摘要：本研究利用多光譜成像技術對12個燕麥（Avena sativa）品種三年自然老化前后種子進行檢測，并對其形態(tài)和光譜兩種特征參數進行分析。結果顯示，不同品種及其自然老化種子形態(tài)和光譜特征參數存在差異?；谛螒B(tài)和光譜特征參數的k-means聚類分析將不同燕麥品種種子大致歸為兩大類群：自然老化前和自然老化后。此外，運用課題組此前開發(fā)的nCDA-CNN模型對種子老化和發(fā)芽率預測，發(fā)現(xiàn)多光譜圖像的預測準確度達到了100%。進一步分析發(fā)現(xiàn)，自然老化前后種子發(fā)芽率與顏色參數L、630 nm和690 nm波長光譜反射率具有顯著正相關性（Plt;0.05）；種子老化與四個形態(tài)參數（表面積、長度、形態(tài)參數B和飽和度）以及365 nm波長光譜反射率具有顯著正相關性（Plt;0.05）。以上研究結果表明，不同品種的燕麥種子在自然老化前后的外部形態(tài)及光譜特征上存在顯著差異（Plt;0.05），運用基于圖像的機器學習模型能夠準確鑒別種子老化和預測發(fā)芽率，對進一步研究老化種子的生理生化特征有一定的意義。

關鍵詞：多光譜成像；燕麥種子；無損檢測；自然老化種子；機器學習

中圖分類號：S544.9""" 文獻標識碼：A""""" 文章編號：1007-0435（2024）12-3688-10

收稿日期：2024-06-20；修回日期：2024-09-19

基金項目：“現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系”（CARS-34）；“國家重點研發(fā)計劃”（2022YFD1300804）；“四川省省院省校合作重點研發(fā)項目”（2023YFSY0012）資助

作者簡介：

劉俊澤（1999-），男，漢族，遼寧葫蘆島人，碩士研究生，主要從事育種與種子科學研究，E-mail：junze.liu@cau.edu.cn；*通信作者Author for correspondence，E-mail：shangang.jia@cau.edu.cn

Characteristics of Natural Ageing Phenotypes and Multispectral

Changes in Seeds of Different Oat Varieties

LIU Jun-ze1， HE Ying-cai3， MA Xiu-qin2， NI Hao-ran1， WANG Xue-meng1， WANG Qing1，

HE Xiao-fan1， NIE Jia-xin1， HU Hao1， MAO Pei-sheng1， JIA Shan-gang1*

（1.College of Grassland Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193， China; 2.Qilian County Animal

Husbandry and Veterinary Station， Haibei Tibetan Autonomous Prefecture， Qinghai Province 810499， China; 3.Qilian County

Grassland Station， Haibei Tibetan Autonomous Prefecture， Qinghai Province 810499， China）

Abstract：In this study，seeds of 12 oat （Avena sativa） varieties before and after three years of natural aging were examined using multispectral imaging and analyzed for both morphological and spectral characterization parameters. The results showed that different varieties and their naturally aged seeds showed differences in both morphological and spectral characterization parameters. Based on the k-means clustering analysis of morphological and spectral parameters，the different oat varieties were roughly categorized into two major groups：one of which was the pre-naturally aged seeds and the other was the naturally aged seeds. In addition，the previously developed nCDA-CNN model was utilized for seed aging and germination probability prediction based on the training and validation sets，and it was found that the prediction accuracies of the multispectral images all reached 100%. Further analysis showed that the seed germination rate before and after natural aging was significantly correlated with different morphological parameters and spectral reflectance at 630 nm and 690 nm wavelengths;seed aging was significantly correlated with the four morphological parameters （surface area，length，morphological parameter B and saturation） as well as with spectral reflectance at 365 nm. The above findings indicated that different oat varieties seeds and their aging before and after natural aging had external morphological and spectral variability，and that seed aging and germination probability could be accurately identified and predicted by using an image-based machine learning model.

