摘 要 為明確甘肅民勤青土湖肉蓯蓉莖腐病病原菌種類，采用組織分離法，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與ITS分子方法對其進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果表明，從青土湖肉蓯蓉莖腐病中共分離出3種不同的病原菌，室內(nèi)回接和田間發(fā)病癥狀基本一致，均表現(xiàn)出莖腐病典型癥狀，分別命名為RCRJF-1、RCRJF-2、RCRJF-3。在PSA培養(yǎng)基上觀察3個菌株的形態(tài)特征得知，RCRJF-1菌落圓形，淡紫色，白色氣生菌絲，背面產(chǎn)生淡紫色色素，大型分生孢子細(xì)長，鐮刀型，2～5隔，小型分生孢子長橢圓形，多無隔；RCRJF-2具有白色氣生菌絲，菌落淡粉色，菌落背面中心淡紫色，但在PSA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，在PDA培養(yǎng)基上大型分生孢子2～3分隔，小型分生孢子0～1分隔，卵圓形或腎形，厚垣孢子球形，間生或串生；RCRJF-3具有棉絮狀氣生菌絲，表面玫瑰紅色、邊緣玫瑰紅色、中心部分黃棕色，菌落背面紫紅色，在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，在PSA培養(yǎng)基上大型分生孢子鐮刀型，多數(shù)3～5隔，小型分生孢子較少，成球棒狀。進(jìn)一步ITS分子鑒定得知，RCRJF-1、RCRJF-2、RCRJF-3分別與層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）（登錄號MT560212）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）（登錄號MT530243）、銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）（登錄號MH341217）具有較高的相似性，均為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定引起甘肅民勤青土湖肉蓯蓉莖腐病的致病菌為層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum），分離頻率分別為52.38%、31.11%和16.51%，其中層出鐮刀菌（F. proliferatum）為優(yōu)勢致病菌。

關(guān)鍵詞 肉蓯蓉；莖腐??；病原菌；分離；鑒定

肉蓯蓉（Cistanche deserticola Y. C. Ma）為寄生于荒漠、沙漠鹽生植物根部的寄生植物，寄主非常廣泛，包括梭梭、紅柳、鹽穗木、四翅濱藜、堿蓬等^［1］，它具有益精血、補腎壯陽、潤腸通便、抗衰老、促進(jìn)代謝、調(diào)整內(nèi)分泌和強筋骨等功效^［2］，素有“沙漠人參”之美譽，是中國傳統(tǒng)的名貴中藥材^［1］，2020年被列為藥食兩用物質(zhì)，這為肉蓯蓉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了新的機遇，也對人工種植肉蓯蓉的品質(zhì)有了更高要求，加之野生資源有限、市場需求量大，有利促進(jìn)了肉蓯蓉人工種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

武威地處河西走廊東端，在防沙治沙造林過程中，以梭梭為主要的治沙造林樹種，這為改善當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境、生態(tài)修復(fù)的同時也為發(fā)展林下經(jīng)濟—梭梭接種肉蓯蓉提供了豐富的寄主資源，同時為沙區(qū)的資源利用創(chuàng)造了條件，實現(xiàn)自然資源與規(guī)模經(jīng)濟的優(yōu)勢互補，發(fā)展肉蓯蓉，可以把大量的閑置多年的荒漠土地利用起來，當(dāng)?shù)匾验_展了梭梭接種肉蓯蓉的示范種植，面積達(dá)到0.67余萬hm²，其勞動密集性的特征可有效帶動沙區(qū)群眾增加收入^［3］。然而，隨著種植面積的不斷增加，在肉蓯蓉種植基地肉蓯蓉莖腐?。蹖W(xué)者將主要造成肉蓯蓉地下莖（其藥用部位）腐爛的病稱為肉蓯蓉莖腐病^［4］發(fā)病嚴(yán)重，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)厝馍惾禺a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。民勤青土湖作為武威市肉蓯蓉主產(chǎn)區(qū)之一，種植面積大，產(chǎn)量高，但莖腐病發(fā)病嚴(yán)重，一般地塊發(fā)病率為8%～12%，重者高達(dá)40%，嚴(yán)重制約了當(dāng)?shù)厝馍惾禺a(chǎn)業(yè)發(fā)展。有學(xué)者在寧夏地區(qū)分離到的肉蓯蓉莖腐病的主要病原菌為接骨木鐮刀菌 （Fusarium sambucinum）^［4］，但民勤青土湖肉蓯蓉莖腐病癥狀與寧夏地區(qū)肉蓯蓉莖腐病癥狀又有不同之處，如在民勤青土湖分離到的病原菌引起的癥狀除了具有寧夏分離到病原菌引起的癥狀外，還在發(fā)病時出現(xiàn)黑色斑點，嚴(yán)重時整體發(fā)黑，但堅硬不腐爛這一癥狀。

