摘要：以3種市售醬油為研究對象，利用二極管陣列檢測器結(jié)合外標(biāo)法定量考察醬油中L-色氨酸含量；基于偏最小二乘法進(jìn)行醬油中L-色氨酸含量預(yù)測。結(jié)果表明，在最大吸收波長302 nm、流動(dòng)相pH 5.0、柱溫37 ℃、流速1.2 mL/min、流動(dòng)相為甲醇比例12%、乙酸鈉緩沖液含量0.015 mol/L的乙酸鈉緩沖液-甲醇、氫氧化鈉濃度0.015 mol/L下進(jìn)行醬油中L-色氨酸含量檢測時(shí)效果最優(yōu)；在光譜范圍462～506 nm、612～698 nm、794～858 nm之間時(shí)，校正集相關(guān)系數(shù)為0.985 1，均方根誤差為0.491；預(yù)測集相關(guān)系數(shù)為0.987 3，均方根誤差為0.373，其模型精度最高。利用高光譜圖像技術(shù)可以快速有效地進(jìn)行醬油中L-色氨酸含量的測定，其結(jié)果可為醬油分析提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：高光譜圖像技術(shù)；醬油；L-色氨酸含量

中圖分類號：TS264.21""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）12-0171-04

Application of Hyperspectral Imaging Technology in Analysis

of L-Tryptophan Content in Soy Sauce

ZHANG Huan-jun1， XU Qing-lei1， WANG Wen-wen2

（1.Zhumadian Vocational and Technical College， Zhumadian 463000， China; 2.Binhai School of

Foreign Affairs of Tianjin Foreign Studies University， Tianjin 300270， China）

Abstract： Taking three types of commercially available soy sauce as the research objects， the content of L-tryptophan in soy sauce is quantitatively examined using diode array detector combined with external standard method. The prediction of L-tryptophan content in soy sauce is carried out based on partial least squares method. The results show that the detection effect of L-tryptophan content in soy sauce is the best when the maximum absorption wavelength is 302 nm， the pH of the mobile phase is 5.0， the column temperature is 37 ℃， the flow velocity is 1.2 mL/min，" the mobile phase is sodium acetate buffer-methanol with the methanol proportion of 12% and the sodium acetate buffer content of 0.015 mol/L， and the concentration of sodium hydroxide is 0.015 mol/L. When the spectral range is 462～506 nm， 612～698 nm and 794～858 nm， the correlation coefficient of the calibration set is 0.985 1 and the root mean square error is 0.491; the correlation coefficient of the prediction set is 0.987 3 and the root mean square error is 0.373， indicating that the accuracy of the model is the highest. Using hyperspectral imaging technology can rapidly and effectively determine the L-tryptophan content in soy sauce， and the results can provide a theoretical basis and data support for soy sauce analysis.

Key words： hyperspectral imaging technology; soy sauce; L-tryptophan content

收稿日期：2024-06-18

基金項(xiàng)目：河南高等教育教學(xué)改革研究與實(shí)踐項(xiàng)目（2021SJGLX866）

作者簡介：張煥?。?978—），女，河南駐馬店人，副教授，碩士，研究方向：高光譜圖像技術(shù)在食品工藝中的應(yīng)用。

醬油是中國傳統(tǒng)的液體調(diào)味品，因其豐富的口感而深受人們喜愛，是一種大豆發(fā)酵類產(chǎn)品［1-2］。醬油主要由大豆、小麥、食鹽等原材料經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成，呈紅褐色，色澤鮮亮，有獨(dú)特的醬香味，口感咸鮮，味道豐富，能改善菜肴的口感和風(fēng)味，因此在烹飪中作為常見的調(diào)味品，有提升菜品風(fēng)味、改善菜肴色澤、激發(fā)食欲的作用。由于醬油風(fēng)味獨(dú)特，其被廣泛應(yīng)用于烹調(diào)、食品加工等領(lǐng)域，并已從亞洲國家逐漸走向全球市場［3-4］。

醬油作為大豆類發(fā)酵產(chǎn)品，含有豐富的有機(jī)酸、氨基酸、還原糖等營養(yǎng)成分。在所含的氨基酸中，谷氨酸的含量最高，蘇氨酸的含量其次。醬油中所含氨基酸不僅可以直接被人體吸收，而且具有多種生理功能，如維持人體氮平衡、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)代謝等。同時(shí)還可以通過美拉德反應(yīng)生成復(fù)雜的香味物質(zhì)，賦予醬油特有的風(fēng)味和色澤。其中，L-色氨酸作為人體必需氨基酸，是評價(jià)醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)之一［5］。醬油中的L-色氨酸在烹飪過程中與食材中微量金屬離子有機(jī)結(jié)合，可形成理化性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)螯合物，提升產(chǎn)品的風(fēng)味［6］。