Key words：Multispectral imaging;Oat seeds;Non-destructive testing;Natural aging seeds;Machine learning

燕麥（Avena sativa L.）是世界八大糧食農作物之一，歐洲、北美、亞洲均為燕麥的主要生產地［1］。我國主產區(qū)集中在內蒙的陰山南北、河北的壩上、山西的太行等地［2］。燕麥具有一定的食用價值，既可用于加工食品又可用作動物飼料，具有抗逆性強、適口性好、營養(yǎng)價值高等特點［3］。燕麥作為優(yōu)質草料，其青綠葉及秸稈均多汁柔嫩，適口性好，適宜于青飼和調制干草，是高寒牧區(qū)枯草季節(jié)的重要飼草料來源［4］。

近年來，多光譜成像（Multispectral imaging，MSI）技術已成為一種快速、無破壞性的檢測方法，這項技術將光譜技術和成像技術融為一體，越來越多地被用于各品種種子的無損檢測［5-7］。多光譜成像技術已被成功應用于快速檢測和識別25個不同品種的紫花苜蓿種子（Medicago sativa）［8］。種子老化是農業(yè)和植物科學領域中的一個重要問題，直接影響作物的生產力和種植效果。隨著時間的推移，種子在儲存和環(huán)境條件的影響下，會逐漸喪失其發(fā)芽能力和生長潛力，這一過程被稱為種子老化［9］。對老化種子進行快速準確預測對于優(yōu)化種子儲存條件、提高種子質量以及保障農業(yè)生產的穩(wěn)定性至關重要，從而推動農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

歸一化標準判別分析（nCDA）作為一種基于MSI的監(jiān)督變換方法，能有效地將圖像劃分為具有不同光譜特征的區(qū)域，進一步提升了物種及品種識別的準確性和解釋性，有利于后續(xù)的數據分析工作［10］。王雪萌等［11］利用nCDA預測老化種子發(fā)芽準確度達到了90%～99%，成功區(qū)分了老化種子并預測其發(fā)芽率。線性判別分析（LDA）是一種用于數據分類和降維的統(tǒng)計方法，通過找到一個線性組合的特征，使得不同類別的數據點在這個新空間中盡可能分開，從而提高分類效果［11］。何欣等［6］利用LDA模型對紫花苜蓿種子識別準確率達97.3%。本研究利用MSI將自然老化前后的12個燕麥品種進行對比，通過比較自然老化前后燕麥種子的形態(tài)參數、光譜參數，結合nCDA算法對不同品種種子的形態(tài)特征和光譜特征進行了分析，以利用MSI對比出自然老化前后燕麥品種種子的表型和多光譜特征差異，為燕麥品種識別和種子質量檢測應用提供一些思路。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

試驗使用了12個燕麥品種，分別為‘MAGNUM’‘貝勒’‘牧樂思’‘燕王’‘牧王’‘海威’‘領袖’‘美達’‘魅力’‘莫妮卡’‘槍手’和‘太陽神’。試驗用燕麥種子于2020年收獲，由中國農業(yè)大學牧草種子實驗室保存。

1.2" 多光譜數據采集

使用多光譜成像儀VideometerLab（Videometer A/S，Herlev，Denmark）分別在2020年和2023年進行種子圖像信息的采集［10］。在獲取種子的RGB圖像后，導出種子形態(tài)特征數據，包括面積、長度、寬度、長寬比、緊實度圓、形狀參數、顏色參數、飽和度等指標；然后在statistic模塊中導出種子的光譜特征數據，包括從種子圖像像素中計算的19個波長反射光的平均反射率［11］。

1.3" 發(fā)芽率測定與模型構建分析

各品種均采用紙上發(fā)芽，將種子以10×10擺放在發(fā)芽盒上，每個品種3次重復。參照《草種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗》GB/T 2930.4-2017進行操作，將培養(yǎng)箱溫度設置為恒溫20℃，模擬正常光照條件，發(fā)芽第10天測定發(fā)芽率。