對于該地區(qū)肉蓯蓉莖腐病的病原菌還未見相關(guān)研究，且對該病害的防治以生物防治為主，研究其確切的病原菌，可為今后生物防治中拮抗菌的篩選提供理論依據(jù)。故本研究通過采集青土湖肉蓯蓉基地的莖腐病病斑，對其進(jìn)行分離、致病性檢測，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)特征對其進(jìn)行鑒定，確定該地區(qū)肉蓯蓉莖腐病病原菌種類，以期為今后肉蓯蓉莖腐病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣

2020年4月至2022年4月從民勤縣青土湖肉蓯蓉種植基地不同地點采集60株發(fā)病植株（采集剛發(fā)病能分辨出病健交界處的植株）。

1.2 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基和PSA固體培養(yǎng)基。

1.3 病原菌分離與鑒定

將采集的60株發(fā)病植株進(jìn)行表面消毒，在病健交界處選取1 cm小塊，置于PDA上25℃恒溫培養(yǎng)，每株3個重復(fù)，共180皿，觀察培養(yǎng)，5 d后挑取菌落邊緣菌絲體在PDA固體培養(yǎng)基上保存。分離菌用單孢分離法進(jìn)行純化。同時按照菌落形態(tài)等特征將菌株分類^［5］，計算分離頻率^［6-7］。

1.4 致病性測定

將不同分類的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 7 d，挑選大小一致、健康的肉蓯蓉莖段，用清水沖洗干凈，然后用70%酒精進(jìn)行表面消毒，再用無菌水反復(fù)沖洗后，備用。根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行離體回接驗證，每個肉蓯蓉的莖段用滅菌刀片劃出3 cm×3 cm的十字交叉?zhèn)?，將培養(yǎng)7 d的病原菌制備直徑5 mm的菌塊放到傷口處，25℃條件下培養(yǎng)，觀察，設(shè)3次重復(fù)，PDA空白培養(yǎng)基做為對照，發(fā)病后再次分離。

1.5 病原菌鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將經(jīng)過PSA和PDA培養(yǎng)7～10 d的病原菌挑取菌絲，采用蓋玻片法^［8］觀察其形態(tài)特征，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)^［9-10］進(jìn)行鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：采用CTAB法^［11］提取病原菌DNA、通用引物ITS1和ITS4^［12］進(jìn)行PCR擴增。測序結(jié)果由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，在NCBI上進(jìn)行比對，利用 MEGA11軟件的（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間罹病肉蓯蓉病害癥狀

在甘肅省民勤縣青土湖肉蓯蓉種植基地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病癥狀包括：肉質(zhì)莖生長受到阻礙等一系列癥狀與程齊來等^［4］發(fā)現(xiàn)的一致（圖1-A），或者有的初期出現(xiàn)棕黑或者黑色斑點，嚴(yán)重時整體發(fā)黑，但堅硬不腐爛（圖1-B和1-C），內(nèi)部組織變?yōu)楹稚▓D1-D），有的變?yōu)楹谏▓D1-E）。

2.2 病原菌鑒定結(jié)果

2.2.1 病原菌的類型和形態(tài)特征 在民勤縣青土湖肉蓯蓉種植基地不同地點采集60株發(fā)病植株，共分離獲得315株純培養(yǎng)分離物。根據(jù)在培養(yǎng)基上的一些形態(tài)特征和分生孢子形態(tài)，這些分離物可分為3種類型（圖2）。

