摘 要 木質素合成是核桃內果皮硬化的必要條件，但其調控機制尚不清楚?？寺『颂夷举|素合成相關基因 JrMYB44和 JrMYB13的CDS全長，檢測這兩個基因在核桃不同組織器官以及內果皮不同發(fā)育時期硬化與非硬化部位的表達水平，調查這兩個蛋白的亞細胞定位。結果表明： JrMYB44和 JrMYB13分別編碼319和317個氨基酸，兩者同源性為39.5%；系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，JrMYB44與Juglans regia×Juglans major雜交核桃和山核桃同源蛋白的親緣關系較近，而JrMYB13與Juglans regia×Juglans major雜交核桃同源蛋白的親緣關系較近。亞細胞定位結果顯示，JrMYB44和JrMYB13均在細胞核內表達?；虮磉_檢測發(fā)現(xiàn)，JrMYB44基因主要在核桃內果皮的非硬化區(qū)富集表達，且在內果皮不同發(fā)育時期的表達水平與木質素含量呈負相關，推測 JrMYB44基因對木質素合成起負調控作用； JrMYB13基因主要在核桃內果皮硬化區(qū)富集表達，且表達水平隨木質素含量增加而上升，推測 JrMYB13基因對木質素合成起正調控作用。

關鍵詞 核桃；MYB；基因克??；表達分析；果皮發(fā)育；木質素

核桃（Juglans regia L.）為世界主栽的食用及藥用、木本油料樹種之一^［1］。中國核桃資源豐富且栽培歷史悠久^［2］，其中新疆得天獨厚的自然生態(tài)條件使其成為中國核桃重要產區(qū)之一^［3］。伴隨核桃種植面積的不斷擴大及消費者對綜合品質要求的提升，培育出仁率高、易機械脫皮等適于現(xiàn)代深加工的核桃品種已成為當前核桃產業(yè)發(fā)展的主要目標。然而，目前生產上存在核桃內果皮發(fā)育不完整導致露仁的現(xiàn)象^［4］，其外觀品質差、清洗過程中污染率和貯藏蟲果率高，嚴重影響核桃的品質和加工利用^［5-6］。木質素與核桃內果皮發(fā)育緊密相關。研究表明，核桃內果皮的主要成分為木質素（Lignin），其含量與內果皮的厚度、縫合線緊密度及機械強度間均顯著正相關^［7-10］。木質素的合成調控網絡途徑極其復雜，有多種酶協(xié)同參與^［11］。近年來，大量研究報道調控木質素生物合成相關酶類基因的表達影響著木質素的代謝過程^［12-14］。

目前，NAC、WRKY和MYB等類型的轉錄因子已被證實參與了木質素生物合成的調控^［15］。MYB類轉錄因子是調控植物細胞次生壁發(fā)育的二級開關^［16］，對植物次生壁的沉積也起到一定的調控作用。在各類植物中發(fā)現(xiàn)多種MYB轉錄因子可以在一定程度上促進或抑制次生壁的木質素合成，例如，王丹丹等^［17］推測紅花 CtMYB-TF1通過PKC介導的信號轉導途徑進入細胞核內調控花青素合成。陸地棉莖稈中 GhMYB4基因參與次生壁木質素的合成^［18］?；鹁嫠傻腜tMYB1和PtMYB4^［19］、擬南芥的AtMYB58和AtMYB63^［20］，以及桉樹的EgMYB2^［21］可以正向調控木質素、半纖維素和纖維素的合成，進一步影響植物次生細胞壁的形成。部分MYB轉錄因子對植物中木質素的生物合成起抑制作用，例如，毛果楊的 MYB189基因過表達時，楊樹中參與木質素、纖維素和木聚糖生物合成的大部分結構基因均顯著下調；MYB189轉錄因子可通過結合次生壁生物合成基因的啟動子抑制其表達^［22］。在煙草中過表達金魚草 AmMYB308和 AmMYB330基因，顯著降低了轉基因植物中酚酸和木質素的含量^［23］；小麥 TaMYB4^［24］以及玉米 ZmMYB46和 ZmMYB31等^［25］基因均在次生壁發(fā)育過程中調控木質素的合成。同一物種的不同MYB轉錄因子對木質素合成的影響不同。如菊花 CmMYB8過表達時，部分編碼木質素合成的基因下調，植物木質素含量下降，其木質素S/G比值降低，說明CmMYB8蛋白參與木質素合成的負調控^［26］。菊花 CmMYB15與木質素生物合成基因的啟動子通過AC元件結合后，對 CmMYB15過表達發(fā)現(xiàn)木質素的含量和木質素生物合成基因的相對表達量增加，說明 CmMYB15對木質素生物合成及木質素合成基因表達起正向調節(jié)^［27］。綜上所述，不同植物或不同MYB轉錄因子對木質素合成的調控作用不同，其調控機制有待深入 研究。