種子發(fā)芽率=末次計數時全部正常發(fā)芽粒數供檢種子數×100%

1.4" 數據分析

利用VideometerLab中的MSI-Transformation Builder將不同年份的燕麥品種分別標記為紅色和藍色，以此作為標準，依次輸出12個燕麥品種的nCDA圖像。使用R語言中的factoextra包來進行k-means聚類分析。使用R語言中l(wèi)inkET包基于形態(tài)、光譜參數和發(fā)芽率數據，進行了曼特爾檢驗（即Mantel Test）。使用Origin2021來繪制形態(tài)參數和光譜參數的差異性圖片。使用IBM SPSS Statistics 26進行單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用最小顯著差異法。使用R語言中的heatmap函數來繪制特征參數相關性熱圖。利用種子的形態(tài)和光譜的綜合信息進行LDA、歸一化標準判別分析（nCDA）建模分析。LDA使用R語言中的MASS包進行分析預測，nCDA分析使用VideometerLab4軟件中的MSI-Transformation Builder。nCDA-CNN腳本來自GitHub網站（https：//github.com/CAUhx/nCDA-CNN）使用Python3.12運行，進行種子老化和發(fā)芽預測。

2" 結果與分析

2.1" 不同品種自然老化前后燕麥種子的形態(tài)參數、光譜參數、發(fā)芽率比較分析

利用自然老化前后不同品種的光譜特征參數繪制了12個品種種子折線圖（圖1a），利用多光譜形態(tài)特征參數繪制了12個品種種子柱狀圖（圖1c）。選取產生差異較大的2個形態(tài)參數，進行自然老化前后12個品種的比較。結果顯示，相同品種自然老化種子與未老化的種子相比較，自然老化種子長度、表面積的數值顯著增加（Plt;0.05，圖1c）。隨著波長的增加，光譜反射率呈上升趨勢（圖1a），其中品種‘牧王’690 nm波長下的自然老化種子的光譜反射率與未老化種子相比差異較大（圖1b）。由不同燕麥品種自然老化前后的發(fā)芽率統(tǒng)計可以看出，與自然老化前種子相比，各品種自然老化后的燕麥種子發(fā)芽率明顯降低，其中‘牧王’品種種子自然老化前后的發(fā)芽率降低最多；同時，不同品種燕麥的發(fā)芽性能也存在一定差異，比如‘魅力’和‘MAGNUM’可達100%，而‘牧王’為66%（圖1d）。

2.2" 自然老化前后不同品種燕麥種子的特征參數聚類分析

利用形態(tài)特征參數進行聚類分析，結果顯示自然老化前后的種子被歸為兩類，一類是自然老化前的12個品種種子，另一類是自然老化后12個品種的種子（圖2a）。利用光譜特征參數進行聚類分析，結果顯示自然老化后的10個品種被歸為一類，自然老化前的12個品種和自然老化后的2個品種（2023年份的‘莫妮卡’‘美達’）被歸為一類（圖2b）。

2.3" 自然老化前后燕麥種子形態(tài)、光譜參數的線性判別分析

利用LDA模型分析自然老化前后的形態(tài)參數，LDA可視化可以呈現(xiàn)出自然老化前后12個品種的燕麥種子的差異，自然老化前后，LD1分別解釋了41.56%，48%的方差解釋。自然老化前各品種聚在一個分支（圖3a），自然老化后對于各品種區(qū)分也并不明顯（圖3b）。同時，利用LDA模型分析自然老化前后的光譜參數，LDA可視化顯示，自然老化前后，LD1分別解釋了74.95%，66.97%。自然老化前LD1能夠將‘牧樂思’‘莫妮卡’與其他品種的種子分開，也能夠將部分兩個品種分開，比如‘美達’與‘貝勒’（圖3c），而自然老化后LD1能夠將部分兩個品種區(qū)分開，但也有部分聚攏在一支的品種無法被分開（圖3 d）。這說明通過LDA模型利用種子的光譜參數要比利用種子形態(tài)參數的區(qū)分效果更好。