第一類的分離物（分離頻率為52.38%），在PSA培養(yǎng)基上菌落圓形，菌落為淡紫色，氣生菌絲白色（圖2-A），背面產(chǎn)生淡紫色色素（圖2-B），大型分生孢子細(xì)長，鐮刀型，2～5隔，大小為（10.31～28.44） μm×（1.47～4.5） μm，小型分生孢子長橢圓形，多無隔，大小為（2.56～6.32） μm×（1.21～3.09） μm（40×倍鏡下，下同），依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將該菌株初步鑒定為層出鐮刀菌。挑選典型菌株并命名為RCRJF-1（圖2-C和2-D）。

第二類的分離物（分離頻率為31.11%），在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲白色，菌落淡粉色（圖2-E），菌落背面中心淡紫色（圖2-F），在PSA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，在PDA培養(yǎng)基上為大型分生孢子，2～3分隔，大小為（18.34～36.01） μm×（1.46～4.51） μm，小型分生孢子0～1分隔，卵圓形或腎形，大小為（4.51～9.76） μm×（1.32～3.35） μm，厚垣孢子球形，間生或串生，直徑為6.12～9.12 μm（圖2-G和2-H）。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將該菌株初步鑒定為尖孢鐮刀菌。挑選典型菌株并命名為RCRJF-2。

第三類的分離物（分離頻率為16.51%），在PSA培養(yǎng)基上氣生菌絲棉絮狀，表面玫瑰紅色、邊緣玫瑰紅色、中心部分黃棕色（圖2-I），菌落背面紫紅色（圖2-J）；在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，在PSA培養(yǎng)基上大型分生孢子鐮刀型，多數(shù)3～5隔，大小為（13.56～24.87） μm×（2.19～3.89） μm；小型分生孢子成球棒狀、較少（圖2-K和2-L）。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征將該菌株初步鑒定為銳頂鐮刀菌。挑選典型菌株并命名為RCRJF-2。

2.2.2 病原菌致病性測定 回接與再分離：對照（CK）沒有感病，層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）回接后肉蓯蓉組織發(fā)病率達(dá)到100%。各個肉蓯蓉組織上均長出白色絮狀致密菌絲，然后逐漸布滿整個組織的表面，切開后可看到內(nèi)部組織褐變并逐漸變黑（圖3）。所測層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）菌株全部能引起發(fā)病，與采集的發(fā)病植株發(fā)病特征基本一致。取發(fā)病植株進(jìn)行病原菌再分離，分離物與接種菌株的形態(tài)特征基本一致，根據(jù)柯赫氏法則^［13］，證明所接種的菌株均為致病菌。

2.2.3 病原菌的分子鑒定 用引物ITS1和ITS4分別對菌株RCRJF-1、RCRJF-2和RCRJF-3進(jìn)行PCR擴增，將序列提交到GenBank，獲得RCRJF-1登錄號OQ744649、RCRJF-2登錄號OQ744657、RCRJF-3登錄號 OQ744678。同源性序列分析結(jié)果表明，RCRJF-1與層出鐮刀菌（F.proliferatum）（登錄號MT560212）的相似性為100%、RCRJF-2與尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）（登錄號MT530243）的相似性為100%，RCRJF-3與銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）（登錄號MH341217）的相似性為100%，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖4），RCRJF-1與層出鐮刀菌（F. proliferatum）聚為一個分支，支持率99%，RCRJF-2與尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）聚為一個分支，支持率99%，RCRJF-3與銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）聚為一個分支，支持率100%，結(jié)合形態(tài)特征與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將RCRJF-1鑒定為層出鐮刀菌（F. proliferatum），RCRJF-2鑒定為尖孢鐮刀菌（F. oxysporum），RCRJF-3鑒定為銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）。

3 討 論

肉蓯蓉屬于藥食用同源物種，商品為有機產(chǎn)品，在生產(chǎn)過程中不使用任何農(nóng)藥化肥，而莖腐病的發(fā)生嚴(yán)重影響了其產(chǎn)量和質(zhì)量，為提高其生物防治成效，本研究對青土湖肉蓯蓉基地的肉蓯蓉莖腐病病原菌進(jìn)行了分離鑒定，通過治病性測定、發(fā)病率調(diào)查，結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)及分子生物學(xué)方法從該地區(qū)肉蓯蓉莖腐病病斑中分離到3種病原菌，均屬于鐮刀菌屬，分別為層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum），其中主要致病菌為層出鐮刀菌（F. proliferatum），分離頻率為 52.38%；銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）的分離頻率最低，為16.51%。根據(jù)柯赫氏法則回接后，層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）都能引起肉蓯蓉典型癥狀，故為肉蓯蓉莖腐病病原菌，且優(yōu)勢致病菌為層出鐮刀菌（F. proliferatum）。

