摘要：以紅象草（Pennisetum purpureum Schumab）為原材料，花青素含量為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、液料比和提取時(shí)間3個(gè)因素作為自變量，基于Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定紅象草花青素的最佳提取工藝，并測(cè)定其抗氧化能力。結(jié)果表明：紅象草花青素的最佳提取工藝條件為乙醇濃度49%，提取時(shí)間30 min，液料比49∶1，在此條件下提取得到的花青素含量為2.09 mg·g-1，相對(duì)于理論值誤差為1.8%。紅象草花青素對(duì)羥自由基、DPPH自由基的清除率最高分別為121.3%和97.5%，對(duì)ABTS+自由基的總抗氧化能力最高可達(dá)2.6 mmol·g-1，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。本研究可為紅象草花青素的提取及其加工利用提供可靠的理論依據(jù)和重要的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：紅象草；花青素；工藝優(yōu)化；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：S543""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A""""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）12-3988-09

收稿日期：2024-04-15；修回日期：2024-06-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32302791）；福建省人民政府中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展超越“5511”協(xié)同創(chuàng)新工程項(xiàng)目（XTCXGC2021012，XTCXGC2021019）資助

作者簡介：

#林平冬（1990-），女，漢族，福建莆田人，博士，助理研究員，主要從事植物有效成分提取及其生物活性研究，E-mail：lpd7911@163.com；#高龍（1997-），男，漢族，新疆伊犁人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究，E-mail：1194746853@qq.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：010622051@163.com

Optimization of Anthocyanins Extraction Process of Red Elephant

Grass and Study on its Antioxidant Activity

LIN Ping-dong1#， GAO Long1，2#， CHEN Xin-zhu1*

（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine/Fujian Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding， Fujian

Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian Province 350013， China; 2. College of Animal Sciences （College of Bee

Science）， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian Province 350002， China）

Abstract：Using red elephant grass （Pennisetum purpureum Schumab） as the raw material and anthocyanin content as the response value. Based on a single factor test，three independent variables including ethanol concentration，liquid-material ratio，and extraction time were selected to design a response surface optimization experiment with three factors and three levels using Box-Behnken methodology to optimize the extraction process of anthocyanins from red elephant grass and assess its antioxidant capacity. The results indicated that the optimal conditions for anthocyanin extraction from red elephant grass were a 49% ethanol concentration，an extraction time of 30 minutes，and a liquid-solid ratio of 49∶1. Under these conditions，the extracted anthocyanin content was 2.09 mg·g-1，with only a slight deviation of 1.8% from the theoretical value. The maximum scavenging rates of anthocyanins from red elephant grass on hydroxyl radical and DPPH radical were found to be 121.3% and 97.5%，respectively. While the maximum total antioxidant capacity against ABTS+radical reached up to 2.6 mmol·g-1，demonstrating significant antioxidant activity. This study can offer a reliable theoretical foundation and important technical support for the extraction and processing of anthocyanins from red elephant grass.

Key words：Pennisetum purpureum Schumab;Anthocyanin;Process optimization;Antioxidant activity

紅象草（Pennisetum purpureum Schumab）為多年生禾本科狼尾草屬（Pennisetum），莖葉為紫紅色，所以又叫紫狼尾草、紫象草。紅象草易栽培、產(chǎn)量高，且營養(yǎng)豐富、適口性好，可直接飼喂，也可調(diào)制成干草或制作青貯飼料，是適合食草畜禽的優(yōu)質(zhì)牧草品種［1-4］。花青素是廣泛存在于所有深紅色、紫色或藍(lán)色植物中的一種水溶性黃酮類色素，是賦予植物顏色的主要物質(zhì)之一。紅象草莖葉中因含有大量花青素而呈現(xiàn)紫紅色。除了著色作用，花青素還具有廣泛的生物學(xué)活性，包括抗炎和抗氧化特性［5-7］。目前，花青素的提取方法主要是有機(jī)溶劑萃取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、超臨界二氧化碳萃取法和酶分解提取法等，其中以超聲波、微波輔助提取應(yīng)用最為廣泛［8］。黃凌輝等［9-10］在水浴提取的基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)、優(yōu)化提取裝置來達(dá)到提高花青素提取率的目的。焦文靜等［11］對(duì)超聲提取紅象草花青素的工藝進(jìn)行優(yōu)化，提取得到的花青素含量為1.96 mg·g-1。劉賽格等［12］采用95%酸性丙酮，在料液比1∶110、提取溫度55℃、提取時(shí)間60 min的條件下，從紫象草中提取得到含量為5.06 mg·g-1的低聚體原花青素B2，并測(cè)得該花青素對(duì)羥自由基有較好的清除能力。目前對(duì)紅象草花青素提取工藝及其生物學(xué)功能的研究仍較少，紅象草花青素的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用尚缺乏更多科學(xué)的理論與技術(shù)參考。本研究采用超聲波輔助法提取紅象草花青素，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，篩選紅象草花青素的最佳提取工藝條件，建立合理的提取方案，以期為從紅象草中提取花青素提供重要的技術(shù)支持；通過測(cè)定紅象草花青素對(duì)羥自由基、DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，可為象草資源開發(fā)和拓展利用提供詳實(shí)的理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 材料與試劑