根據轉錄組分析獲得木質素相關合成的MYB差異基因^［28］，本試驗以新疆露仁核桃‘新露’為研究對象，通過克隆核桃內果皮中參與木質素代謝的MYB轉錄因子基因 JrMYB44和 JrMYB13，分析兩個基因的序列特點、蛋白質結構及在內果皮硬化過程的表達情況，對核桃內果皮硬化過程中木質素代謝機理進行初步探索，為進一步解析新疆核桃露仁機制鋪墊研究基礎，為新疆核桃產業(yè)的遺傳改良和提質增效提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為新疆露仁品種‘新露’核桃^［29］，采自新疆溫宿縣核桃木本糧油林場，在果實膨大期后期（6月20日，約花后64 d）至硬核期（7月18日，約花后92 d）采樣，采樣覆蓋整個核桃內果皮硬化期。將內果皮剝離（圖1），分為硬化區(qū)（Hardening，H）與非硬化區(qū)（Non-hardening，N）。對‘新露’核桃結果枝、花、葉、內果皮（硬化與非硬化區(qū)）、外果皮、內中（核桃內果皮與種仁間白色組織）等不同組織器官進行采樣，采樣后將樣品于 -80℃超低溫冰箱中冷凍保存。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的RNA提取試劑盒（RC411-01）提取核桃內果皮以及不同組織中總RNA。用賽默飛超微量核酸蛋白測定儀檢測核酸濃度，使用反轉錄試劑盒 PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）Kit（Takara公司）合成 cDNA。

1.3 JrMYB44和JrMYB13基因克隆

從轉錄組數據庫中獲得差異基因^［28］和NCBI數據庫中比對篩選出CDS序列，并設計引物（表1）。

以‘新露’內果皮cDNA為模板，使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司高保真酶（P520-01）與eppendorf AG梯度PCR儀擴增目的基因，PCR程序為：95℃預變性5 min；95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃退火90 s，33個循環(huán)；72℃延伸8 min；4℃保存。將目的條帶回收并連接到GFP載體，進一步篩選陽性克隆，送至武漢擎科生物科技有限公司測序。

1.4 JrMYB44和JrMYB13表達模式分析

根據已克隆的核桃內果皮MYB基因序列，利用Primer 5.0 軟件在 JrMYB44和 JrMYB13的非保守區(qū)設計實時熒光定量PCR引物（表2）。使用賽默飛Applied Biosystems QuantStudio 7 進行三步法Real-Time PCR擴增。擴增條件： 50℃ 2 min，95℃ 2 min（預變性）；95℃ 10 s（變性），60℃ 30 s（退火），60℃ 30 s（延伸），40個循環(huán)。熔解曲線生成步驟：95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s。每個反應設置3 個生物學重復，反應結束后利用2^-△△Ct方法計算基因相對表達量。