進(jìn)行L-色氨酸檢測的傳統(tǒng)方法為理化分析法（凱氏定氮法）、儀器檢測法（氨基酸分析儀法）、高效液相色譜法等［7-14］，這些方法往往存在樣品被破壞、檢測成本高、持續(xù)時(shí)間長、檢測所需技術(shù)要求高等特點(diǎn)，與目前對食品安全快速、便捷的檢測要求不符，因此急需探討操作簡便且結(jié)果準(zhǔn)確的檢測方法。

高光譜圖像技術(shù)是一種新型的遙感技術(shù)，利用光譜成像技術(shù)獲取大量連續(xù)的光譜信息，從而形成高維數(shù)據(jù)矩陣，因此被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、農(nóng)業(yè)、地質(zhì)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域［15］。高光譜圖像技術(shù)的核心在于光譜成像技術(shù)，它通過將目標(biāo)物體發(fā)射或反射的光譜信息捕獲并成像，從而得到目標(biāo)物體的光譜信息，這些信息可以反映目標(biāo)物體的物質(zhì)成分、結(jié)構(gòu)、分布等特征，具有高分辨率、多波段全面了解目標(biāo)信息等優(yōu)點(diǎn)。在食品安全檢測領(lǐng)域，與高效液相色譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等相比，高光譜圖像技術(shù)可以對樣品進(jìn)行在線檢測，且在檢測過程中樣品結(jié)構(gòu)保持完整，不會(huì)造成樣品破壞性損傷，尤其對于需進(jìn)行過程性分析的實(shí)驗(yàn)樣品更加友好，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、快捷、高效。因此，目前在食品安全檢測領(lǐng)域應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，在果蔬［16］、肉類產(chǎn)品［17］的成分含量分析方面均有報(bào)道。

本文通過高效液相色譜法和高光譜圖像技術(shù)檢測方法對市售醬油進(jìn)行L-色氨酸含量檢測，通過回歸分析獲得相關(guān)系數(shù)，最終判定兩種方法的相關(guān)性，為高光譜圖像技術(shù)在醬油L-色氨酸含量測定中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

3種醬油樣品：購于駐馬店大潤發(fā)超市；L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、NaOH、無水乙酸鈉、冰醋酸（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

APC-8015C高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器） 河南奧普斯儀器設(shè)備有限公司；SBD750成像光譜儀 美國FIGS公司；高光譜分析儀其他組成部分包括暗箱、升降臺(tái)、鹵鎢燈、計(jì)算機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜法

1.2.1.1 L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和儲(chǔ)備液制備

準(zhǔn)確稱取10 mg L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，定容于10 mL容量瓶中，于4 ℃避光保存；分別準(zhǔn)確吸取L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1 mL，分別定容至10 mL，制成濃度為100，80，60，40，20，10 μg/mL的儲(chǔ)備液，在室溫下避光保存。

1.2.1.2 NaOH溶液制備

準(zhǔn)確稱取0.4 g氫氧化鈉，定容至100 mL容量瓶中，在室溫下保存。

1.2.1.3 乙酸鈉緩沖液制備

準(zhǔn)確稱取0.82 g無水乙酸鈉，溶解于1 000 mL水中，使用冰醋酸調(diào)節(jié)pH為5.0。

1.2.1.4 樣品制備

取0.2 g醬油樣品，置于蛋白質(zhì)水解管中，加入1.0 mL NaOH溶液，振蕩2 min，充氮2 min，置于114 ℃烘箱中水解22 h。置于室內(nèi)待恢復(fù)至室溫，用乙酸鈉緩沖液定容至50 mL，過濾，上機(jī)分析。

1.2.1.5 色譜條件

色譜柱：反相C18柱；最大吸收波長：302 nm；流動(dòng)相：乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）；流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣量：25 μL；柱溫：37 ℃。

1.2.2 高光譜檢測

高光譜信息采集過程設(shè)置高光譜分析儀測定范圍為400～1 100 nm；光譜圖像分辨率為2.5 nm；樣品光譜信息采集過程中圖像分辨率為748×1 836像素；實(shí)驗(yàn)臺(tái)傳送速度為1.0 mm/s；相機(jī)曝光率為35 s。