紅象草（2～2.5 m高度采集葉片）：由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)種植基地提供。

乙醇、甲醇、甲酸、鹽酸、乙酸、氯化鉀、醋酸鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；矢車菊色素標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫溶液（H2O2，3%）：上海澤葉生物科技有限公司；水楊酸（分析純）：上海麥克林生化科技股份有限公司；硫酸亞鐵（90%）：上海麥克林生化科技股份有限公司；L-抗壞血酸（VC，99.99%）：上海麥克林生化科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）：上海澤葉生物科技有限公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS法）：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2" 儀器與設(shè)備

Master-E UV超純水機(jī)：上海和泰儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用有限公司；LYOQUEST-55實(shí)驗(yàn)室凍干機(jī)：阿自倍爾泰事達(dá)機(jī)電設(shè)備（上海）有限公司；060ST超聲波清洗機(jī)：廣州鋰閣科技有限公司；GM-0.33Ⅱ隔膜真空泵：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；EClassical 3200高效液相色譜儀：大連依利特分析儀器有限公司；SynergyH1 M多功能酶標(biāo)儀：美國Biotek。

1.3" 紅象草花青素提取方法

采用超聲波輔助提取法：準(zhǔn)確稱取1.000 g紅象草凍干粉，加入50 mL 50%的酸性乙醇溶液（1%鹽酸酸化處理，pH=2），于超聲功率480 W，溫度50℃的條件下提取30 min，過濾，離心，取上清液減壓濃縮，用酸性乙醇定容至50 mL，即得紅象草花青素提取液。重復(fù)3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

1.4" 花青素含量測(cè)定方法

取1 mL紅象草花青素提取液于5 mL容量瓶中，分別用pH值1.0的氯化鉀緩沖溶液和pH值 4.5的乙酸鈉緩沖溶液定容。以蒸餾水為空白，采用紫外分光光度計(jì)分別在波長530 nm和700 nm處測(cè)定溶液的吸光度，按照Fuleki公式計(jì)算花青素含量［13］。

花青素含量（mg·g-1）=［（A530-A700）pH1.0-（A530-A700）pH4.5］×M×D×V×1000ε×L×m

其中，A530為待測(cè)溶液在530 nm處的吸光度；A700為待測(cè)溶液在700 nm處的吸光度；M為矢車菊素3-O-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2 g·mol-1；D為稀釋因子，20；V為提取液體積，mL；ε為摩爾消光系數(shù)，26 900 L·（mol·cm）-1；L為光程，1 cm；m為樣品質(zhì)量，g。

1.5" 紅象草花青素提取單因素試驗(yàn)

固定乙醇濃度（50%）、提取溫度（50℃）、液料比（50∶1）、提取時(shí)間（30 min），考察超聲功率（250，360，480 W）對(duì)花青素提取量的影響；固定超聲功率（480 W）、提取溫度（50℃）、液料比（50∶1）、提取時(shí)間（30 min），考察乙醇濃度（40%，50%，60%，70%，80%）對(duì)花青素提取量的影響；固定超聲功率（480 W）、乙醇濃度（50%）、提取溫度（50℃）、提取時(shí)間（30 min），考察液料比（20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1）對(duì)花青素提取量的影響；固定超聲功率（480 W）、乙醇濃度（50%）、提取溫度（50℃）、液料比（50∶1），考察提取時(shí)間（10，20，30，40，50 min）對(duì)花青素提取量的影響。