2.4" 特征參數相關性分析

對自然老化前的種子發(fā)芽率和形態(tài)、光譜特征參數分別進行相關性分析，繪制出參數相關性的熱圖（圖4）。自然老化前種子的發(fā)芽率與緊實度圓、長度、寬度、表面積、顏色參數a、顏色參數b以及長寬比有一定的負相關關系，而與其余形態(tài)特征參數則有一定的正相關關系（圖4a）。自然老化后種子的發(fā)芽率與長度、表面積呈現(xiàn)負相關關系，與其他形態(tài)特征參數呈現(xiàn)正相關關系，但相關性較弱（圖4b）。另外，各個形態(tài)參數之間存在一定的相關性，在熱圖中大致分為三個區(qū)域。種子自然老化前發(fā)芽率與780，970，940，880，850 nm波長下的光譜反射率呈現(xiàn)負相關關系，與其他波長下的光譜反射率的相關性較弱（圖4c）。種子自然老化后的發(fā)芽率與365 nm波長下的光譜反射率呈現(xiàn)一定的負相關關系，而與其他波長下的光譜反射率呈現(xiàn)正相關關系，同時，各波長下的光譜反射率之間存在一定相關性，大致被分為兩個區(qū)域（圖4d）。

對自然老化前后種子的形態(tài)光譜參數和發(fā)芽率進行了曼特爾檢驗分析。結果發(fā)現(xiàn)，自然老化前種子的發(fā)芽率與顏色參數L、顏色參數B、飽和度之間呈顯著正相關。此外，長度與表面積、緊實度圓與長寬比、飽和度與顏色參數B之間呈顯著正相關，R值分別為0.84，0.87，0.95（圖5a）。自然老化后種子的發(fā)芽率與表面積、長度、長寬比、顏色參數L呈顯著正相關，同時可以看出長度與表面積、緊實度圓與長寬比、飽和度和顏色參數B呈現(xiàn)顯著正相關，R值分別為0.74，0.95，0.97（圖5b）。自然老化前種子的發(fā)芽率與430 nm，450 nm，470 nm，490 nm，515 nm，540 nm，570 nm，590 nm，630 nm，645 nm，660 nm，690 nm波長下的光譜反射率呈顯著正相關，與630 nm，690 nm波長下的光譜反射率相關性更強，與其他波段下的光譜反射率無較多的相關顯著性（圖5c）。自然老化后種子的發(fā)芽率與365 nm，405 nm波長的光譜反射率沒有較多相關顯著性，與剩余其他波段下的光譜反射率呈顯著正相關（圖5 d）。同時又對種子是否老化與種子的形態(tài)光譜參數進行了皮爾遜相關分析，結果表明，不論是老化種子還是未老化種子都和種子的形態(tài)光譜參數呈現(xiàn)顯著正相關的關系，其中我們發(fā)現(xiàn)老化種子和未老化種子均分別對表面積、長度、形態(tài)參數B、飽和度具有較強的相關性（圖5e），老化種子和未老化種子也分別對365 nm波段下的光譜反射率具有較強的相關性（圖5f），于是選取形態(tài)參數飽和度和365 nm波段下的光譜參數繪制老化前后的柱狀圖，呈現(xiàn)出飽和度較高的為老化種子，飽和度相對較低的為未老化種子，老化種子在365 nm波段下的光譜反射率高，而未老化種子的光譜反射率會相對較低一些（圖5g）。