鐮刀菌屬是農(nóng)作物最主要的致病菌之一，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的生長和產(chǎn)量^［14］。無論在糧食作物、藥用植物、經(jīng)濟作物及觀賞植物上都有鐮刀菌發(fā)生^［15］。層出鐮刀菌（F. proliferatum）可侵染多種植物，造成植物根、莖、葉的腐爛病害，引起苗枯、穗腐、根部腐爛等病害，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失^［16］，如李國良等^［17］在苜蓿根腐病中分離、鑒定出層出鐮刀菌（F. proliferatum）為致病菌，可使苜蓿植株矮小、根部中柱部分褐變或腐爛中空；Isack等^［18］研究發(fā)現(xiàn)層出鐮刀菌（F. proliferatum）也可以導(dǎo)致洋蔥發(fā)生根腐病，嚴(yán)重時造成洋蔥鱗莖腐爛，還能引起大蒜、玉米、蘆筍等作物的病害。尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）可以導(dǎo)致植物枯萎病，表現(xiàn)出根腐、莖腐等多種病害癥狀，受侵染的寄主植物可達(dá)100多種，經(jīng)常性侵染寄主植物的維管束系統(tǒng)，破壞植物的輸導(dǎo)組織，造成植物萎蔫甚至死亡，從而影響產(chǎn)量和品質(zhì)^［14］，如奚安^［15］研究出尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）是馬鈴薯干腐病的主要致病菌之一，可導(dǎo)致馬鈴薯嚴(yán)重時發(fā)病部位表面凹凸不平，有白色或淡黃色菌絲，沿著病斑切開，病組織呈現(xiàn)褐色有空腔。銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）對生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性強，寄主范圍廣泛，如魏巍等^［19］研究發(fā)現(xiàn)銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）能引起馬鈴薯干腐病，楊曉賀等^［20］發(fā)現(xiàn)銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）也可以引起蔬菜等作物的根部病害。這與本研究分離出來的層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）均能引起肉蓯蓉莖腐病的發(fā)生結(jié)果相符，說明本研究分離到的3種鐮刀菌均屬于致病菌。

關(guān)于肉蓯蓉莖腐病病原菌，已有學(xué)者進(jìn)行過相關(guān)研究。程齊來等^［4］在寧夏肉蓯蓉種植區(qū)分離到1種肉蓯蓉莖腐病的病原菌，為接骨木鐮刀菌（F. sambucinum），而本研究雖然分離到3種肉蓯蓉莖腐病的致病菌，但未分離到接骨木鐮刀菌（F. sambucinum），與程齊來在寧夏地區(qū)分離的病原菌不同，這可能是由于采集的肉蓯蓉病株來源于不同的地域和氣候條件有關(guān)，也可能與病狀間的差異有關(guān)。如寧夏地區(qū)分離到的接骨木鐮刀菌（F. sambucinum）引起的肉蓯蓉病害主要表現(xiàn)為肉質(zhì)莖生長受阻等特征，而在民勤青土湖分離到的病原菌引起的癥狀除了具有寧夏分離到接骨木鐮刀菌（F. sambucinum）引起的的癥狀外，還在發(fā)病時出現(xiàn)黑色斑點，嚴(yán)重時整體發(fā)黑，但堅硬不腐爛這一癥狀。據(jù)文獻(xiàn)報到，中草藥根腐病的病原不僅繁多，而且不同病原引發(fā)的癥狀也都不一樣，并且隨著發(fā)病時間延長和優(yōu)勢菌的變化，癥狀表現(xiàn)也不一樣^［21］，如畢武等^［22］認(rèn)為引起西洋參根腐病的病原菌為柱孢菌屬真菌，表現(xiàn)癥狀為銹腐，而鐮刀菌屬真菌引起黑腐癥狀；引發(fā)三七根腐病的病原菌為毀滅柱孢（C.destructans）和人參柱孢（C. dydinum），癥狀為典型的黃腐等^［23］。因此本試驗分離出的層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）可以歸為肉蓯蓉莖腐病的新病原菌。