1.6" 響應(yīng)面法優(yōu)化紅象草花青素提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，以紅象草花青素提取量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken（BBD）進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

1.7" 紅象草花青素提取結(jié)果驗(yàn)證

采用優(yōu)化后的最佳提取工藝條件提取紅象草花青素，并按1.4項(xiàng)下方法測(cè)定花青素含量，通過HPLC對(duì)在該條件下提取得到的紅象草花青素進(jìn)行定性和定量分析。

色譜條件：Agilent ZORBAXSB-C18柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）。流動(dòng)相A為1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為1%甲酸乙腈溶液。洗脫程序：0 min，A/B=92/8（v/v）；5 min，A/B=82/18（v/v）；15 min，A/B=70/30（v/v）；30 min，A/B=20/80（v/v）；50 min，A/B=92/8（v/v）。流速為0.8 mL·min-1；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)波長為530 nm。

1.8" 體外抗氧化試驗(yàn)

1.8.1" 紅象草花青素對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定" 分別吸取不同濃度的樣品（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg·mL-1）各200 μL于刻度試管中，依次加入6.0 mmol·L-1的硫酸亞鐵溶液和6.0 mmol·L-1的過氧化氫溶液各200 μL，搖勻后靜置10 min；再加入 6.0 mmol·L-1的水楊酸-乙醇溶液200 μL，加入蒸餾水定容至1 mL，37℃水浴15 min后于酶標(biāo)儀510 nm處測(cè)定吸光度Ai；用蒸餾水代替水楊酸-乙醇溶液和過氧化氫溶液，同法測(cè)定吸光度Aj作為對(duì)照組；用蒸餾水代替樣品，同法測(cè)定吸光度A0作為空白組；用不同濃度的VC溶液作為陽性對(duì)照。樣品對(duì)羥自由基的清除率計(jì)算公式：

羥自由基清除率=［1-（Ai-Aj）/A0］×100%。

1.8.2" 紅象草花青素對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定" 分別吸取不同濃度的樣品（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg·mL-1）各300 μL于試管中，加入2.0 mmol·L-1的DPPH-乙醇溶液300 μL，暗處放置20 min后于酶標(biāo)儀517 nm處測(cè)定吸光度A樣；用無水乙醇代替DPPH，同法測(cè)定吸光度A對(duì)作為對(duì)照組；用水代替樣品，同法測(cè)定吸光度A空作為空白組；用不同濃度的VC溶液作為陽性對(duì)照。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率計(jì)算公式：DPPH自由基清除率

［1-（A樣-A空/A空］×100%

1.8.3" 紅象草花青素對(duì)ABTS+自由基總抗氧化能力的測(cè)定" 使用等體積ABTS溶液和氧化劑溶液配制ABTS工作母液，室溫避光存放12～16 h待用。根據(jù)待測(cè)定樣品的數(shù)量（含標(biāo)準(zhǔn)曲線），用80%乙醇將ABTS工作母液稀釋35～55倍（A734為（0.70±0.05），對(duì)應(yīng)的A405在1.40左右）。用樣品配制溶液把10 mmol·L-1 Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.15，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 mmol·L-1。在96孔板的每個(gè)孔中加入200 μL ABTS工作液，空白對(duì)照孔內(nèi)加入10 μL蒸餾水或PBS等適當(dāng)溶液；標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL各濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL各濃度樣品，輕輕混勻；室溫孵育2～6 min后測(cè)定A734。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力，結(jié)果以Trolox等效抗氧化能力（TEAC）來表示，單位為mmol·g-1

1.9" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)為3次平行試驗(yàn)的平均值，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用Design-Expert 10.0.4軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果分析，采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 9軟件繪圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1" 超聲功率對(duì)紅象草花青素提取量的影響" 由表2可知，提取液中的花青素含量隨超聲功率的增大而增加，但增加幅度無明顯差異，說明超聲功率可能不是紅象草花青素提取的顯著影響因素，故選擇花青素含量相對(duì)最高對(duì)應(yīng)的超聲功率480 W作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中的提取條件之一。

2.1.2" 乙醇濃度對(duì)紅象草花青素提取量的影響" 由表3可知，一定范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增大，提取液中的花青素含量隨之先增高后降低，其中乙醇濃度為50%時(shí)的花青素含量最高，且與其他組相比差異顯著（P＜0.05）；乙醇濃度為40%和60%時(shí)的花青素含量無明顯差異，但均顯著高于乙醇濃度為70%和80%的。故選擇40%，50%，60%作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中的乙醇濃度考察水平。

