［J］.J Biol Chem，1989，264（27）：16249-16255.

［11］ KATLEBA K，LEGACKI E，BERGER T.Expression of CSF AR，and SRD5A2 during postnatal development of the boar reproductive tract［J］.Animals，2022，12（17）：2167.

［12］ MENDONCA B B，BATISTA R L，DOMENICE S，et al.Reprint of “Steroid 5α-reductase 2 deficiency”［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2017，165：95-100.

［13］ CHENG T，WANG H，HAN B，et al.Identification of three novel SRD5A2 mutations in Chinese patients with 5α-reductase 2 deficiency［J］.Asian J Androl，2019，21（6）：577-581.

［14］ 侯樂(lè)樂(lè)，梁立陽(yáng)，歐 輝，等.5α還原酶2型缺乏癥臨床特征及基因突變8例分析［J］.中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2016，31（5）：373-375.

HOU L L，LIANG L Y，OU H，et al.Clinical features of 5α-reductase type 2 deficiency and the gene mutation：An analysis of 8 cases［J］.Chinese Journal of Practical Pediatrics，2016，31（5）：373-375.（in Chinese）

［15］ SEO J，SHIN S，KIM S W，et al.The genotype-phenotype correlation in human 5α-reductase type 2 deficiency：classified and analyzed from a SRD5A2 structural perspective［J］.Int J Mol Sci，2023，24（4）：3297.

［16］ ZI X D，LU J Y，ZHOU H，et al.Comparative analysis of ovarian transcriptomes between prolific and non-prolific goat breeds via high-throughput sequencing［J］.Reprod Domest Anim，2018，53（2）：344-351.

［17］ DUVAUD S，GABELLA C，LISACEK F，et al.Expasy，the Swiss Bioinformatics Resource Portal，as designed by its users［J］.Nucleic Acids Res，202 49（W1）：W216-W227.

［18］ DELAGE G.ALIGNSEC：viewing protein secondary structure predictions within large multiple sequence alignments［J］.Bioinformatics，2017，33（24）：3991-3992.

［19］ WATERHOUSE A，BERTONI M，BIENERT S，et al.SWISS-MODEL：homology modelling of protein structures and complexes［J］.Nucleic Acids Res，2018，46（W1）：W296-W303.

［20］ MARCHLER-BAUER A，DERBYSHIRE M K，GONZALES N R，et al.CDD：NCBI’s conserved domain database［J］.Nucleic Acids Res，2015，43（D1）：D222-D226.

［21］ 段宏偉.雄激素受體介導(dǎo)的雙氫睪酮調(diào)控小尾寒羊卵泡發(fā)育的機(jī)制［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2021.

DUAN H W.The mechanism of androgen receptor-mediated dihydrotestosterone regulation of small-tailed Han sheep follicular development［D］.Lanzhou：Gansu Agricultural University，2021.（in Chinese）

［22］ 劉海江，趙玉芬，齊 盟，等.雙氫睪酮對(duì)綿羊小腔卵泡顆粒細(xì)胞的抗凋亡作用［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2024（19）：1-7.

LIU H J，ZHAO Y F，QI M，et al.Anti-apoptotic effects of dihydrotestosterone on small antral follicle granulosa cells of sheep［J］.Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2024（19）：1-7.（in Chinese）

［23］ PENNING T M.Molecular endocrinology of hydroxysteroid dehydrogenases［J］.Endocr Rev，1997，18（3）：281-305.

［24］ LAN Y Y，ZHANG S P，GONG F，et al.The mitochondrial DNA copy number of cumulus granulosa cells may be related to the maturity of oocyte cytoplasm［J］.Hum Reprod，2020，35（5）：1120-1129.

［25］ BERISHA B，SCHAMS D，SINOWATZ F，et al.Hypoxia-inducible factor-1alpha and nitric oxide synthases in bovine follicles close to ovulation and early luteal angiogenesis［J］.Reprod Domest Anim，2020，55（11）：1573-1584.

［26］ M’BAYE M，HUA G H，KHAN H A，et al.RNAi-mediated knockdown of INHBB increases apoptosis and inhibits steroidogenesis in mouse granulosa cells［J］.J Reprod Dev，2015，61（5）：391-397.

［27］ HAKKARAINEN J，JOKELA H，PAKARINEN P，et al.Hydroxysteroid （17β）-dehydrogenase 1-deficient female mice present with normal puberty onset but are severely subfertile due to a defect in luteinization and progesterone production［J］.FASEB J，2015，29（9）：3806-3816.

［28］ VARNOSFADERANI S R，OSTADHOSSEINI S，HAJIAN M，et al.Importance of the GDF9 signaling pathway on cumulus cell expansion and oocyte competency in sheep［J］.Theriogenology，2013，80（5）：470-478.