1.5 JrMYB44和JrMYB13超表達載體構建及亞細胞定位

采用杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司質粒DNA小量試劑盒對陽性菌液進行質粒提取，對 JrMYB44和 JrMYB13的連接載體通過反向PCR獲得線性化載體。用南京諾唯贊生物科技股份有限公司同源重組試劑盒（C112-02）進行重組反應。將10 μL重組產物加入至100 μL的感受態(tài)大腸桿菌中，抽打混勻，冰上靜置30 min后42℃熱激45 s，冰上冷卻2 min。加入1 mL的無抗性LB液體培養(yǎng)基，37℃恒溫搖菌床220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。在含有100 mg/L 卡那的LB固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)12 h并篩選陽性菌斑，菌液PCR驗證后測序。菌液PCR反應條件為：94℃預變性3 min;95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸 5 min;16℃保溫。將帶有載體的菌液轉入本氏煙草培養(yǎng)3 d，用尼康A1RHD25amp;N-SIM激光掃描共聚焦顯微鏡檢測定位情況。

2 結果與分析

2.1 ‘新露’核桃JrMYB44和JrMYB13的生物信息學分析

測序結果表明，JrMYB44長度為957 bp，編碼319個氨基酸（圖2-a），JrMYB13長度951 bp，編碼317個氨基酸（圖2-d）。經Expasy ProtParam預測，JrMYB44分子質量為3 4670.86 ku、理論等電點（PI）為9.04，分子式為C₁₄₉₉H₂₃₉₆N₄₄₄O₄₈₀S₁₁，原子總數為4 830，帶正電荷殘基數為35、帶負電荷殘基數為30，脂肪系數為69.12，蛋白質半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數為51.32，該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。JrMYB13分子質量為35 532.69 ku、理論等電點（PI）為5.30，分子式為C₁₅₅₃H₂₃₈₇N₄₃₇O₄₈₈S₁₇，原子總數為4 882，帶正電荷殘基數為26、帶負電荷殘基數為38，脂肪系數為67.67，蛋白質半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數為61.28，該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。

利用ExPasy預測JrMYB44、JrMYB13的親疏水性（圖2-b、圖2-e），JrMYB44在第81個氨基酸處疏水性最強；在203、204個氨基酸處親水性最強；蛋白總平均親水性（GRAVY）為-0.584，該蛋白為親水性蛋白。JrMYB13在第272個氨基酸處，正值為1.744，疏水性最強；在第32個氨基酸處，親水性最強，負值為-2.222，蛋白總平均親水性（GRAVY）為-0.576，該蛋白為親水性蛋白。利用TMHMM ServerV.2.0在線預測，結果顯示兩轉錄因子均無跨膜結構。

通過PSIPRED在線軟件預測，結果顯示JrMYB44蛋白二級結構主要由34.17%的α螺旋、0.63%延伸鏈以及65.20%無規(guī)則卷曲組成。JrMYB13蛋白二級結構主要由34.70%的α螺旋、0.95%延伸鏈以及64.35%無規(guī)則卷曲組成。利用SWISS-MODEL對JrMYB44和JrMYB13蛋白進行三維建模（圖2-c、圖2-f），結果顯示，兩種蛋白結構均以α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主要結構原件。

2.2 ‘新露’核桃JrMYB44和JrMYB13蛋白進化 分析

將JrMYB44、JrMYB13蛋白與NCBI數據庫序列進行序列同源性比對，核苷酸序列相似性顯示JrMYB44與雜交核桃（ XP_040996771.1 ）、美國山核桃（XP_042963113.1）同源性較高，相似性分別為98.43%，93.79%；JrMYB13與雜交核桃（XP_040986679.1）同源性較高，相似性為 98.11%。

經過Basic Local Alignment Search Tool Protein比對，發(fā)現(xiàn)JrMYB44蛋白與其他植物的MYB44蛋白具有較高的同源性，選取蛋白序列高度相似的植物構建MYB基因的系統(tǒng)進化樹（圖3-a），通過MEGA 7.0進行序列比對，系統(tǒng)進化分析結果顯示，JrMYB44與雜交核桃、美國山核桃聚為一類；JrMYB13與其他植物蛋白同源性較高，構建系統(tǒng)進化樹（圖3-b），JrMYB13與雜交核桃聚為一類，表明核桃屬間同源蛋白存在較近的親緣關系。