2.1.3" 液料比對(duì)紅象草花青素提取量的影響" 由表4可知，液料比越大，提取液中的花青素含量越高，并在液料比為50∶1時(shí)達(dá)到峰值，繼續(xù)增大液料比，花青素含量有所下降。根據(jù)組間差異性，選擇40∶1，50∶1，60∶1作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中的液料比考察水平。

2.1.4" 提取時(shí)間對(duì)紅象草花青素提取量的影響" 由表5可知，提取時(shí)間越長，提取液中的花青素含量越高，提取時(shí)間為20，30，40 min時(shí)的花青素含量均明顯高于10 min的（P＜0.05）；提取時(shí)間為50 min時(shí)，花青素含量較20～40 min時(shí)明顯降低（P＜0.05）。因此選擇20，30，40 min作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中提取時(shí)間的考察水平。

2.2" 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1" 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果" 以花青素含量為響應(yīng)值，通過Design-Expert10.0.4軟件對(duì)待考察的3因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，具體試驗(yàn)結(jié)果見表6。對(duì)表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，建立回歸模型，得到二次多項(xiàng)回歸方程：花青素含量Y=2.130-0.043A-0.019B-4.596C-0.130AB-0.090AC-0.013BC-0.240A2-0.078B2-0.060C2。

2.2.2" 回歸模型方差分析" 由表7可知，回歸模型的P值小于0.0001，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著，變異系數(shù)為1.02%（lt;10%），說明非試驗(yàn)因素對(duì)結(jié)果影響不大，回歸模型具有較好的試驗(yàn)穩(wěn)定性。模型線性相關(guān)系數(shù)R2為99.32%，與校正決定系數(shù)Adj-R2的98.45%接近，說明該方程擬合度較好，有充分的準(zhǔn)確性和通用性，能充分體現(xiàn)乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)花青素提取量的影響。從該表可以看出，一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AB、AC和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)花青素提取量的影響極顯著，交互項(xiàng)BC和一次項(xiàng)C的影響不顯著。再通過參照F值大小也可得出這3個(gè)因素對(duì)花青素提取量的影響程度大小順序?yàn)椋篈（乙醇濃度）gt; B（液料比）gt; C（提取時(shí)間）。

2.2.3" 響應(yīng)面中各因素交互作用分析" 根據(jù)回歸模型所作的各因素兩兩交互作用的等高線圖與曲面圖如圖1所示。

當(dāng)提取時(shí)間不變時(shí)：從圖1（a）可以看出，乙醇濃度與料液比的等高線圖呈橢圓狀，說明這兩項(xiàng)因素之間的交互影響較強(qiáng)；結(jié)合圖1（b）三維曲面的傾斜度可知，乙醇濃度對(duì)花青素提取量的影響大于料液比。隨著乙醇濃度的增大，花青素含量呈先升高后降低的趨勢(shì)；在乙醇濃度較低的情況下，隨著液料比的增大，提取得到的花青素含量逐漸增高；當(dāng)乙醇濃度在較高水平時(shí)，提取得到的花青素含量隨著液料比的增大而降低。

當(dāng)液料比不變時(shí)，從圖1（c）可以看出，乙醇濃度與提取時(shí)間的等高線圖也呈橢圓狀，即這兩項(xiàng)因素之間也有較強(qiáng)的交互影響；結(jié)合圖1（d）三維曲面的傾斜度可知，乙醇濃度對(duì)花青素提取量的影響大于提取時(shí)間。隨著乙醇濃度的增大，花青素含量呈先升高后降低的趨勢(shì)；低乙醇濃度下，提取時(shí)間越長，花青素含量越高；高乙醇濃度下，提取時(shí)間越長，花青素含量越低。

當(dāng)乙醇濃度不變時(shí)，從圖1（e）可以看出，液料比與提取時(shí)間的等高線圖近圓形，說明這兩項(xiàng)因素之間的交互影響較弱；從圖1（f）可以看出，提取得到的花青素含量存在極大點(diǎn)，當(dāng)提取時(shí)間從20 min增加至30 min時(shí)，花青素含量提高，當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，花青素含量下降，該極點(diǎn)出現(xiàn)在提取時(shí)間為30 min條件下。

