摘要：為獲得高產(chǎn)腺苷菌株，實(shí)現(xiàn)降本增效，該研究基于一株腺苷產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌SB-37，對(duì)其進(jìn)行ARTP誘變選育，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面方法優(yōu)化菌株發(fā)酵條件。結(jié)果表明，最佳處理時(shí)間為30 s，菌株誘變致死率為98.75%。比對(duì)初始菌株腺苷產(chǎn)量，獲得8株高產(chǎn)腺苷突變株，其中菌株Q40-2-37腺苷產(chǎn)量最高，為6.20 g/L，是出發(fā)菌株的2.58倍。該菌株最適發(fā)酵條件為葡萄糖99 g/L、蛋白胨25 g/L、pH 7.04、接種量8.03%、發(fā)酵時(shí)間72 h，此條件下，腺苷產(chǎn)量為6.92 g/L。該研究結(jié)果為高產(chǎn)腺苷菌株的誘變選育和發(fā)酵條件的優(yōu)化提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：腺苷；枯草芽孢桿菌；常壓室溫等離子體；誘變；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS201.3""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""""" 文章編號(hào)：1000-9973（2024）08-0063-06

Breeding of High-Producing Adenosine Strains by ARTP Mutation and

Optimization of Fermentation Conditions

YAN Geng-xuan1， LIU Wei1， LIU Chun-yan2， TIAN Yuan1， YU Chong1，

JIANG Wei1， TIAN Jie-ping1*， ZHANG Shu-mei1*

（1.Institute of Microbiology， Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin 150010， China;

2.Heilongjiang Academy of Sciences， Harbin 150001， China）

Abstract： In order to obtain high-producing adenosine strains and realize cost reduction and efficiency enhancement， a strain of adenosine-producing bacterium， Bacillus subtilis SB-37， is breeded by ARTP mutation， and single factor experiment and response surface method are used to optimize the fermentation conditions of the strain. The results show that the optimal treatment time is 30 s and the mutation fatality rate is 98.75%. Compared with the adenosine yield of the original strain， 8 high-producing adenosine mutant strains are obtained， and strain Q40-2-37 has the highest adenosine yield of 6.20 g/L， which is 2.58 times that of the original strain. The optimal fermentation conditions of the strain are glucose of 99 g/L， peptone of 25 g/L， pH of 7.04， inoculation amount of 8.03% and fermentation time of 72 h.Under these conditions， the adenosine yield is 6.92 g/L. The results of this study have provided technical support for the mutation and breeding of high-producing adenosine strains and optimization of fermentation conditions.

Key words： adenosine; Bacillus subtilis; atmospheric and room temperature plasma; mutation; optimization of fermentation conditions

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.08.012

引文格式：閆更軒，劉偉，劉春燕，等.ARTP誘變選育高產(chǎn)腺苷菌株及發(fā)酵條件優(yōu)化.中國(guó)調(diào)味品，2024，49（8）：63-68.

YAN G X， LIU W， LIU C Y， et al.Breeding of high-producing adenosine strains by ARTP mutation and optimization of fermentation conditions.China Condiment，2024，49（8）：63-68.

收稿日期：2024-01-26

基金項(xiàng)目：黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（CZKYF2023-1-B041）

作者簡(jiǎn)介：閆更軒（1996—），男，助理研究員，碩士，研究方向：工業(yè)菌種選育。

*通信作者：田潔萍（1971—），女，高級(jí)工程師，研究方向：科技管理；

張淑梅（1969—），女，研究員，博士，研究方向：食品微生物。

呈味核苷酸作為一種新型調(diào)味品，在食品行業(yè)中應(yīng)用廣泛，海鮮、蘑菇等食品中含有豐富的核苷酸，主要包括肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸和腺嘌呤核苷酸。腺嘌呤核苷酸是一種苦味阻滯食品添加劑，由于成本高，尚未得到廣泛應(yīng)用。腺苷又叫腺嘌呤核苷，是一類具有重要生物學(xué)功能的核苷酸衍生物，不僅是制造阿糖腺苷、腺苷三磷酸與環(huán)磷酸腺苷等核苷類藥物的重要中間體，而且是制造食品呈味劑腺嘌呤核苷酸的重要原料，在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的商業(yè)價(jià)值巨大。腺苷生產(chǎn)主要有化學(xué)、酶解和微生物發(fā)酵3種方式?；瘜W(xué)合成法由于合成工藝相對(duì)復(fù)雜、成本較高且提取率低，不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。酶解法受酶成本和提純工藝的限制，已經(jīng)退出市場(chǎng)。微生物發(fā)酵法是目前首選的腺苷生產(chǎn)方式，提高菌株發(fā)酵能力是腺苷行業(yè)急需解決的共性問(wèn)題。