2.3 ‘新露’核桃JrMYB44和JrMYB13 亞細胞定位

首先在Plant-mPLoc網站對JrMYB44和JrMYB13進行預測分析，發(fā)現(xiàn)兩個基因均定位在細胞核內（圖4-a、圖4-b）。通過亞細胞定位，根據熒光形態(tài)明場位置判斷，紅色熒光與綠色熒光重疊，JrMYB44和JrMYB13蛋白的熒光信號定位在細胞核內，表明JrMYB44和JrMYB13能夠進入細胞核內。

2.4 ‘新露’核桃 JrMYB44和 JrMYB13組織特異性表達及不同時期核桃內果皮表達分析

不同組織中，JrMYB44相對表達量在核桃內果皮非硬化區(qū)中顯著高于其他組織（圖5-a）。不同時期 JrMYB44在核桃內果皮非硬化部位相對表達量顯著高于硬化部位（圖5-b），花后64～ 92 d為核桃內果皮木質素合成關鍵時期，花后 64 d‘新露’核桃內果皮出現(xiàn)硬化區(qū)與非硬化區(qū)，JrMYB44在硬化區(qū)相對表達量為1.021，非硬化區(qū)相對表達量達到0.467，花后64 d木質素逐漸積累，非硬化區(qū) JrMYB44相對表達量顯著高于硬化區(qū)，花后71～ 92 d‘新露’核桃內果皮硬化區(qū)與非硬化區(qū)的分區(qū)明顯并在非硬化區(qū)高表達，非硬化區(qū)相對表達量在花后78 d最高為2.324，并和71d-N、71d-H、92d-H差異極顯著。結果分析推測 JrMYB44在核桃內果皮木質素合成代謝途徑中起負調控作用。

核桃內果皮硬化區(qū) JrMYB13相對表達量顯著高于其他組織，為33.3（圖5-c）。在不同時期核桃內果皮硬化與非硬化部位 JrMYB13相對表達量均高于非硬化區(qū)并且差異極顯著（圖5-d），硬化區(qū) JrMYB13相對表達量顯著高于非硬化區(qū)，“新露”核桃內果皮出現(xiàn)硬化狀態(tài)，JrMYB13在非硬化區(qū)相對表達量較低為0.370，硬化區(qū)相對表達量顯著高于非硬化區(qū)為15.316。花后 71～92 d‘新露’核桃內果皮硬化區(qū)與非硬化區(qū)分區(qū)明顯并在硬化區(qū)高表達，在花后71 d、78 d、92 d的硬化區(qū)相對表達量分別為59.167、39.312、16.916。由此推測 JrMYB13在核桃內果皮木質素合成代謝途徑中起正調控作用。

2.5 內果皮不同發(fā)育時期的木質素含量及其與JrMYB44、JrMYB13基因的相關性分析

如圖6所示，隨著核桃內果皮不斷分化，核桃內果皮硬化區(qū)木質素含量總體呈上升狀態(tài)，說明核桃內果皮發(fā)育過程中木質素不斷累積。除71d-H與78d-N之間無差異外，其余時期硬化區(qū)與非硬化區(qū)均有極顯著差異。在花后64 d、71 d的非硬化區(qū)，隨著 JrMYB44相對表達量不斷增加、JrMYB13相對表達量忽略不計，非硬化區(qū)木質素含量逐漸降低；在花后64 d、71 d的硬化區(qū)，隨著 JrMYB44表達量降低、JrMYB13表達量升高并在花后71 d表達量達到最高值，非硬化區(qū)木質素含量在逐漸上升；花后78 d時 JrMYB44表達量在兩部分均升高且非硬化區(qū)高于硬化區(qū)，JrMYB13在非硬化區(qū)升高、在非硬化區(qū)下降，木質素含量在非硬化區(qū)高于硬化區(qū)；花后92 d時，非硬化區(qū)木質素含量達到最低值，JrMYB44表達量在硬化區(qū)急劇下降、表達量低于 JrMYB13表達量，且木質素含量在硬化區(qū)達到整個時期最高值。對內果皮不同發(fā)育時期的木質素含量與 JrMYB44、JrMYB13基因的相關性進行分析發(fā)現(xiàn)（表3），JrMYB44基因在非硬化區(qū)與木質素呈正相關，在非硬化區(qū)呈負相關，推測 JrMYB44基因負調控木質素合成；而 JrMYB13與之相反，在硬化區(qū)與木質素呈正相關，推測 JrMYB13正向調控木質素合成。