在肉蓯蓉莖腐病病原菌鑒定中，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方式，以進(jìn)一步確定其鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。形態(tài)學(xué)鑒定過程中，在3個病原菌中均觀察到了鐮刀菌的典型特征—鐮刀孢子，可以初步將其鑒定為鐮刀菌。但是在各病原菌孢子特征觀察過程中，發(fā)現(xiàn)3個病原菌的產(chǎn)孢特征有所差異，比如PDA培養(yǎng)基上只有尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）產(chǎn)孢、且厚垣孢子明顯，可初步鑒定為尖孢鐮刀菌（F. oxysporum），而層出鐮刀菌（F. proliferatum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）不易產(chǎn)孢；但是在PSA培養(yǎng)基上層出鐮刀菌（F. proliferatum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）都能產(chǎn)孢，而尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）不易產(chǎn)孢。另外，在PSA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上觀察到3種鐮刀菌菌落長得都非?？欤a(chǎn)孢量大，這就使它們在自然界中繁殖、傳播都處于優(yōu)勢，從而成為肉蓯蓉的優(yōu)勢致病菌^［19］。

本研究將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，鑒定出肉蓯蓉莖腐病病原菌為層出鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和銳頂鐮刀菌（F. acuminatum），這將為更好地防治肉蓯蓉莖腐病奠定一定的基礎(chǔ)，同時也為下一步開展對該病害的綜合控制技術(shù)研究奠定了理論基礎(chǔ)，但是有關(guān)病原菌的生理生化方面未做詳細(xì)探討，有待進(jìn)一步深化研究。

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Isolation and Identification of Pathogens Causing Stem Rot of Cistanche deserticola in Qingtu Lake，Minqin

LIU Wei¹，HE Cai¹，JIN Na¹，ZHAO Lianxin¹，JIN Min¹，

ZHANG Jun¹，LI Qiang¹，LI Dong¹ and DUAN Aili²

（1.Wuwei Academy of Forestry Science of Gansu Province，Wuwei Gansu 733000，China；

2.Wuwei Food Inspection and Testing Center，Wuwei Gansu 733000，China）

Abstract To clarify pathogen species causing stem rot in Cistanche deserticola at Qingtu Lake of Minqin，Gansu Province，the tissue isolation method，morphological characteristics and ITS molecular methods were used for pathogen isolation and identification. The results showed that three different pathogens were isolated from stem rot in C.deserticola at Qingtu Lake，the symptoms observed both in indoor and field were essentially the same，showing typical characteristics of stem rot. These pathogens were designated as RCRJF-1，RCRJF-2，and RCRJF-3，respectively. The ITS molecular identification showed that RCRJF-1，RCRJF-2 and RCRJF-3 exhibited 100% similarity to Fusarium proliferatum （accession number MT560212），F(xiàn)usarium oxysporum （accession number MT530243） and Fusarium acuminatum （accession number MH341217），respectively. Based on morphological characteristics，it was determined that the pathogens causing the stem rot in C.deserticola in Qingtu Lake，Minqin，Gansu were F. proliferatum，F(xiàn). oxysporum，and F. acuminatum. The isolation frequencies were 52.38%，31.11%，and 16.51%，respectively，with F.proliferatum identified as the dominant pathogen.

Key words Cistanche deserticola; Stem rot; Pathogen; Separation; Identification

Received 2023-05-25

Returned 2023-09-26

Foundation item Science and Technology Planof Gansu Province （Technology Innovation Guidance Plan） （No.21CX6NH279）; Science and Technology Plan of Market Supervision Administration of Gansu Province（No.SSCJG-SP-A202209）;Central Finance Forest and Grass Science and Technology Promotion Demonstration Project （No.Gan［2023］ZYTG020）;the Second Group of Longyuan Young Talents in Gansu Province （No.［2023］11）.

First author LIU Wei，female master，senior forestry engineer. Research area：desertification prevention and economic forests.E-mail：weiweipeng.3800006@163.com

Corresponding author HE Cai，female master，senior forestry engineer.Research area：desertification prevention and economic forests. E-mail：hcyldfcl@163.com

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）