2.3" 最佳提取工藝確定及提取結(jié)果驗(yàn)證

經(jīng)軟件分析優(yōu)化，可得紅象草花青素的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度為49.19%，液料比為49.39∶1，提取時(shí)間30.29 min，花青素含量理論值為2.13 mg·g-1?？紤]到實(shí)際操作方便，將提取條件調(diào)整為乙醇濃度49%，提取時(shí)間為30 min，液料比49∶1。在此條件下提取得到的提取物經(jīng)HPLC分析確定為花青素（如圖2所示），并測(cè)得花青素含量為2.09 mg·g-1，誤差值為1.8%。

2.4" 紅象草花青素的抗氧化能力分析

如圖3A所示，隨著濃度的增高，紅象草花青素對(duì)羥自由基的清除率逐漸增大，在濃度0.2～1.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，紅象草花青素對(duì)羥自由基的清除率最高可達(dá)121.3%，且高于同等濃度下的VC對(duì)羥自由基的清除率。如圖3B所示，在濃度0.2～0.4 mg·mL-1內(nèi)，紅象草花青素對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的增高而增大，之后花青素濃度繼續(xù)增大，DPPH清除率保持在90%以上，均高于同等濃度下的VC對(duì)DPPH自由基的清除率。如圖3C所示，在濃度0.2～1.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，紅象草花青素對(duì)ABTS+自由基的總抗氧化能力隨花青素濃度的增高呈先升后降的趨勢(shì)，并與VC相當(dāng)，當(dāng)花青素濃度為0.4 mg·mL-1時(shí)，總抗氧化能力最高，為2.6 mmol·g-1。

3" 討論

花青素作為植物中廣泛存在的且具有著色、抗氧化作用的生物活性物質(zhì)，具有較高的研究與應(yīng)用價(jià)值。目前對(duì)于紅象草的研究主要集中于其作為草食動(dòng)物飼料的營養(yǎng)價(jià)值或青貯方面［14-15］，而關(guān)于紅象草所含花青素的研究極少，研究紅象草花青素提取有利于象草資源的深入挖掘和拓展利用。

植物中的花青素通常以糖基化和?；纬苫ㄉ盏男问酱嬖?，自然游離條件下分子穩(wěn)定性較差，易受pH值、溫度、光照、金屬離子等環(huán)境因素的影響而發(fā)生降解、褪色甚至喪失生理活性等變化［16-18］。為保持花青素的穩(wěn)定性，其提取或加工環(huán)境一般要求pH值保持酸性且溫度不超過50℃［19］。超聲波輔助提取是一種利用超聲的空化效應(yīng)加速植物成分溶出進(jìn)入提取溶劑的提取技術(shù)，具有提取時(shí)間短、溫度低、效率高等特點(diǎn)，適用于熱不穩(wěn)定活性物質(zhì)的提?。?0-22］。因此本研究以酸化乙醇為提取溶劑，采用超聲波輔助法從紅象草中提取花青素。

本研究中，紅象草花青素提取含量主要與超聲功率、乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間等因素有關(guān)。單因素試驗(yàn)考察結(jié)果表明，花青素提取含量作為響應(yīng)值受乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間的影響較為明顯，因素水平越高，響應(yīng)值越大。但響應(yīng)值與影響因素兩者之間并非完全的線性關(guān)系，各因素達(dá)到一定水平后，花青素含量不再增高或反而降低。如在張瀟等［23］研究紫甘藍(lán)（Brassica oleracea L.）花青素的提取工藝中，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間等參數(shù)均存在一個(gè)使花青素提取量達(dá)到峰值的因素水平，本研究試驗(yàn)結(jié)果也呈現(xiàn)該趨勢(shì)。原因可能如下：過高濃度的乙醇溶液會(huì)促使紅象草中其他醇溶性雜質(zhì)和親脂性強(qiáng)的成分溶出，使得花青素含量降低；而隨著液料比的增加，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓升高，使花青素充分向周圍溶劑釋放，但當(dāng)液料比繼續(xù)增大，被提取成分溶出達(dá)到飽和，醇溶性雜質(zhì)溶出增多，質(zhì)量傳遞速度變慢，溶劑粘度增大，超聲空化效應(yīng)減弱，提取率則下降；另外，提取時(shí)間過久增加了自由基等氧化物質(zhì)的產(chǎn)生，花青素被消耗而含量降低［24-26］。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，本研究最終篩出3個(gè)主要因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立回歸模型，分析各因素對(duì)花青素含量的兩兩交互作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度對(duì)花青素提取含量的影響最大，液料比次之，提取時(shí)間的影響最小。陳雪等［27］采用超聲輔助乙醇提取葡萄皮渣中的花青素時(shí)得出乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄皮渣花青素提取效果的影響最大，其次是料液比和提取時(shí)間，這與本研究試驗(yàn)結(jié)果相似。