3 討論與結論

該研究利用得到的‘新露’核桃轉錄組數據庫序列信息，關注在植物研究中數量最大、功能最多、積極參與植物生長發(fā)育、次生代謝調控、生物和非生物脅迫應答的 R2R3-MYB基因^［30］。選取差異表達基因 JrMYB44、JrMYB13，通過克隆獲得了新疆核桃露仁品種‘新露’的 JrMYB44、JrMYB13 CDS全長序列，利用生物信息學對 JrMYB44、JrMYB13兩轉錄因子的理化性質、親疏水性、跨膜結構域、蛋白結構進行預測。構建JrMYB44、JrMYB13系統(tǒng)發(fā)育樹、超表達載體，并進行亞細胞定位，分析 JrMYB44、JrMYB13基因的進化關系及其在核桃內果皮發(fā)育過程中在不同組織器官特異表達與不同發(fā)育時期硬化與非硬化區(qū)的相對表達特性與木質素含量。結果表明，JrMYB44與雜交核桃和美國山核桃的同源性較高，JrMYB13與雜交核桃同源性較近，且兩蛋白均定位在細胞核內。核桃內果皮非硬化區(qū)木質素含量隨著 JrMYB44的相對表達量的上升而增加，硬化區(qū)木質素含量與 JrMYB44的相對表達量呈負相關；而 JrMYB13相對表達量與木質素含量相關性與 JrMYB44相反。

在煙草中對甘薯轉錄因子 IbMYb44瞬時表達后發(fā)現(xiàn) IbMYb44可減少花青素累積，并與 IbMYB340、IbNAC56a、IbNAC56b相互作用，成為甘薯中花青素的阻遏物^［31］。馬鈴薯StMYB44s通過高溫脅迫負調控花青素生物合成并上調了了苯丙烷、木質素途徑^［32］。對不結球大白菜BcMYB44亞細胞定位顯示是一種核蛋白^［33］，這與該研究的JrMYB44定位結果一致。BcMYB44對花青素合成的調控發(fā)現(xiàn)，該轉錄因子抑制木質素合成代謝途徑中的關鍵基因 F3H的表達，并發(fā)揮負調控作用^［30］。煙草內超表達野菊CiMYB44后其木質素含量與纖維素含量均下降^［34］。定量分析顯示 JrMYB44基因在不同組織與不同時期核桃內果皮發(fā)育過程中硬化與非硬化組織中均有表達，且具有顯著差異，并在幼嫩組織與非硬化區(qū)高表達，木質素含量在非硬化區(qū)整體呈下降趨勢，JrMYB44基因對木質素的積累有負調控作用，與 BcMYB44研究結果相一致。MYB13受脫水、外源 ABA 的調控，可在發(fā)育花的莖尖和基部檢測到^［35-36］，表明它在芽形態(tài)發(fā)生中的潛在作用。在這項研究中，MYB13在樹皮和處理莖中上調。在擬南芥AtMYB13中通過Northern印跡分析證實了其表達模式^［37］，本研究JrMYB13與該研究AtMYB13結果相一致。在苦蕎中對FtMYB13進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)FtMYB13不是轉錄活性的激活劑，而是位于細胞核中，這與 JrMYB13定位在細胞核中的結果相一致。定量結果顯示 JrMYB13基因在不同組織中、不同時期核桃內果皮發(fā)育過程中硬化區(qū)與非硬化區(qū)中均表達，且差異顯著，并在硬化區(qū)高表達，木質素含量在硬化區(qū)整體呈上升趨勢，JrMYB13基因對木質素的積累有正調控作用。

