關(guān)鍵詞：鍶離子;斑馬魚;富集;維拉帕米;金屬硫蛋白

鍶是堿土金屬元素，其中90Sr 是放射性廢液的重點(diǎn)關(guān)注核素之一。90Sr 是由放射性鈾、钚裂變產(chǎn)生，半衰期約29 a，90Sr 在體內(nèi)的代謝模式類似于鈣，可通過水、食物等被人體吸收后主要蓄積在骨組織。當(dāng)放射性鍶蓄積于人體時(shí)，骨髓會(huì)受到β射線輻射，超過一定劑量會(huì)顯著減少血小板、白細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞形態(tài)也會(huì)發(fā)生變化[1] ，更嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致骨癌和白血病的發(fā)生[2] 。由于90Sr 具有的嚴(yán)重的危害性，被美國環(huán)保署認(rèn)定為對環(huán)境危害最大的核素之一[3] 。福島核事故是至今為止最嚴(yán)重的海洋放射性污染事故，大量液態(tài)放射性物質(zhì)直接排放進(jìn)入海洋環(huán)境[4] ，據(jù)估算海洋途徑排放的90Sr 總活度約有9×1013 ～6×1015 Bq[5-6] ，亟需獲取90Sr 在生物體的相關(guān)轉(zhuǎn)移參數(shù)以評估其對生物的輻射影響。

在前期研究中，以釀酒酵母作為模式生物，并培育出抗輻照耐高鍶的酵母Y-7[7] ，隨后模擬了復(fù)合輻照環(huán)境中Y-7 對放射性廢液里鍶的吸附性能[8] 。機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)鍶離子可通過酵母Rsn1p蛋白和L 型鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，分布在可溶性組分中（如液泡液）。鈣離子通道阻滯劑維拉帕米（verapamil， VER）和硝苯地平對Y-7 富集鍶離子具有較好的阻滯效果，有望作為潛在的鍶離子阻滯藥物進(jìn)一步研究。金屬硫蛋白（metallothionein， MT）通過半胱氨酸殘基與金屬離子結(jié)合，參與金屬解毒、金屬離子平衡調(diào)節(jié)，進(jìn)而降低金屬毒性[9] 。因此本實(shí)驗(yàn)利用金屬硫蛋白的金屬解毒能力，研究其是否對斑馬魚體內(nèi)鍶離子具有促排作用。

目前核電廠主要分布于沿海，放射性液態(tài)流出物首先進(jìn)入沿海水域，對水生生物造成直接的影響。因此，我們由單細(xì)胞生物擴(kuò)展到多細(xì)胞生物，將研究對象選為水生模式生物斑馬魚。斑馬魚已廣泛應(yīng)用于水體中重金屬污染物研究，在環(huán)境污染毒性評價(jià)方面有突出貢獻(xiàn)[10] 。本文使用穩(wěn)定Sr 模擬了放射性廢液中鍶在斑馬魚體內(nèi)的蓄積和釋放規(guī)律，并對蓄積模式進(jìn)行評估預(yù)測，為進(jìn)行生物劑量估算及生物效應(yīng)評價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù);同時(shí)，驗(yàn)證了在斑馬魚體內(nèi)維拉帕米阻滯鍶離子蓄積、金屬硫蛋白促進(jìn)鍶排出的效果，為解釋鍶離子在水生生物體內(nèi)蓄積-排出機(jī)制提供了參考，并為維拉帕米、金屬硫蛋白的藥物效果評價(jià)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用魚為AB 系藍(lán)斑馬魚，購自實(shí)驗(yàn)斑馬魚模式中心，魚齡5～6 月，體長3. 5～4. 5 cm。斑馬魚在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前在聚乙烯水缸中馴養(yǎng)一周， 維持水溫28 ℃， 光暗周期比為14 h ∶ 10 h，使用曝氣3 天pH 值在7. 0～8. 0 的自來水，每2 天換一次水，每天喂食兩次，實(shí)驗(yàn)前24 h 停止喂食。每天定時(shí)檢查斑馬魚生活狀況，及時(shí)清除排泄物。