花青素具有酚羥基結(jié)構(gòu)，能夠與羥自由基、DPPH自由基等氧化物結(jié)合并將其清除，從而發(fā)揮抗氧化作用；ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+，在抗氧化物存在時(shí)ABTS+的產(chǎn)生會(huì)被抑制［28-29］。因此，通過測(cè)定花青素對(duì)自由基的清除能力可評(píng)估其抗氧化活性。如OLDZKI R等［30］通過測(cè)定葡萄果皮中花青素對(duì)DPPH和ABTS+自由基的清除能力和對(duì)FRAP的還原力，表明了葡萄果皮花青素具有較強(qiáng)的抗氧化活性。馬孟佳［31］等分別測(cè)定了藍(lán)莓、紫薯、紫甘藍(lán)、黑豆花青素對(duì)羥自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基的清除率，比較了這些植物中花青素的抗氧化活性強(qiáng)弱。本研究以VC為陽性對(duì)照，探究不同濃度紅象草花青素對(duì)自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)紅象草花青素對(duì)羥自由基、DPPH自由基以及ABTS+自由基均有較好的清除和抑制作用，其自由基清除能力與VC相當(dāng)或更高，表明紅象草花青素抗氧化活性顯著，故本試驗(yàn)制備的紅象草花青素提取物具備開發(fā)成為天然抗氧化飼料添加劑的潛力。

4" 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助提取法從紅象草中提取花青素成分，并通過響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，紅象草花青素最佳提取工藝條件為：乙醇濃度49%，提取時(shí)間30 min，液料比49∶1；驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，紅象草花青素提取含量為2.09 mg·g-1，與模型預(yù)測(cè)的理論值相符，提取工藝優(yōu)化合理可行；自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅象草花青素對(duì)羥自由基、DPPH及ABTS+自由基有較好的清除能力，說明紅象草花青素具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。紅象草的資源優(yōu)勢(shì)和特性使其發(fā)揮了較大的養(yǎng)殖效益和生態(tài)效益，對(duì)紅象草含有的豐富的生物活性物質(zhì)加以利用能夠進(jìn)一步提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，紅象草花青素提取工藝及其活性研究可為象草資源的深層次開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］" 陸云華，湯洪波，鄒懷波，等. 臺(tái)灣甜象草、紅象草和皇竹草營養(yǎng)成分和無機(jī)元素的分析［J］. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（2）：418-419

［2］" 陳鐘佃，黃勤樓，黃秀聲，等. 閩引紅象草栽培技術(shù)［J］. 福建農(nóng)業(yè)科技，2013（4）：54-55

［3］" 陳鐘佃，黃秀聲，黃勤樓，等. 紅象草花青素飲料及其制備方法：中國，CN103040062B［P］. 2014-06-25

［4］" 陳鑫珠，李文楊，劉遠(yuǎn)，等. 紅象草綠汁發(fā)酵液微生物組成及其對(duì)菌糠發(fā)酵品質(zhì)的影響［J］. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，33（6）：644-648

［5］" 沈媛. 櫻桃果實(shí)營養(yǎng)成分和花青素的研究［D］. 南京：南京林業(yè)大學(xué)，2014：41-45

［6］" MERECZ-SADOWSKA A，SITAREK P，KOWALCZYK T，et al. Food Anthocyanins：Malvidin and its glycosides as promising antioxidant and anti-Inflammatory agents with potential health benefits［J］. Nutrients，2023，15（13）：3016

［7］" LIU J Q，ZHOU H B，SONG L，et al. Anthocyanins：promising natural products with diverse pharmacological activities［J］. Molecules，2021，26（13）：3807