常壓室溫等離子體（ARTP）作為微生物誘變育種新技術(shù)已廣泛應(yīng)用于工業(yè)菌株的改造，通過(guò)誘變育種獲得高產(chǎn)腺苷的優(yōu)良底盤菌，基因工程改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化是提高腺苷產(chǎn)能、實(shí)現(xiàn)降本增效的重要途徑。本研究基于一株腺苷產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌SB-37，通過(guò)等離子體誘變技術(shù)，旨在獲得一株腺苷產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定的誘變菌株，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)誘變菌株進(jìn)行培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件優(yōu)化，以期進(jìn)一步提高腺苷產(chǎn)量，該研究為利用基因工程技術(shù)改造腺苷產(chǎn)生菌提供了菌株資源，為腺苷的發(fā)酵生產(chǎn)提供了技術(shù)參考。

1" 材料與方法

1.1" 材料

枯草芽孢桿菌SB-37：保存于黑龍江省科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.2" 主要試劑

腺苷標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、瓊脂等試劑：購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3" 主要儀器與設(shè)備

ARTP誘變育種儀" 無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)" 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ZQLY-300V恒溫?fù)u床" 上海知楚儀器有限公司。

1.4" 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，pH 7.0，120 ℃滅菌15 min。

固體培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母膏1%，牛肉膏0.3%，尿素0.5%，氯化鉀0.2%，瓊脂1.5%，pH 7.0，120 ℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母膏1%，牛肉膏0.3%，尿素0.5%，氯化鉀0.2%，泡敵0.03%，pH 7.0，120 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖7%，蛋白胨2.5%，磷酸二氫鉀0.3%，七水硫酸鎂0.1%，尿素0.5%，氯化鉀0.2%，硫酸銨1.5%，一水硫酸錳0.001%，硫胺素0.015%，豆餅粉水解液1.5%，pH 7.0，120 ℃滅菌15 min。

1.5" 方法

1.5.1" ARTP誘變

用LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌SB-37至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，用無(wú)菌水重懸使菌濃度為106～108 個(gè)/mL，在超凈臺(tái)上取10 μL菌液均勻涂布在無(wú)菌載片表面，用無(wú)菌鑷子將載片放到ARTP誘變儀對(duì)應(yīng)凹槽中，按以下參數(shù)處理：電源功率120 W，作用距離 2 mm，氣流速度 10 SLM，分別照射20，30，40，50，60，80，100 s，以無(wú)照射作為對(duì)照。照射后，用無(wú)菌鑷子將載片放置于無(wú)菌水中洗脫，適當(dāng)稀釋后涂布于LB培養(yǎng)皿。于30 ℃培養(yǎng)24 h后，計(jì)算菌落數(shù)，根據(jù)致死率篩選合適的誘變時(shí)間。致死率（%）=（對(duì)照活菌數(shù)-處理活菌數(shù)/對(duì)照活菌數(shù)）×100%。

1.5.2" 高產(chǎn)腺苷菌株的篩選

依次挑取單菌落接種到 10 mL種子培養(yǎng)液中，在30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，取發(fā)酵上清液在水浴鍋中煮沸5 min，以8 000 r/min離心5 min。取1 μL上清液加入1 mL 0.1 mol/L pH 3的鹽酸溶液，混勻，在260 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD260 nm吸光度。通過(guò)腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腺苷產(chǎn)量。

1.5.3" 單因素實(shí)驗(yàn)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究碳源葡萄糖的添加量、氮源尿素和蛋白胨的添加量、接種量、發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH等因素對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響，篩選出主要影響因素，進(jìn)行響應(yīng)面分析。單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.5.4" Box-Behnken設(shè)計(jì)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以葡萄糖添加量（A）、初始pH（B）和接種量（C）為因素設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化所選突變株的腺苷生產(chǎn)能力，Box-Behnken設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.5.5" 數(shù)據(jù)處理

全部實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，應(yīng)用SPSS Statistics 26.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 2021軟件繪圖，使用Design-Expert 12軟件進(jìn)行響應(yīng)面相關(guān)結(jié)果分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" ARTP誘變時(shí)間對(duì)菌株生存的影響

