摘要：L-乳酸的同分異構體D-乳酸會引起代謝性酸中毒、腸道屏障受損或其他未知的危害，因此需要減少用作食品酸味劑的L-乳酸中的D-乳酸含量。該研究通過加入硝酸鈉以加強大腸桿菌L-乳酸工程菌在厭氧條件下對外源D-乳酸的消除；同時敲除L-乳酸脫氫酶基因（lldD基因、ykgEFG基因）以降低其對L-乳酸的消耗。搖瓶發(fā)酵實驗證明，敲除L-乳酸脫氫酶基因的工程菌HBUT-LB，在添加20 mmol/L硝酸鈉后，可有效清除1 g/L的外源性D-乳酸。在7 L發(fā)酵罐中利用含有D-乳酸的廉價原料進行發(fā)酵，添加20 mmol/L硝酸鈉相對于未添加硝酸鈉，工程菌HBUT-LB的D-乳酸消耗速率提高460%，L-乳酸的光學純度從99.32%提升到99.99%。同時，最終發(fā)酵液中無硝酸鈉與亞硝酸鈉殘留。結(jié)果表明，大腸桿菌工程菌HBUT-LB在發(fā)酵過程中，通過添加硝酸鈉，可有效消除外源D-乳酸，提高L-乳酸的光學純度，具有精制超高光學純度L-乳酸的工業(yè)應用價值。

關鍵詞：L-乳酸的光學純度；L-乳酸脫氫酶基因；硝酸鈉

中圖分類號：TS202.3""""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）12-0179-06

Study on Elimination of Exogenous D-Lactic Acid by Escherichia coli L-Lactic

Acid Engineering Bacteria for Improving Optical Purity

YU Jie1， MAIREHABA·Yusufu1， WANG Jin-hua1，2，3， WANG Yong-ze1，2，3，

GAO Wa1，2，3， ZHAO Xiao1，2，3*

（1.School of Life and Health Sciences， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China; 2.Key

Laboratory of Fermentation Engineering， Ministry of Education， Hubei University of Technology，

Wuhan 430068， China; 3.Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation

Co-constructed by Ministry of Education and Hubei Province， Hubei

University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： D-lactic acid， an isomer of L-lactic acid， can cause metabolic acidosis， intestinal barrier damage or other unknown hazards， so there is a need to reduce the amount of D-lactic acid in L-lactic acid used as a food acidifier. In this study， the sodium nitrate is added to enhance the elimination of exogenous D-lactic acid by Escherichia coli L-lactic acid engineering bacteria under anaerobic conditions as well as the deletion of L-lactate dehydrogenase genes （lldD gene，ykgEFG gene） to reduce their consumption of L-lactic acid.Through shaking flask fermentation experiment， it is proven that the engineering bacterium HBUT-LB， which has knocked out the L-lactate dehydrogenase gene， can effectively remove 1 g/L exogenous D-lactic acid after adding 20 mmol/L sodium nitrate.Fermentation is carried out in a 7 L fermenter using inexpensive raw materials containing D-lactic acid. The consumption rate of D-lactic acid increases by 460% with adding 20 mmol/L sodium nitrate compared to without adding sodium nitrate， and

the optical purity of L-lactic acid increases from 99.32% to 99.99% in the engineering bacterium HBUT-LB. At the same time， there is no sodium nitrate and sodium nitrite residue in the final fermentation broth. The results show that the addition of sodium nitrate during the fermentation with engineering strain HBUT-LB can effectively eliminate the exogenous D-lactic acid， improve the optical purity of L-lactic acid， which has industrial application value in refining L-lactic acid with ultra-high optical purity.