該研究結果有助于進一步探究 JrMYB44、JrMYB13在‘新露’核桃內果皮發(fā)育過程中所起作用，為揭示新疆核桃露仁的分子機理鋪墊理論基礎。為進一步探索兩轉錄因子在核桃內果皮發(fā)育中的作用，后續(xù)可進行異源或本體植物遺傳轉化，以及相關基因、蛋白互作機制的探索研究。綜上，對新疆露仁核桃內果皮發(fā)育的研究非常重要，尤其是內果皮中木質素合成相關基因調控機制已成為核桃育種基礎研究中亟待解決的問題。通過克隆和調控木質素合成的 JrMYB44、JrMYB13因子，改變核桃內果皮中木質素的含量和組成，為核桃內果皮中木質素的合成與代謝提供理論依據，為今后核桃內果皮中轉錄因子全長克隆、功能驗證等分子育種工作奠定堅實基礎。

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Cloning and Expression Analysis of JrMYB44 and JrMYB13 Genes in Endocarp of ‘Xinlu’ Walnut

FU Jiazhi ¹，GUO Zhongzhong²，YU Shangqi² ，WU Pengyu ¹，HU Haifang³ and ZHANG Rui¹

（1.Tarim University， Key Laboratory of Tarim Basin Biological Resources Protection and Utilization Corps of Xinjiang Production and ConstructionCorps， National and Local Joint Engineering Laboratory of Fruit Tree Production in Southern Xinjiang， Alar Xinjiang 843300，China; 2.Tarim University， Key Laboratory of Tarim Basin Biological Resources Protection and Utilization of Xinjiang Production and Construction Corps， National and Local Joint Engineering Laboratory for Production of Characteristic Fruit Trees in Southern Xinjiang，Alar Xinjiang 843300，China; 3. Xinjiang Academy of Forestry， Xinjiang Jiamu Fruit Science National Long-term Research Base， Urumqi 830000，China）

Abstract Lignin synthesis is indispensible for endocarp sclerosis in walnut;however，its regulatory mechanism remains elusive. In this study， we successfully cloned the coding sequences （CDS） of two lignin synthesis-related genes， JrMYB44 and JrMYB13， which were closely associated with lignin synthesis in walnut. We conducted comprehensive analysis to determin the expression levels of these genes in different tissues and organs of walnut， as well as in both sclerotized and non-sclerotized parts of the endocarp during different developmental stages， and we also investigated the subcellular localization of these two proteins.The results showed that： JrMYB44 and JrMYB13 encoded 319 and 317 amino acids，respectively， and the two proteins showed a homologous of 39.5%. Phylogenetic tree analysis revealed that JrMYB44 was close to the homologous proteins of Juglans regia×Juglans major hybrid walnut and pecan， while JrMYB13 was only close to the homologous proteins of Juglans regia×Juglans major hybrid walnut. Subcellular localization result showed that both JrMYB44 and JrMYB13 were expressed in the nucleus. Gene expression investigation revealed that the JrMYB44 gene was mainly expressed in the non-sclerotized zone of walnut endocarp， and its expression level at different developmental stages of endocarp was negatively correlated with the lignin content. Therefore， the JrMYB44 gene would play a negative role in lignin synthesis. By contrast， the JrMYB13 gene was mainly expressed in the sclerotized zone of walnut endocarp and its expression level increased along with the increase of lignin content，indicating that the JrMYB13 gene might play a positive role in lignin synthesis.

Key words Walnut; MYB; Gene cloning; Expression analysis;Fruit development; Lignin

Received 2022-10-07

Returned 2022-12-27

Foundation item The National Natural Science Foundation of China （No.32160698）; Construction for Scientific Research Conditions of South Xinjiang Horticultural Research Center （No.TDZKKY202204）; Research and Innovation Project of Graduate Students in Tarim University （No.TDGRI201916）.

First author FU Jiazhi，female，master student.Research area：high-quality and high-efficiency cultivation and molecular plant breeding in walnut. E-mail：2943729512@qq.com

Corresponding author ZHANG Rui， female， professor. Research area：high-quality and high-efficiency cultivation and molecular plant breeding in walnut. E-mail：zhrgsh@163.com

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）