ARTP處理時(shí)間是影響菌株生存和誘變效果的主要因素，菌株致死率與照射時(shí)間呈正相關(guān)，延長(zhǎng)照射時(shí)間，菌株致死率提高。由圖1可知，照射處理20 s時(shí)誘變致死率為89.50%，照射處理 60 s時(shí)誘變致死率達(dá)到100%。ARTP誘變處理時(shí)間的選擇因菌株而異，研究表明，誘變時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致枯草芽孢桿菌產(chǎn)生不可逆的DNA損傷，無(wú)法進(jìn)行自我修復(fù)。本研究中枯草芽孢桿菌SB-37在通氣量10 SLM、功率120 W、照射距離2 mm的條件下，處理時(shí)間為30 s時(shí)誘變致死率已經(jīng)達(dá)到98.75%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于楊心萍等的約60%，推測(cè)與誘變處理操作方式或菌種特性有關(guān)。

2.2" 突變菌株的篩選

將不同處理時(shí)間下的單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)后測(cè)定腺苷含量，從1 642個(gè)菌株中獲得131個(gè)腺苷產(chǎn)量較高的正突變菌株，正突變率為7.97%，有8個(gè)菌株腺苷產(chǎn)量顯著提高，見(jiàn)表3。其中編號(hào)為Q40-2-37的菌株產(chǎn)量最高，為6.20 g/L，是原始菌株的2.58倍。對(duì)Q40-2-37菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)5次后，菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定，其腺苷產(chǎn)量在5.86～6.20 g/L之間，表明Q40-2-37菌株的遺傳性能較穩(wěn)定。

2.3" 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3.1" 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1" 碳源添加量對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響

比較了在相同發(fā)酵條件下葡萄糖的添加量對(duì)Q 40-2-37菌株腺苷產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，當(dāng)葡萄糖添加量為50～90 g/L時(shí)，腺苷產(chǎn)量隨著葡萄糖添加量的增加而升高，當(dāng)葡萄糖添加量為90 g/L時(shí)腺苷產(chǎn)量達(dá)到最大，為6.46 g/L。當(dāng)葡萄糖添加量大于90 g/L時(shí)，腺苷產(chǎn)量不再上升，反而略有下降。批次發(fā)酵葡萄糖濃度過(guò)高，培養(yǎng)液的黏度增加，傳質(zhì)能力和溶解氧降低，滲透壓增大，影響芽孢桿菌的生長(zhǎng)和初級(jí)代謝物的產(chǎn)量。葡萄糖添加量為90 g/L最適合Q40-2-37菌株產(chǎn)生腺苷。

2.3.1.2" 氮源添加量對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響

枯草芽孢桿菌發(fā)酵一般應(yīng)用復(fù)合氮源，本研究參考楊心萍等的報(bào)道，選用尿素與蛋白胨作為培養(yǎng)基氮源。固定培養(yǎng)基中尿素含量為5 g/L，比較了相同發(fā)酵條件下蛋白胨的添加量對(duì)Q40-2-37菌株腺苷產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，初期蛋白胨濃度較低時(shí)，隨著蛋白胨添加量的增加，Q40-2-37菌株的腺苷產(chǎn)量隨之增大，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿窟_(dá)到30 g/L時(shí)，繼續(xù)添加蛋白胨，腺苷產(chǎn)量基本保持不變，因此考慮綜合應(yīng)用成本，選擇蛋白胨的最佳添加量為30 g/L。

2.3.1.3" 接種量對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響

接種量直接影響發(fā)酵液中后期菌體含量，是影響初級(jí)代謝物發(fā)酵水平的重要因素。比較了相同發(fā)酵條件下不同接種量對(duì)Q40-2-37菌株腺苷產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，初期接種量較低時(shí)，隨著接種量的增加，Q40-2-37菌株的腺苷產(chǎn)量隨之增大，當(dāng)接種量達(dá)到8%時(shí)，腺苷產(chǎn)量達(dá)到最高，為6.13 g/L，繼續(xù)升高接種量會(huì)使腺苷產(chǎn)量下降，故選擇8%為最佳接種量。

2.3.1.4" 發(fā)酵時(shí)間對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響

菌體的生長(zhǎng)和代謝水平會(huì)隨著發(fā)酵過(guò)程逐漸達(dá)到飽和，比較了在相同發(fā)酵條件下不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)Q40-2-37菌株腺苷產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，菌株腺苷產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而升高，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，部分菌體仍處于生長(zhǎng)期，此時(shí)腺苷產(chǎn)量較低，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，菌體生產(chǎn)腺苷的水平基本達(dá)到峰值，此時(shí)腺苷產(chǎn)量為5.84 g/L，而發(fā)酵時(shí)間為96 h和120 h時(shí)，檢測(cè)到的腺苷產(chǎn)量變化較小。因此，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。