2.5" 利用種子自然老化前后的表型圖像、發(fā)芽結果與CNN-nCDA模型進行快速識別

比較自然老化前后各品種的燕麥種子發(fā)芽結果，我們發(fā)現(xiàn)自然老化后各品種燕麥種子的發(fā)芽率均低于自然老化前各品種燕麥種子的發(fā)芽率，其中品種‘MAGNUM’‘牧樂思’‘燕王’‘牧王’‘海威’‘領袖’‘魅力’‘槍手’‘太陽神’自然老化后的發(fā)芽率顯著低于自然老化前（Plt;0.05，圖1d）。利用Videometer中涂層工具將試驗中已知的發(fā)芽種子和不發(fā)芽種子分別標為藍色和紅色，標準樣品種子的多光譜經nCDA算法轉換后，種子轉換后呈不同顏色，并導出單個種子的nCDA圖像。利用CNN-nCDA模型將nCDA轉換的單個種子圖像進行識別，發(fā)現(xiàn)CNN-nCDA模型對發(fā)芽種子和未發(fā)芽種子識別和鑒定率達100%（圖6a）。同時，我們也將試驗中已知的老化種子和未老化種子分別標為藍色和紅色，標準樣品種子的多光譜經nCDA算法轉換后，種子轉換后呈不同顏色，并導出單個種子的nCDA圖像。利用CNN-nCDA模型將nCDA轉換的單個種子圖像進行識別，發(fā)現(xiàn)CNN-nCDA模型對老化種子和未老化種子識別和鑒定率也達100%（圖6b）。

3" 討論

種子在貯藏過程中，可能會吸收空氣中的水分，從而使種子吸水膨脹變大，導致種子體積擴大和顏色變深［13］。這可能是自然老化后種子的表面積、長度都高于自然老化前種子的原因［14］。在本研究中，自然老化后的種子對比自然老化前的種子有顯著（Plt;0.05）的形態(tài)差別。在光譜特征方面，大部分自然老化后的燕麥種子在690 nm的光譜反射率低于自然老化前燕麥種子，這有可能是由于貯藏期間種皮顏色發(fā)生改變導致的［7］。同時研究結果顯示，所有測試的燕麥品種在經過一定時間的自然老化處理后，其發(fā)芽率普遍下降，尤其是在‘MAGNUM’，‘牧樂思’‘燕王’等品種中更為顯著（Plt;0.05）。這一結果表明，自然老化過程嚴重影響了種子的活力和發(fā)芽能力［15］，‘牧王’品種可能對環(huán)境變化更為敏感或者自然老化機制更為復雜。同時，不同品種間發(fā)芽性能的差異可能與各自的遺傳特性和種子構造有關，自然老化過程會改變種子的形態(tài)特征和化學成分［15］。研究表明，種子自然老化過程會產生丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、脂肪酸和可溶性糖和積累有毒有害物質［11］。

雖然基于光譜特征參數的聚類結果沒有將其完全區(qū)分開，但是它們在形態(tài)聚類中能夠區(qū)分。這說明，結合形態(tài)參數和光譜參數，可以將自然老化前后的種子區(qū)分開?；谛螒B(tài)特征的聚類分析顯示，自然老化前的種子被歸為一類，自然老化后的種子被歸為一類說明自然老化前后各品種種子在形態(tài)特征上產生顯著差異（Plt;0.05）。然而，基于光譜特征參數的聚類分析未能完全區(qū)分所有自然老化和未自然老化的種子，表明光譜數據可能受到種子內部化學成分變化較小或測量誤差的影響［16］。這個結果從一定程度上說明了利用MSI對于特征差別較大的品種的區(qū)分比較準確。因此，以上結果表明利用MSI來對自然老化前后種子進行鑒別具有一定的效果。LDA結果進一步揭示了形態(tài)特征和光譜特征在區(qū)分自然老化前后種子中的有效性［17］。在形態(tài)特征的LDA可視化中，自然老化前的種子表現(xiàn)出較高的聚集性，在形態(tài)參數方面，自然老化前各品種的種子聚在一個分支，而老化后品種之間的區(qū)分并不明顯。這可能說明形態(tài)參數受到自然老化影響較大，老化過程中種子的形態(tài)特征發(fā)生了變化，使得不同品種之間的區(qū)別變得不明顯［6］。相反，在光譜參數方面，自然老化前后LD1都能有效地區(qū)分部分品種，如‘牧樂思’和‘莫妮卡’，表明光譜參數在自然老化過程中具有較強的穩(wěn)定性和區(qū)分能力［18-20］。