Key words： optical purity of L-lactic acid; L-lactate dehydrogenase gene; sodium nitrate

收稿日期：2024-06-04

基金項目：國家自然科學基金青年項目（31501677）；教育部工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心2023年開放基金（4303-00149）；企業(yè)合作項目（2022101（1））

作者簡介：余杰（1999—），男，碩士研究生，研究方向：生物工程。

*通信作者：趙筱（1982—），女，講師，博士，研究方向：微生物遺傳改造和發(fā)酵。

L-乳酸作為一種食品添加劑，被廣泛應用于調(diào)味品、酸奶制品等食品中。它可以增加食品的口感，延長食品的保質(zhì)期，具有廣闊的應用前景。然而，需要注意的是，L-乳酸的同分異構體D-乳酸對人體有一定的毒性。長期攝入D-乳酸可能會導致腸道屏障受損、代謝性酸中毒或其他未知的危害。因此，在使用L-乳酸作為食品添加劑時，需盡量減少D-乳酸的含量，從而保證食品的安全和品質(zhì)［1-2］。

工業(yè)發(fā)酵L-乳酸時，可通過以下途徑提高L-乳酸的純度。對于不存在D-乳酸生產(chǎn)途徑的菌株，如芽孢桿菌、米根霉等，主要通過減少發(fā)酵過程中如丙酮酸、琥珀酸等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而提高其化學純度，即提高L-乳酸的純度［3-4］；對于存在D-乳酸生產(chǎn)途徑的菌株，如大腸桿菌、鼠李糖乳桿菌等，在減少副產(chǎn)物產(chǎn)生的同時，還需通過減少D-乳酸的生產(chǎn)途徑以減少D-乳酸產(chǎn)生，從而提高L-乳酸的純度［5-6］。以上兩種策略主要針對降低菌株自身代謝時產(chǎn)生的副產(chǎn)物，但沒有考慮到發(fā)酵過程中若摻雜外源D-乳酸從而影響L-乳酸光學純度的情況，同時也鮮有相關文獻報道針對此類問題的解決方案。在工業(yè)化同型發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸時，通常使用玉米漿、葡萄糖結(jié)晶廢糖液等廉價原料作為發(fā)酵原料［7-9］。如果保存條件不佳，這些原料中就會有少量D-乳酸，從而影響最終發(fā)酵產(chǎn)物L-乳酸的光學純度。

大腸桿菌具有天然利用乳酸為碳源的能力，由dld基因編碼的D-乳酸脫氫酶是一種FAD依賴性外周膜脫氫酶，能將D-乳酸催化為丙酮酸［10］。由lldD基因編碼的L-乳酸脫氫酶是一種FMN依賴性膜相關脫氫酶，能催化L-乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸［11］。在這兩個過程中，都需要末端電子受體使FAD和FMN再生。因此，在利用大腸桿菌工程菌進行L-乳酸發(fā)酵時，加入末端電子受體有利于D-乳酸的轉(zhuǎn)化。有文獻顯示大腸桿菌的ykgEFG基因的低拷貝表達可恢復 Δdld-Ⅱ ΔlldF缺失突變株（Shewanella oneidensis）在L-乳酸上的生長，推測ykgEFG基因可能與L-乳酸代謝相關［12］。在發(fā)酵過程中，為避免L-乳酸被消耗，需要敲除代謝L-乳酸的相關基因（lldD、ykgEFG）。

本研究在大腸桿菌L-乳酸工程菌發(fā)酵過程中加入硝酸鈉，旨在提高其在厭氧環(huán)境下對D-乳酸的轉(zhuǎn)化能力。同時，敲除L-乳酸脫氫酶相關基因（lldD基因、ykgEFG基因）以減少硝酸鈉對L-乳酸消耗的影響，進一步考察硝酸鈉對大腸桿菌工程菌發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的光學純度的影響，為生產(chǎn)高純度L-乳酸提供了有力的支持。該研究對于提高發(fā)酵生產(chǎn)過程中的效率和產(chǎn)物質(zhì)量具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒、引物