［29］ 王堅(jiān)青，吉中磊，張加苗.miR-589-3p/HIF1A軸調(diào)控卵巢癌化療藥物的耐藥機(jī)制［J］.生物技術(shù)，2022，32（3）：338-342，354.

WANG J Q，JI Z L，ZHANG J M.miR-589-3p/HIF1A axis regulates the mechanism of chemotherapeutic drug resistance in ovarian cancer［J］.Biotechnology，2022，32（3）：338-342，354.（in Chinese）

［30］ 李芝豐，儲(chǔ)明星，孫 偉.綿羊INHBB、SMAD4和FGF18基因的雙熒光素酶載體構(gòu)建及其與miR-370-3p的靶向驗(yàn)證［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，202 48（9）：3109-3117.

LI Z F，CHU M X，SUN W.Construction of ovine INHBB，smad4 and fgf18 genes dual-luciferase reporter and validation of their targeting relationship with miR-370-3p［J］.China Animal Husbandry and Veterinary Medicine，202 48（9）：3109-3117.（in Chinese）

［31］ 陸杏蓉，段安琴，馬小婭，等.水牛HSD17B1基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建與分析［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，202 48（10）：3512-3521.

LU X R，DUAN A Q，MA X Y，et al.Construction and analysis of the luciferase reporter gene vector of HSD17B1 gene promoter in buffalo［J］.China Animal Husbandry and Veterinary Medicine，202 48（10）：3512-3521.（in Chinese）

［32］ 楊 貞，鄧林浩，江少如，等.益氣血法調(diào)節(jié)GDF9、c-IAP1/2、JNK1/2、TNFR1/2表達(dá)對(duì)超排卵大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2024，33（14）：1905-1910，2026.

YANG Z，DENG L H，JIANG S R，et al.E Effects of decoction for tonifying and replenishing Qi and blood on ovarian granulosa cells apoptosis of controlled ovarian hyperstimulation rats via regulating the expressions of GDF9，c-IAP1/2，JNK1/2，TNFR1/2［J］.Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，2024，33（14）：1905-1910，2026.（in Chinese）

［33］ 薛建芳.血清及卵泡中AMH、GDF9水平對(duì)不孕癥患者生育能力的預(yù)測(cè)價(jià)值［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2024，62（15）：54-58.

XUE J F.Predictive value of AMH and GDF9 levels in serum and follicles on fertility of infertile patients［J］.China Modern Doctor，2024，62（15）：54-58.（in Chinese）

［34］ 李 鑫，劉柯柯，劉小東，等.陜北白絨山羊GDF9基因編碼區(qū)分子序列特征分析［J］.當(dāng)代畜牧，2024（2）：51-54.

LI X，LIU K K，LIU X D，et al.Analysis of molecular sequence characteristics of the coding region of the GDF9 gene in Shaanbei white cashmere goat［J］.Contemporary Animal Husbandry，2024（2）：51-54.（in Chinese）

［35］ TANAKA K，HAYASHI Y，TAKEHARA A，et al.Abnormal early folliculogenesis due to impeded pyruvate metabolism in mouse oocytes［J］.Biol Reprod，202 105（1）：64-75.

［36］ 劉夢(mèng)蘭，邵旭文，單雪松，等.BMP亞家族成員中影響綿羊繁殖性能的基因研究進(jìn)展［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2024，45（7）：1-8.

LIU M L，SHAO X W，SHAN X S，et al.Progress in genetic research on the effect of bmp subfamily members on sheep reproductive performance［J］.Acta Ecologae Animalis Domastici，2024，45（7）：1-8.（in Chinese）

［37］ HE Y M，DENG H H，JIANG Z L，et al.Effects of melatonin on follicular atresia and granulosa cell apoptosis in the porcine［J］.Mol Reprod Dev，2016，83（8）：692-700.

［38］ INOUE N，MATSUDA F，GOTO Y，et al.Role of cell-death ligand-receptor system of granulosa cells in selective follicular atresia in porcine ovary［J］.J Reprod Dev，201 57（2）：169-175.

［39］ TILLY J L，KOWALSKI K I，JOHNSON A L，et al.Involvement of apoptosis in ovarian follicular atresia and postovulatory regression［J］.Endocrinology，199 129（5）：2799-2801.

［40］ 洪 磊.黔北麻羊SRD5A2和HSD3B1基因的表達(dá)及其對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的影響研究［D］.貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2021.

HONG L.Study on SRD5A2 and hsd3b1 gene expression and their effects on ovarian granulosa cells in Qianbei Ma sheep［D］.Guiyang：Guizhou University，2021.（in Chinese）

（編輯 郭云雁）