信號采集：信號采集開始前，需進(jìn)行相關(guān)預(yù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后依據(jù)傳送臺(tái)傳輸速度1.0 mm/s、相機(jī)曝光率35 s進(jìn)行采集。光纖裝置開機(jī)預(yù)熱15 min后，準(zhǔn)確吸取1 mL醬油樣品置于載物臺(tái)中間，調(diào)節(jié)傳送裝置傳送方向，以1.0 mm/s的速度經(jīng)過相機(jī)鏡頭下方，以35 s曝光率進(jìn)行拍照，獲得樣品信息。以同樣方式進(jìn)行空載物臺(tái)及上置黑板拍照，獲得背景的高光譜信息［18-19］。采集光譜圖像計(jì)算方法參考文獻(xiàn)［20］。

Rλ=Iλ－BλWλ－Bλ。

式中： Rλ為光譜入射率；Iλ為校正前數(shù)據(jù)，W/（m2·nm）；Wλ為標(biāo)定板數(shù)據(jù)，W/（m2·nm）；Bλ為基底信號數(shù)據(jù)，W/（m2·nm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法檢測醬油中L-色氨酸含量

2.1.1 柱溫篩選

由于柱溫嚴(yán)重影響色譜出峰時(shí)間，溫度越高，出峰時(shí)間越短，因此需對過柱溫度進(jìn)行篩選。當(dāng)柱溫低于37 ℃時(shí)，L-色氨酸含量檢測受到影響，出峰效果不佳；當(dāng)柱溫高于37 ℃時(shí)，出峰速度快但分離效果不佳，影響結(jié)果分析，因此，確定過柱溫度為37 ℃。

2.1.2 流動(dòng)相pH環(huán)境確定

pH環(huán)境對液相色譜的出峰情況和靈敏度會(huì)造成一定的影響，從而影響檢測結(jié)果。在檢測pH 3.0～5.0的乙酸鈉緩沖體系環(huán)境對L-色氨酸含量的影響后發(fā)現(xiàn)，隨著流動(dòng)相pH的降低，出峰時(shí)間變慢，影響實(shí)驗(yàn)分析時(shí)間，同時(shí)產(chǎn)生較多雜峰，影響L-色氨酸的峰形分析；隨著pH的升高，出峰速度提高，L-色氨酸的分離效果提高，但當(dāng)pH高于5.0時(shí)又產(chǎn)生較多雜峰，影響結(jié)果分析，因此，確定流動(dòng)相pH為5.0。

2.1.3 流動(dòng)相選擇

高效液相色譜流動(dòng)相常以甲醇、乙腈、離子對流動(dòng)相（如四丁基銨、四乙基銨等）為基礎(chǔ)性流動(dòng)相。在本實(shí)驗(yàn)中，以甲醇比例不同的乙酸鈉緩沖液-甲醇為流動(dòng)相，并篩選出12%甲醇比例的乙酸鈉緩沖液-甲醇流動(dòng)相。同時(shí)篩選乙酸鈉緩沖液比例，以0，0.005，0.01，0.015 mol/L 4種不同含量的乙酸鈉緩沖液-甲醇流動(dòng)相對L-色氨酸含量進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乙酸鈉緩沖液-甲醇流動(dòng)相中乙酸鈉含量為0.015 mol/L時(shí)，L-色氨酸檢測出峰效果最佳，雜峰干擾少；而當(dāng)高于或低于該濃度時(shí)，均出現(xiàn)較多雜峰，影響結(jié)果分析。因此，最終確定以12%甲醇比例、含0.015 mol/L乙酸鈉緩沖液的乙酸鈉緩沖液-甲醇為檢測流動(dòng)相。

2.1.4 水解條件篩選

L-色氨酸作為一種氨基酸，其結(jié)構(gòu)在酸性條件下極易被破壞，因此，本實(shí)驗(yàn)中利用堿水解方式進(jìn)行處理。但氫氧化鈉濃度嚴(yán)重影響氨基酸的水解效果，并最終影響峰面積的分析。本實(shí)驗(yàn)選擇不同濃度的氫氧化鈉（0.010，0.015，0.020，0.025 mol/L）對大豆蛋白進(jìn)行水解，比較結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氫氧化鈉濃度為0.015 mol/L時(shí)，L-色氨酸峰面積保持一致，蛋白水解完全，效果較好。

2.1.5 醬油樣品檢測

在條件篩選后，在最大吸收波長302 nm、流動(dòng)相pH 5.0、柱溫37 ℃、流速1.2 mL/min的條件下進(jìn)行L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)譜圖繪制，L-色氨酸峰形顯著。在302 nm波長處，吸收峰的靈敏度高、干擾小；以吸收峰面積為縱坐標(biāo)、L-色氨酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合方程為Y=26+241.5X（R2=0.99）。以此方程進(jìn)行3種市售醬油產(chǎn)品的檢測，獲得3種醬油樣品中L-色氨酸含量，見表2和表3。