出發(fā)菌株為大腸桿菌工程菌HBUT-L（ΔfrdBC、ΔadhE、ΔpflB、ΔldhA：：ldhL）、質(zhì)粒pSIM6、質(zhì)粒pKD4，均由本實驗室保存。

實驗所需引物見表1。

1.1.2 試劑與設備

Taq Master Mix酶：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；玉米漿與葡萄糖結(jié)晶廢糖液：濰坊盛泰藥業(yè)有限公司。

PCR儀 美國Bio-Rad公司；Sartorius BB-8846880賽多利斯發(fā)酵罐 Sartorius Stedim Biotech公司；Waters e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

氨芐篩選平板：含50 mg/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基；卡那篩選平板：含50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：含20 g/L葡萄糖的NBS培養(yǎng)基［13］；廉價原料發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿與葡萄糖結(jié)晶廢糖液的混合液。

1.2 方法

1.2.1 工程菌HBUT-LA的構建與驗證

1.2.1.1 打靶片段的制備與純化

為了獲得帶有Kan基因的片段，使用質(zhì)粒pKD4為模板，并通過P1和P2進行Polymerase Chain Reaction （PCR）。

1.2.1.2 lldD基因的敲除與驗證

通過CaCl2法將質(zhì)粒pSIM6轉(zhuǎn)化到菌株HBUT-L上，通過氨芐篩選平板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子HBUT-L/pSIM6［14-15］。在誘導出Red重組所需蛋白質(zhì)后，通過電擊轉(zhuǎn)化法使打靶片段進入菌體內(nèi)，待培養(yǎng)3 h后，涂布于卡那篩選平板中培養(yǎng)［16］。用引物P3和P4、P5和P6，通過PCR法進行驗證，若無lldD基因則命名為HBUT-LA。

1.2.2 工程菌HBUT-LB的構建與驗證

利用引物P7和P8進行PCR擴增得到打靶片段，在工程菌HBUT-LA的基礎上敲除ykgEFG基因，并通過P9和P10、P11和P12進行PCR擴增，若無ykgEFG基因則命名為HBUT-LB。

1.2.3 基因缺陷型菌株的發(fā)酵驗證

在250 mL搖瓶中，以菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB為發(fā)酵菌株，以20 g/L葡萄糖、1 g/L酵母粉為碳、氮源，在37 ℃、150 r/min條件下進行厭氧發(fā)酵，檢測發(fā)酵液的L-乳酸的產(chǎn)量。

1.2.4 外源添加黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）對菌株HBUT-LB轉(zhuǎn)化D-乳酸影響的發(fā)酵實驗

在50 mL搖瓶中，以菌株HBUT-LB為發(fā)酵菌株，以20 g/L葡萄糖、1 g/L D-乳酸為碳源，1 g/L酵母粉為氮源，另外添加15 mmol/L黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），在37 ℃、150 r/min條件下進行厭氧發(fā)酵，檢測發(fā)酵液中的D-乳酸含量。

1.2.5 不同末端電子受體對菌株HBUT-LB轉(zhuǎn)化D-乳酸影響的發(fā)酵實驗

在250 mL搖瓶中，以菌株HBUT-LB為發(fā)酵菌株，以20 g/L葡萄糖、1 g/L D-乳酸鈉為碳源，1 g/L酵母粉為氮源，另外分別添加20 mmol/L二甲基亞砜、富馬酸鈉、硝酸鈉作為末端電子受體進行厭氧發(fā)酵，檢測發(fā)酵液中的L-乳酸的產(chǎn)量和D-乳酸的含量。

1.2.6 硝酸鈉對菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB的影響

在250 mL搖瓶中，以菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB為發(fā)酵菌株，以20 g/L葡萄糖、1 g/L D-乳酸鈉為碳源，1 g/L酵母粉為氮源，通入過濾除菌后的CO2氣體5 min以除去發(fā)酵罐中的氧氣，保證厭氧環(huán)境，添加20 mmol/L的硝酸鈉，在37 ℃、150 r/min條件下進行厭氧發(fā)酵，并檢測發(fā)酵液中L-乳酸的產(chǎn)量和D-乳酸的含量。