自然老化前種子的發(fā)芽率與多個形態(tài)參數表現(xiàn)出顯著的相關性（Plt;0.05）［21-22］，形態(tài)特征的變化反映了種子的生理和結構狀態(tài)對其發(fā)芽潛力的潛在影響。例如，發(fā)芽率與緊實度圓、長度、寬度、表面積顯示出負相關，說明種子尺寸的增大可能與生理老化過程中的資源積累和細胞結構緊湊性減少有一定的關系［23-25］。光譜分析結果顯示，老化前種子的發(fā)芽率與780 nm，970 nm波長下的光譜反射率呈現(xiàn)負相關，可能表明這些波長下的光譜反射率能反映出種子表面或內部的某些化學成分變化，較高的反射率可能與種子表面的脂肪酸氧化有關，而這種氧化可能影響種子的活性和發(fā)芽潛力［9］。老化后種子的發(fā)芽率與365 nm波長下的光譜反射率表現(xiàn)出負相關，可能與紫外光引起的化學結構損傷有關［26］。

利用形態(tài)與光譜特征之間的交叉分析進一步強調種子質量評估中多參數分析的重要性。自然老化前種子的發(fā)芽率與顏色參數L、顏色參數B、飽和度之間存在顯著正相關（Plt;0.05），表明這些參數可能與種子的活性和質量密切相關。在不同波長下，光譜反射率與發(fā)芽率的相關性不同。自然老化前，特定波長（如430 nm～690 nm）下的光譜反射率與發(fā)芽率呈顯著正相關，特別是在630 nm和690 nm波長下，這可能說明這些波長下的光譜反射率與種子內部生化成分或結構的變化緊密相關［8］。相比之下，老化后種子在365 nm和405 nm波長下的光譜反射率與發(fā)芽率相關性不顯著，可能因為這些波長更受老化過程中生化變化的影響［8］。種子是否經過自然老化，其形態(tài)和光譜參數顯示出顯著的正相關性，說明無論種子是否經過老化，其外觀形態(tài)和光譜特性都是評估其生理狀態(tài)的重要指標。特別是在365 nm波段下，光譜反射率與種子是否經歷老化的關系更為密切，可能反映了老化過程中某些特定生化物質的積累或減少［12］。通過將形態(tài)參數飽和度和365 nm波段下的光譜參數繪制成柱狀圖，可以直觀地展示老化種子與未老化種子在這些參數上的差異。飽和度較高和光譜反射率較高的種子往往是老化種子，這可能與老化過程中生物質組成的改變有關［27-31］。

利用Videometer的MSI和nCDA算法成功地將老化種子和未老化種子、發(fā)芽種子和未發(fā)芽種子在視覺上進行區(qū)分，并通過顏色編碼（藍色代表發(fā)芽與老化，紅色代表未發(fā)芽與未老化）直觀地顯示這些差異。這種方法不僅提高了樣品分析的效率，也為種子質量檢測提供了一種快速、非破壞性的技術手段。

4" 結論

本研究利用多光譜成像技術，結合形態(tài)和光譜特征參數，發(fā)現(xiàn)自然老化前后燕麥品種種子的表型和多光譜特征差異，也成功預測出燕麥老化種子是否發(fā)芽。此外，種子是否老化與部分形態(tài)光譜特征參數存在一定的相關性，未來的研究可以探討不同環(huán)境條件下種子的自然老化過程，以及這些條件如何影響種子的形態(tài)和光譜特征。同時，研究不同種子處理技術（如種子涂層、溫度和濕度控制）對種子的自然老化和存儲性能的影響具有重要的應用潛力和科學價值。

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（責任編輯" 付" 宸）