［8］" 張媛雯，趙琳，鄭天翔，等. 原花青素提取及分離純化方法的研究進(jìn)展［J］. 食品工業(yè)，2023，44 （4）：263-266

［9］" 黃凌輝，蔡錦森，蔡錦勝. 紅象草提取花青素裝置及其采用該裝置提取花青素的方法：中國，CN113289375A［P］. 2021-08-24

［10］黃凌輝，蔡錦森，蔡錦勝. 紅象草提取花青素裝置：CN217015395U［P］. 2022-07-22

［11］焦文靜，林潔榮，葉健軍，等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫象草花青素提取工藝［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（19）：11-15，20，294

［12］劉賽格，冉思蛟，倪?；?，等. 紫象草原花青素提取物的制備條件優(yōu)化和體外抗氧化活性研究［J］. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2022，34（11）：7443-7454

［13］FULEKI T，F(xiàn)RANCIS F J. Quantitative methods for anthocyanins. 4. determination of individual anthocyanins in cranberry and cranberry products［J］. Journal of Food Science，1968，33（5）：471-478

［14］李茂，字學(xué)娟，侯冠彧，等. 體外產(chǎn)氣法評(píng)價(jià)5種熱帶禾本科牧草營養(yǎng)價(jià)值［J］. 草地學(xué)報(bào)，2013，21（5）：1028-1032

［15］武齊豐，陳晨，黃沁驕，等. 纖維素酶和乳酸菌對(duì)雜交象草青貯結(jié)構(gòu)性碳水化合物影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2024，32 （7）：2314-2322

［16］ALAPPAT B，ALAPPAT J. Anthocyanin pigments：beyond aesthetics［J］. Molecules，2020，25（23）：5500

［17］ECHEGARAY N，MUNEKATA P E S，GULLN P，et al. Recent advances in food products fortification with anthocyanins［J］. Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2022，62（6）：1553-1567

［18］崔海鵬，郭健龍，王大全，等. 花青素加工穩(wěn)定性及其研究進(jìn)展［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2024，50（13）：388-397

［19］李冠臻. pH和溫度對(duì)紫蘇花青素穩(wěn)定性的影響［J］. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018（1）：84-85

［20］李小東，王鈺，效碧亮，等. 花青素的提取方法及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］. 應(yīng)用化工，2020，49 （2）：449-451，457

［21］THILAKARATHNA W P D W，RUPASINGHE H P V. Optimization of the extraction of proanthocyanidins from grape seeds using ultrasonication-assisted aqueous ethanol and evaluation of anti-steatosis activity in vitro［J］. Molecules，2022，27（4）：1363

［22］RANJHA M A N，IRFAN S，LORENZO J M，et al. Sonication，a potential technique for extraction ofphytoconstituents：a systematic review［J］. Processes，2021，9（8）：1406

［23］張瀟，周海旭，高晗，等. 紫甘藍(lán)中花青素提取工藝及其抗氧化研究［J］. 河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2024，52（3）：62-68

［24］葛艷琳. 山葡萄皮花青素超聲波輔助提取及抗氧化活性研究［J］. 食品研究與開發(fā)，2018，39（10）：48-55

［25］許丹丹，王曉君，陳宇. 多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)化金銀花枝葉的提取工藝研究［J］. 浙江中醫(yī)雜志，2020，55（7）：541-542

［26］程海濤，申獻(xiàn)雙. 超聲波-協(xié)同溶液水力空化提取馬齒莧中原花青素工藝優(yōu)化［J］. 飼料研究，2020，43（1）：65-69

［27］陳雪，耿延，李雯婷，等. 葡萄皮渣花青素提取工藝研究［J］. 農(nóng)產(chǎn)品加工，2024（6）：34-37

［28］王海歌，鮑夢(mèng)圓，徐心雨，等. 植物食材花青素結(jié)構(gòu)特性及對(duì)其功效機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 中國食品添加劑，2024，35（2）：299-307

［29］李煦，白雪晴，劉長霞，等. 天然花青素的抗氧化機(jī)制及功能活性研究進(jìn)展［J］. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2021，12（20）：8163-8171

［30］OLDZKI R，LUTOSAWSKI K，NOWICKA P，et al. Non-commercial grapevines hybrids fruits as a novel food of high antioxidant activity［J］. Foods，2022，11（15）：2216

［31］馬孟佳，趙娟，陳鵬飛，等. 4種不同來源花青素的穩(wěn)定性及抗氧化性比較［J］. 食品研究與開發(fā)，2024，45（4）：31-39，67

（責(zé)任編輯" 劉婷婷）