1.2.7 最適硝酸鈉濃度的探究

在250 mL搖瓶中，以菌株HBUT-LB為發(fā)酵菌株，以20 g/L葡萄糖、1 g/L D-乳酸鈉為碳源，1 g/L酵母粉為氮源，在37 ℃、150 r/min條件下，加入不同濃度的硝酸鈉（0，10，20，30，40，50 mmol/L）進行厭氧發(fā)酵并檢測發(fā)酵液中OD600值、L-乳酸的產(chǎn)量和D-乳酸的含量。

1.2.8 菌株HBUT-LB利用廉價原料的發(fā)酵實驗

廉價原料的保存處置：取玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液，均在不同條件下（常溫潮濕處、低溫干燥處）放置6個月后，測定其中L-乳酸的產(chǎn)量和D-乳酸的含量。

在7 L發(fā)酵罐中，以菌株HBUT-LB為發(fā)酵菌株，以常溫潮濕條件下處理6個月后的10 g/L玉米漿和含100 g/L葡萄糖的葡萄糖結(jié)晶廢糖液為碳、氮源，通入過濾除菌后的CO2氣體5 min以除去發(fā)酵罐中的氧氣，保證厭氧環(huán)境，在37 ℃、150 r/min條件下，裝液量為4 L，中和劑為23% Ca（OH）2，添加20 mmol/L硝酸鈉，進行厭氧發(fā)酵并檢測發(fā)酵液中L-乳酸的產(chǎn)量和D-乳酸的含量。

1.2.9 分析與檢測

L-乳酸、D-乳酸［17］：采用液相色譜法檢測。檢測條件：Waters液相色譜儀；Sumichiral OA-5000L手性色譜柱；流動相：0.2 mmol/L H2SO4（溶劑：5% IPA）；PDA檢測器；波長250 nm；柱溫35 ℃；進樣量20 μL；流速0.5 mL/min。

硝酸鹽、亞硝酸鹽：檢測方法參考文獻［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因敲除的驗證

敲除lldD基因的電泳圖見圖1。

理論上泳道1出現(xiàn)條帶大小為526 bp，泳道2，3無條帶出現(xiàn)，泳道4出現(xiàn)條帶大小為849 bp。由圖1可知，理論與結(jié)果一致，表明lldD基因敲除成功。

敲除ykgEFG基因的電泳圖見圖2。

理論上泳道1出現(xiàn)條帶大小為2 917 bp，泳道2，3無條帶出現(xiàn)，泳道4出現(xiàn)條帶大小為588 bp。由圖2可知，理論與結(jié)果一致，表明ykgEFG基因敲除成功。

2.2 基因缺陷型菌株的發(fā)酵驗證

探究了lldD基因、ykgEFG基因?qū)-乳酸的產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB均在36 h達到最大的L-乳酸產(chǎn)量，分別為16.9，17.8，18.5 g/L。在L-乳酸產(chǎn)量方面，菌株HBUT-LB相比于菌株HBUT-LA提高了3.93%，相比于菌株HBUT-L提高了9.47%，菌株HBUT-LA相對于菌株HBUT-L提高了5.33%。發(fā)酵結(jié)果表明，敲除lldD基因、ykgEFG基因后能減少L-乳酸的消耗［19-20］。

2.3 外源添加黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）對菌株HBUT-LB轉(zhuǎn)化D-乳酸影響的發(fā)酵實驗

為了探究是否是D-乳酸脫氫酶（dld）的輔基FAD限制了D-乳酸的轉(zhuǎn)化效率，通過外源添加FAD，考察菌株轉(zhuǎn)化D-乳酸的效率是否與FAD有關，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當未添加FAD時，菌株僅消耗了0.21 g/L D-乳酸，L-乳酸的產(chǎn)量為18.4 g/L；當加入15 mmol/L FAD時，菌株基本能消耗完1 g/L D-乳酸，相對于未添加FAD提高了376%，L-乳酸的產(chǎn)量為19.1 g/L。結(jié)果表明，F(xiàn)AD限制了D-乳酸的轉(zhuǎn)化。