由表2和表3可知，3種醬油產(chǎn)品中L-色氨酸含量范圍為0.35～0.42 g/kg，這是由于在不同品牌的醬油生產(chǎn)中，其生產(chǎn)工藝有差異，同時(shí)也與所選用的大豆品種有關(guān)。在生產(chǎn)過程中，L-色氨酸結(jié)構(gòu)可能遭到一定程度的破壞，也會(huì)導(dǎo)致L-色氨酸的含量下降［5］。

2.2 高光譜圖像技術(shù)檢測醬油中L-色氨酸含量

在高光譜圖像數(shù)據(jù)采集過程中，儀器、操作、基線漂移等情況會(huì)導(dǎo)致采集的信號數(shù)據(jù)信息量大、冗余數(shù)據(jù)多，影響數(shù)據(jù)結(jié)果的采集和處理。因此，如果直接對原始光譜圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行建模處理，會(huì)出現(xiàn)較大誤差，需要將采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，提升建模的精度［21］。

聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘模型是常規(guī)區(qū)間偏最小二乘法的一種改進(jìn)，將同一次區(qū)間中精度較高的幾個(gè)局部區(qū)域所在子區(qū)間聯(lián)合統(tǒng)計(jì)，從而獲得目標(biāo)樣品的相關(guān)參數(shù)［22-24］。在此過程中，首先將整個(gè)光譜區(qū)域劃分為多個(gè)等寬子區(qū)間，然后于每個(gè)子區(qū)間內(nèi)進(jìn)行一次偏最小二乘回歸，此時(shí)即可獲得每一個(gè)子區(qū)間的局部回歸模型，從而獲得多個(gè)子區(qū)間的局部回歸模型；隨后通過交互驗(yàn)證獲得多個(gè)局部回歸模型的精度衡量，經(jīng)比較全光譜模型和各個(gè)局部回歸模型的精度，篩選獲得精度較好的模型子區(qū)間，將這些精度較好的子區(qū)間再聯(lián)合建立高精度局部回歸模型，再以高精度局部回歸模型集進(jìn)行交互驗(yàn)證，從而確定特征波譜區(qū)間組合。

由于尚未見任何關(guān)于獲得醬油中L-色氨酸含量檢測的高光譜聯(lián)合建模子區(qū)間數(shù)目的報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)將整個(gè)光譜區(qū)域劃分為3，4，5，6，……，9個(gè)子區(qū)間，從而考察子區(qū)間劃分對模型精度和最佳波長區(qū)間的影響。同時(shí)，在相同子區(qū)間下又聯(lián)合2～4個(gè)子區(qū)間，建模結(jié)果見表4。

由表4可知，選用多個(gè)子區(qū)間進(jìn)行聯(lián)合建模后，醬油中L-色氨酸含量的測定校正結(jié)果較好。當(dāng)劃分為4個(gè)子區(qū)間、聯(lián)合3個(gè)子區(qū)間數(shù)、主成分因子為5時(shí)獲得的醬油中L-色氨酸含量校正模型最優(yōu)，此時(shí)選取的子區(qū)間為3，5，14，校正集相關(guān)系數(shù)為0.985 1，均方根誤差為0.491；預(yù)測集相關(guān)系數(shù)為0.987 3，均方根誤差為0.373。

3 結(jié)論

本研究通過比較篩選獲得高效液相色譜法檢測醬油中L-色氨酸含量的最優(yōu)方法：最大吸收波長302 nm、流動(dòng)相pH 5.0、柱溫37 ℃、流速1.2 mL/min、12%甲醇比例、含0.015 mol/L乙酸鈉緩沖液的流動(dòng)相、氫氧化鈉濃度0.015 mol/L。

準(zhǔn)確獲知3種市售醬油中L-色氨酸的含量后，通過高光譜圖像技術(shù)進(jìn)行檢測，從而獲得高光譜圖像技術(shù)預(yù)測醬油中L-色氨酸含量的最佳模型。通過選取最優(yōu)波段的光譜信息，建立最有效的預(yù)測模型，獲得結(jié)果：在光譜范圍462～506 nm、612～698 nm、794～858 nm之間時(shí)，校正集相關(guān)系數(shù)為0.985 1，均方根誤差為0.491；預(yù)測集相關(guān)系數(shù)為0.987 3，均方根誤差為0.373，其模型精度最高。結(jié)果表明，高光譜圖像技術(shù)可以應(yīng)用于醬油中L-色氨酸含量的檢測。

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