實(shí)驗(yàn)分為6 組，每組25 條斑馬魚，置于5 L 水體中。分別為對照組、Sr10、Sr50、Sr250、Sr50 +VER、Sr50+MT。其中，對照組為5 L 曝氣后自來水;Sr10、Sr50、Sr250 三組使用自來水與SrCl2 配置的不同Sr2+ 濃度溶液， 其中Sr2+ 濃度分別為10 mg/ L、50 mg/ L、250 mg/ L;Sr50+VER 組添加維拉帕米，VER 濃度為1 mg/ L，Sr2+濃度為50 mg/ L;Sr50+MT 組添加金屬硫蛋白，MT 濃度為1 mg/ L，Sr2+濃度為50 mg/ L。

1. 2 主要試劑

90Sr 具有一定的放射性，可能致癌，而其穩(wěn)定同位素Sr2+化學(xué)性質(zhì)與放射性鍶基本一致，并且更加穩(wěn)定，對于試驗(yàn)過程更加可控。參考他人[11-12]以往研究經(jīng)驗(yàn)，我們選擇了穩(wěn)定鍶配置Sr2+溶液。

氯化鍶（ 99. 5%）、維拉帕米（98%），上海麥克林生化科技股份有限公司;生理鹽水（0. 7%）、硝酸（27. 4%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司;金屬硫蛋白（95%），西安展訊生物科技有限公司。

1. 3 樣品處理與檢測

肝臟取材：將斑馬魚置于冰袋上直至無跳動(dòng)后，在體式顯微鏡下取出肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈。魚骨取材：將斑馬魚去除內(nèi)臟，在微波爐中加熱后剔除魚肉，獲取完整的魚骨。將完整斑馬魚（全魚）、肝臟、魚骨同組樣品分別放置在一起，使用玻璃勻漿器進(jìn)行均勻研磨，準(zhǔn)確稱量0. 100 g完整斑馬魚（全魚）、肝臟、魚骨樣品用于微波消解。將稱量好的斑馬魚樣品轉(zhuǎn)移到聚四氟乙稀消解罐中，加入2 mL 6 mol/ L 的濃硝酸，使用微波消解儀消解。消解樣品經(jīng)過稀釋定容至25 mL，使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP - OES， ThermoScientific iCAP PRO XP ICP-OES）測定離子濃度。工作條件設(shè)置為射頻功率1 200 W;等離子氣流量15 L/ min;輔助氣流量0. 25 L/ min;霧化氣氣體流量0. 6 L/ min;溶液提升量1 mL/ min，分析譜線選擇421. 55 nm，采用徑向觀測。

1. 4 雙箱動(dòng)力學(xué)模型

雙箱動(dòng)力學(xué)模型可以描述在一個(gè)穩(wěn)態(tài)的重金屬污染系統(tǒng)中生物富集和釋放重金屬過程的一級動(dòng)力學(xué)模型，通過擬合生物體內(nèi)重金屬動(dòng)態(tài)含量，可以預(yù)測平衡濃度、生物半衰期、生物富集系數(shù)和生物富集因子[13] 。由于鍶不具有揮發(fā)性，以及實(shí)驗(yàn)中斑馬魚長期處于鍶離子環(huán)境中，故將模型簡化為僅在水相與生物體相兩相間交互，簡化后的雙箱動(dòng)力學(xué)模型原理見圖1。

圖中k1 為生物富集速率常數(shù)，k2 為生物排出速率常數(shù); CW 為水體金屬離子濃度，mg/ L;CA 為生物體重金屬離子含量，μg/ g。

式中，t 為實(shí)驗(yàn)時(shí)間，d;t? 為蓄積階段結(jié)束時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)中t? = 14 d，C0 為生物體內(nèi)初始Sr2+ 含量，μg/ g。

由（3）和（4）式通過非線性曲線擬合可得到k1、k2。在理論平衡濃度下，可由以下公式求得生物半衰期（T1/ 2）和生物富集系數(shù)（BCF）：

1. 5 數(shù)據(jù)處理

將雙箱動(dòng)力學(xué)模型公式編輯至Origin 2021 擬合函數(shù)生成器，并將處理過的數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性曲線擬合。顯著性分析使用SPSS 27. 0，顯著性水平為0. 05。