2.4 不同末端電子受體對菌株HBUT-LB轉(zhuǎn)化D-乳酸影響的發(fā)酵實驗

為了降低工業(yè)發(fā)酵的成本，通過加入末端電子受體以實現(xiàn)FAD的循環(huán)再生。大腸桿菌中常用的末端電子受體為氧氣、二甲基亞砜、富馬酸鈉、硝酸鈉。由于L-乳酸的發(fā)酵大多處于厭氧環(huán)境，因此不選擇以氧氣作為末端電子受體。將菌株HBUT-LB在各種末端電子受體下進行厭氧發(fā)酵，結(jié)果見表2。

由表2可知，當以富馬酸鈉為末端電子受體時，D-乳酸基本未被消耗，推測原因為菌株HBUT-LB已敲除富馬酸還原酶基因（frdBC），從而導致菌株無法以富馬酸鈉作為末端電子受體。當以二甲基亞砜與硝酸鈉作為末端電子受體時，菌株基本消耗完1 g/L D-乳酸。當以硝酸鈉作為末端電子受體時，L-乳酸的生產(chǎn)速率相比于以二甲基亞砜作為末端電子受體時提高了20.50%。因此，選用硝酸鈉作為末端電子受體。

2.5 硝酸鈉對菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB發(fā)酵的影響

通過搖瓶實驗探究了硝酸鈉對菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB轉(zhuǎn)化外源D-乳酸及生產(chǎn)L-乳酸的影響，結(jié)果見表3和圖5。

由表3和圖5可知，當未加入硝酸鈉時，菌株HBUT-L、HBUT-LA、HBUT-LB均未消耗完D-乳酸。當加入硝酸鈉時，3株菌株均在30 h時消耗完1 g/L D-乳酸，說明加入硝酸鈉能有效提高L-乳酸工程菌對D-乳酸的轉(zhuǎn)化。另外，在L-乳酸產(chǎn)量方面，出發(fā)菌株降低了16.48%，菌株HBUT-LA提升了2.21%，菌株HBUT-LB提升了2.70%。菌株HBUT-LA相對于出發(fā)菌株提升了25.85%，菌株HBUT-LB相對于出發(fā)菌株提升了29.25%，說明通過敲除lldD和ykgEFG基因可避免在有電子受體的情況下L-乳酸被轉(zhuǎn)化，從而保證其終產(chǎn)量。

2.6 最適硝酸鈉濃度的探究

通過梯度實驗對菌株HBUT-LB厭氧發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸時添加的硝酸鈉濃度進行優(yōu)化，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，添加不同濃度的硝酸鈉（10～50 mmol/L）均可有效消除1 g/L D-乳酸。最適的硝酸鈉濃度為20 mmol/L，此時菌株的最大OD600值、L-乳酸的生產(chǎn)速率分別為4.89， 0.633 g/（L·h），相比于未加入硝酸鈉時分別提高了5.39%、20.11%。隨著硝酸鈉濃度的增加，菌株的生長、L-乳酸的生產(chǎn)速率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，推測原因是硝酸鈉濃度高于6 mmol/L時轉(zhuǎn)化為亞硝酸鈉后，亞硝酸會逐漸積累，亞硝酸鈉濃度高于12 mmol/L后會抑制大腸桿菌的生長［21-23］。

2.7 菌株HBUT-LB利用廉價原料的發(fā)酵實驗

為了驗證工業(yè)生產(chǎn)中因?qū)Πl(fā)酵原料的保存條件不良而導致其中D-乳酸含量發(fā)生變化的情況，對玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液進行不同條件的保存處理，見表4。