2.3.1.5" 培養(yǎng)基初始pH對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響

通過(guò)改變培養(yǎng)基初始pH明確在不同酸堿度條件下Q40-2-37菌株的腺苷產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，pH為7.0時(shí)腺苷產(chǎn)量最高，為5.92 g/L，pH過(guò)高或過(guò)低均會(huì)使腺苷產(chǎn)量下降，這與楊心萍等的研究結(jié)果一致。因此，選擇腺苷發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基初始pH為7.0。

2.3.2" 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以對(duì)腺苷產(chǎn)量影響較大的3個(gè)因素（葡萄糖添加量、初始pH、接種量）設(shè)計(jì)3個(gè)水平共17組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)號(hào)6，9，11，14的腺苷產(chǎn)量較高，與其他實(shí)驗(yàn)號(hào)相比差異顯著（見(jiàn)表4）。對(duì)A（葡萄糖添加量）、B（初始pH）、C（接種量）3 個(gè)單因素進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，構(gòu)建響應(yīng)值Y（腺苷產(chǎn)量）的回歸模型方程：Y=6.86-0.053 7A+0.232 5B+0.043 8C+0.157 5AB-0.015 0AC-0.052 5BC-0.480 0A2-1.06B2-0.660 0C2。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，見(jiàn)表5。

由表5可知，回歸模型的F值為289.43（Plt;0.000 1），極顯著；失擬項(xiàng)的F值為1.99（P=0.257 8），不顯著，表明模型擬合良好。葡萄糖添加量（A）對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響顯著（Plt;0.05），初始pH（B）對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響極顯著（Plt;0.01），接種量（C）對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響不顯著（Pgt;0.05）；交互項(xiàng)AB對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響極顯著（Plt;0.01），AC、BC對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響不顯著（Pgt;0.05）；二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響均極顯著（Plt;0.01）。

圖7中響應(yīng)面三維曲面圖能夠體現(xiàn)出A（葡萄糖添加量）、B（pH）、C（接種量）3 個(gè)單因素之間的交互作用對(duì)腺苷產(chǎn)量的影響。

由圖7可知，3個(gè)因素對(duì)腺苷產(chǎn)量影響的顯著性順序?yàn)锽（初始pH）＞A（葡萄糖添加量）＞C（接種量）。由回歸模型推測(cè)的最佳發(fā)酵條件為葡萄糖添加量99 g/L、初始pH 7.04、接種量8.03%、發(fā)酵時(shí)間72 h、蛋白胨添加量25 g/L。

2.3.3" 最佳發(fā)酵條件的確定及驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)所得模型進(jìn)行分析，得到腺苷生產(chǎn)的最佳發(fā)酵條件為葡萄糖添加量99 g/L、初始pH 7.04、接種量8.03%、發(fā)酵時(shí)間72 h、蛋白胨添加量25 g/L，預(yù)測(cè)的腺苷產(chǎn)量為6.85 g/L。搖瓶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到腺苷產(chǎn)量為6.92 g/L，與預(yù)測(cè)值相近，表明該模型的擬合度較好，具有參考價(jià)值。

3" 結(jié)論

采用ARTP技術(shù)誘變選育高產(chǎn)腺苷菌株，獲得8株產(chǎn)量較高的正突變菌株。采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化了腺苷產(chǎn)量最高的突變株的液體發(fā)酵條件為葡萄糖添加量99 g/L、蛋白胨添加量25 g/L、pH 7.04、接種量8.03%、發(fā)酵時(shí)間72 h，此條件下，腺苷產(chǎn)量為6.92 g/L，是出發(fā)菌株的2.93倍，比優(yōu)化前提高了0.42 g/L。腺苷是生產(chǎn)核苷酸類食品呈味劑的重要原料，高產(chǎn)菌株是促進(jìn)產(chǎn)業(yè)規(guī)?；l(fā)展的核心，本研究選育了一株產(chǎn)量比較高的菌株，未來(lái)將以該菌株為底盤菌，通過(guò)阻斷組氨酸合成途徑、增加腺苷代謝流等策略對(duì)菌株進(jìn)行改良，以期進(jìn)一步提高腺苷生產(chǎn)水平。

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