2 結(jié)果

2. 1 斑馬魚對不同濃度鍶的富集代謝規(guī)律

在14 d 的蓄積實(shí)驗(yàn)中，斑馬魚暴露在濃度為10、50、250 mg/ L 的鍶溶液環(huán)境，隨著Sr2+ 濃度的升高，斑馬魚及其組織器官的鍶含量升高，富集量與Sr2+暴露濃度正相關(guān)，如圖2 所示。蓄積開始階段鍶含量增長速率最快，后逐漸減小，在蓄積的第14 天鍶含量達(dá)到實(shí)驗(yàn)階段的最大值，排出階段也具有時(shí)間依賴性，顯示出明顯的鍶釋放過程。在同一Sr2+濃度暴露水平下，蓄積的速率和鍶富集量表現(xiàn)為骨gt;肝臟gt;全魚，排出速率表現(xiàn)為全魚gt;肝臟gt;骨。

2. 2 斑馬魚對鍶的生物富集和排出動(dòng)力學(xué)參數(shù)

采用雙箱動(dòng)力學(xué)模型，對斑馬魚及不同組織器官對鍶的富集和排出數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，得到的生物富集和排出動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表1 所示。

全魚、骨和肝臟的生物富集速率常數(shù)、生物富集系數(shù)、理論富集平衡狀態(tài)金屬含量和生物半衰期的關(guān)系為：骨gt;肝臟gt;全魚。全魚、骨和肝臟對生物排出速率常數(shù)的大小關(guān)系為：全魚gt;肝臟gt;骨。這可能與Sr 的富集分布具有選擇性，Sr 的性質(zhì)類似于Ca，骨是其最集中分布器官有關(guān)。而肝臟作為解毒的重要器官其理論富集平衡金屬含量也要高于全魚。理論富集平衡狀態(tài)金屬含量與Sr2+ 暴露濃度呈正相關(guān)。富集速率常數(shù)和生物富集系數(shù)與Sr2+暴露濃度呈負(fù)相關(guān)，可能是斑馬魚為維持生物體金屬穩(wěn)態(tài)而產(chǎn)生的自我調(diào)節(jié)機(jī)制，以及生物體富集鍶離子濃度逐漸升高趨于飽和，導(dǎo)致對Sr的富集減少。

2. 3 維拉帕米對斑馬魚體內(nèi)富集鍶離子影響

維拉帕米對斑馬魚不同部位富集Sr2+ 的影響如圖3 所示。與Sr50 組進(jìn)行對比，在0 ～14 天的蓄積過程中，Sr50+VER 組全魚、骨和肝臟的鍶含量均顯著低于Sr50 組（Plt;0. 05），具體數(shù)值列于表2。維拉帕米是一種非二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，通過與L 型鈣通道的α-1 亞基（CaV1. 2）結(jié)合等機(jī)制抑制鈣離子通道的活性，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞層面維拉帕米能夠抑制酵母細(xì)胞對Sr2+的富集;本研究結(jié)果顯示在活體動(dòng)物層面，維拉帕米能夠降低斑馬魚全魚、骨骼、肝臟對Sr2+的富集，提示維拉帕米具有潛在的抑制動(dòng)物富集鍶離子的能力。

2. 4 金屬硫蛋白對斑馬魚體內(nèi)排出鍶離子影響

金屬硫蛋白對斑馬魚及組織器官排出Sr2+ 影響如圖4 所示。在14 天的排出實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，Sr50+MT 組全魚和骨鍶含量無顯著差異，肝臟含量顯著低于Sr50 組（Plt;0. 05） ，具體數(shù)值列于表3。針對骨，金屬硫蛋白未出現(xiàn)促排效果[14] ，一方面可能由于金屬硫蛋白在骨組織累積量較少;另一方面，由于骨組織特定的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，金屬硫蛋白尚不能將沉積于骨的Sr2+ 動(dòng)員入血，促進(jìn)Sr2+的排出。金屬硫蛋白在肝臟中起到金屬解毒作用，其與金屬離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的金屬-巰基復(fù)合物，防止金屬離子損傷細(xì)胞器、DNA 等重要結(jié)構(gòu)，促進(jìn)金屬離子排出[15] ，與本實(shí)驗(yàn)顯示的金屬硫蛋白具有促進(jìn)肝臟排出Sr2+的作用結(jié)果一致。