由表4可知，常溫潮濕處保存相比于低溫干燥處保存，玉米漿中D-乳酸含量由0.908%提高到1.404%，L-乳酸含量由0.268%提高到4.264%，葡萄糖結(jié)晶廢糖液D-乳酸含量由0.148%提高到0.902%，L-乳酸含量由0.008%提高到0.144%，說明廉價發(fā)酵原料在保存時，常溫潮濕的環(huán)境相比于低溫干燥的環(huán)境更容易產(chǎn)生外源性的D-乳酸與L-乳酸，這可能是因為常溫潮濕的環(huán)境更有利于微生物生長，而這些微生物（如大腸桿菌等）可代謝生成D-乳酸與L-乳酸。

在7 L發(fā)酵罐中，使用菌株HBUT-LB，以保存在常溫潮濕環(huán)境中的玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液為碳、氮源進行發(fā)酵。

由圖7中A可知，0 h時培養(yǎng)基中含有0.9 g/L D-乳酸。未加入硝酸鈉時，菌株HBUT-LB在42 h內(nèi)僅能消耗0.23 g/L D-乳酸；加入硝酸鈉后，D-乳酸可在32 h內(nèi)被完全消耗，消耗速率為0.028 g/（L·h）。由圖7中B可知，未加入硝酸鈉時，菌株HBUT-LB在42 h時達到最大的L-乳酸產(chǎn)量98 g/L，生產(chǎn)速率為2.333 g/（L·h），光學純度為99.32%；當加入硝酸鈉時，菌株HBUT-LB在38 h時達到最大的L-乳酸產(chǎn)量98.8 g/L，生產(chǎn)速率為2.6 g/（L·h），光學純度為99.99%。說明通過添加硝酸鈉，工程菌HBUT-LB在發(fā)酵過程中可有效消除廉價原料中的外源D-乳酸，在保證L-乳酸最終產(chǎn)量的同時，將光學純度從99.32%提高至99.99%。與此同時，L-乳酸的生產(chǎn)周期縮短，產(chǎn)酸速率顯著提升11.44%。

由于大腸桿菌中存在硝酸還原酶與亞硝酸還原酶，因此，大腸桿菌具有代謝硝酸鹽與亞硝酸鹽的能力，在廉價原料發(fā)酵結(jié)束時在發(fā)酵液中經(jīng)測定后發(fā)現(xiàn)基本沒有硝酸鈉與亞硝酸鈉。

3 結(jié)論

本研究選取大腸桿菌L-乳酸工程菌株HBUT-L作為出發(fā)菌株，敲除了與L-乳酸利用相關的基因（lldD、ykgEFG），構建了菌株HBUT-LB。根據(jù)菌株HBUT-LB在不同末端電子受體中的生長參數(shù)，選擇的最佳末端電子受體為硝酸鈉。在廉價原料的發(fā)酵實驗中，使用在常溫潮濕處放置6個月的玉米漿和葡萄糖結(jié)晶廢糖液作為碳、氮源，并添加硝酸鈉。結(jié)果顯示，相較于未添加硝酸鈉，D-乳酸的消耗速率提高了460%，L-乳酸的生產(chǎn)速率提高了11.44%，L-乳酸的光學純度從99.32%提高至99.99%。在發(fā)酵結(jié)束時，通過對發(fā)酵液中的硝酸鈉與亞硝酸鈉進行測定發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌基本將硝酸鈉與亞硝酸鈉代謝完全。

為了清除發(fā)酵原料中存在的外源D-乳酸，本研究所用方法無需額外增加去除D-乳酸的處理步驟，而是在工程菌發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的同時將其去除，從而保證最終產(chǎn)物L-乳酸的超高光學純度。該方法不僅可以降低工業(yè)發(fā)酵成本，而且能提高發(fā)酵收益，具有重要的工業(yè)化應用潛力。

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