3 討論

通過設(shè)置不同濃度的90Sr 水體環(huán)境，研究了斑馬魚對Sr2+ 富集-排出代謝規(guī)律。研究表明，Sr2+在斑馬魚骨、肝、臟全魚都有積累，其Sr2+含量與暴露濃度和時(shí)間成正相關(guān)，且蓄積速率隨蓄積時(shí)間延長而減小。在同一鍶濃度暴露水平下，斑馬魚及其組織器官鍶蓄積量和蓄積的速率從大到小為：骨gt;肝臟gt;全魚，排出階段速率為：全魚gt;肝臟gt;骨。多種生物研究表明，鍶在生物體內(nèi)的代謝模式類似于鈣，通過水、食物等被生物體吸收后主要蓄積在骨組織[16-18] ，約占體內(nèi)鍶總量的99%[19] 。在鍶暴露濃度為50 mg/ L 時(shí)，蓄積第14 天時(shí)斑馬骼的蓄積含量是肝臟中鍶含量的3. 09 倍、全魚中鍶含量的4. 95 倍，在其他濃度下，也呈現(xiàn)類似的倍數(shù)關(guān)系。在其它對生物富集鍶的研究中，骨骼中的鍶含量也處于較高水平。有研究表明，通過飲食給成年斑馬魚喂鍶，用富鍶飲食處理的魚骨密度增加[20] ;也有研究顯示鍶易被腸道細(xì)胞吸收，分布在血漿和細(xì)胞外液、軟組織和骨骼，隨著血液中鍶濃度的增加，骨骼中鍶的濃度明顯升高[21] 。肝臟具有金屬解毒、代謝合成、免疫防御等功能，也被認(rèn)為是多種重金屬元素儲(chǔ)存的主要器官[22] ，對一般重金屬元素而言，肝臟中的重金屬含量較高，而肌肉等其他組織器官的重金屬含量較低[23] ，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示了肝臟中的鍶含量要明顯高于全魚平均水平。

針對Y-7 酵母的研究中[7] ，鈣離子通道阻滯劑維拉帕米可以阻滯Y-7 胞內(nèi)富集Sr2+，主要作用于質(zhì)膜的L 型鈣離子通道。本研究顯示，維拉帕米對斑馬魚富集Sr2+ 具有阻滯作用，可能與鈣離子通道有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，維拉帕米明顯降低了斑馬魚全魚、骨和肝臟的鍶濃度，證明了其具有阻滯斑馬魚富集鍶的能力。目前諸多研究表明金屬硫蛋白在重金屬解毒及排出方面具有顯著效果，其解毒排出機(jī)制包括修復(fù)金屬引起的損傷和減少生物體內(nèi)重金屬含量兩個(gè)方面，包括提高重金屬耐受性、重金屬代謝調(diào)節(jié)、修復(fù)氧化損傷等[24] 。肝臟可以迅速的合成金屬硫蛋白，是金屬硫蛋白合成的主要場所之一，是重金屬蓄積的主要器官。在本實(shí)驗(yàn)中，暴露在添加了金屬硫蛋白環(huán)境中的斑馬魚，肝臟鍶含量明顯降低，可以看出金屬硫蛋白在肝臟中有一定的輔助排鍶能力;而全魚和骨的鍶含量均未發(fā)生明顯變化，可能是由于金屬硫蛋白未在骨組織累積或在機(jī)體其他位置累積量過少導(dǎo)致。

4 結(jié)論

Sr2+在斑馬魚骨、肝臟、全魚都有累積，Sr 含量與暴露濃度和時(shí)間成正相關(guān)，且蓄積速率隨蓄積時(shí)間延長而減小。在同一鍶濃度暴露水平下，斑馬魚及其組織器官鍶蓄積量和蓄積的速率從大到小為：骨gt;肝臟gt;全魚，排出階段速率為：全魚gt;肝臟gt;骨。維拉帕米對Sr2+ 在斑馬魚骨、肝臟、全魚部位的蓄積均有明顯阻滯作用，金屬硫蛋白能輔助Sr2+在肝臟的排出。