摘 要：以腐敗椰果罐頭為試材，選用4種培養(yǎng)基分離純化腐敗椰果罐頭中的細(xì)菌，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行同源比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，鑒定細(xì)菌種屬。結(jié)果顯示，從腐敗椰果罐頭中分離得到38株分離菌，經(jīng)16S rDNA分子生物學(xué)方法鑒定為Paenibacillus humicus、Staphylococcus warneri、Sphingomonas sp.和Liquorilactobacillus satsumensis。

關(guān)鍵詞：腐敗椰果罐頭；16S rDNA；細(xì)菌；鑒定

Identification of Microorganisms in Spoiled Coconut Cans by 16S rDNA

SONG Meiling1， GUO Sanbao2， LIAO Li1， WU Qingyang1， HUANG Shenghe1*

（1.Department of Basic Medicine， Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 344000， China; 2.Department of Pharmacy， Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 344000， China）

Abstract： Taking spoiled coconut cans as test material， four kinds of culture media were selected to separate and purify bacteria in spoiled coconut cans， amplify bacterial 16S rDNA， compare the 16S rDNA sequences， construct a phylogenetic tree， and identify the bacterial species. The results showed that 38 isolates were obtained from spoiled coconut cans and identified by 16S rDNA molecular biology method as Paenibacillus humicus， Staphylococcus warneri， Sphingomonas sp.， Liquorilactobacillus satsumensis.

Keywords： spoiled coconut cans; 16S rDNA; bacteria; identification

椰果是醋酸桿菌利用椰子汁發(fā)酵制得的多糖類(lèi)膠體，顏色微白，呈凝膠半透明狀，具有較好的持水性、韌性和彈性，并富含優(yōu)質(zhì)的膳食纖維，因此被廣泛加工成椰果罐頭。椰果罐頭因爽滑、多汁、脆嫩、細(xì)膩而有彈性的獨(dú)特口感備受消費(fèi)者的青睞[1]。

全國(guó)有上百家企業(yè)在罐頭生產(chǎn)中出現(xiàn)過(guò)組織解體、糊化變質(zhì)、酸敗等質(zhì)量問(wèn)題[2]。許美玲等[3]通過(guò)菌落形態(tài)及生理生化指標(biāo)，結(jié)合BD微生物自動(dòng)鑒定儀鑒定了腐敗黃桃罐頭中的微生物為團(tuán)泛菌和地衣芽孢桿菌，腐敗草莓罐頭中的微生物為地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌；史振霞等[4]通過(guò)生理生化指標(biāo)鑒定了腐敗桃罐頭中的微生物主要為凝結(jié)芽孢桿菌、黃色絲衣霉、蠟狀芽孢桿菌等。與傳統(tǒng)通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標(biāo)鑒定菌種方法相比，16S rDNA分子生物學(xué)鑒定方法具有較高的靈敏度，通過(guò)比對(duì)菌種間16S rDNA可變區(qū)的特異性核苷酸序列，鑒定細(xì)菌種屬[5]。16S rDNA分子生物學(xué)鑒定方法已被廣泛應(yīng)用于食品中微生物的鑒定[6-8]，但目前使用該方法鑒定腐敗椰果罐頭中的微生物還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以保質(zhì)內(nèi)腐敗椰果罐頭為材料，選取4種培養(yǎng)基培養(yǎng)、分離及純化細(xì)菌，通過(guò)PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，測(cè)序獲得細(xì)菌16S rDNA堿基序列，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中進(jìn)行同源序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，鑒定細(xì)菌種屬，以期為優(yōu)化椰果罐頭的殺菌方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

腐敗椰果罐頭樣品由某企業(yè)提供。皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基和酸性肉湯瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；通用引物、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，上海生工生物工程有限公司；Taq酶、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR，寶生物工程（大連）有限公司。

雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱、智城恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；NanoDrop one超微量分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技公司；S1000? Thermal Cycler普通PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)，寶誠(chéng)生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腐敗椰果罐頭中細(xì)菌的分離培養(yǎng)

從相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)獲得腐敗及密封性良好的椰果罐頭，使用75%酒精對(duì)外包裝進(jìn)行消毒，在超凈工作臺(tái)中取200 μL椰果罐頭內(nèi)容物分別涂布于皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基和酸性肉湯瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)，倒置連續(xù)培養(yǎng)120 h，每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每24 h觀察記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

1.2.2 腐敗椰果罐頭中細(xì)菌的純化培養(yǎng)

觀察菌落形態(tài)，不同形態(tài)菌落應(yīng)選盡選，相似形態(tài)菌株至少挑選兩株[9]，采用劃線(xiàn)分離法分別接種于相應(yīng)培養(yǎng)基，進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增

使用Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR試劑裂解腐敗椰果罐頭中的細(xì)菌，獲得細(xì)菌基因組DNA。使用通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R： 5’-GG-TTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因序列，PCR均在25 μL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系為10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mix（各2.5 mmol·L-1）2 μL，27F（10 μmol·L-1）、1492R（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA模板1.5 μL，Taq酶（2.5 U·L-1）0.3 μL，滅菌純化水16.7 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、56 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇結(jié)果為陽(yáng)性的樣品，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 16S rDNA序列同源比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

獲得的細(xì)菌16S rDNA基因序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中，用基本局部比對(duì)搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，Blast）進(jìn)行同源序列比對(duì)，采用鄰接法（Neighbor Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析并確定腐敗椰果罐頭中細(xì)菌的種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗椰果罐頭中細(xì)菌分離與純化

腐敗椰果罐頭內(nèi)容物涂布于皰肉瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基和酸性肉湯瓊脂培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)120 h，再經(jīng)平板劃線(xiàn)培養(yǎng)獲得38株純化菌株。

2.2 擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA

利用16S rDNA通用引物擴(kuò)增38株菌株16S rDNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 500 bp左右（圖1），符合預(yù)期大小。

2.3 細(xì)菌16S rDNA同源序列比對(duì)

獲得的細(xì)菌16S rDNA序列在NCBI中通過(guò)Blast進(jìn)行同源序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)38株菌株屬于4種不同菌，2株菌（A菌）與Paenibacillus humicus（登錄號(hào)MT808854.1）相似度99.86%，7株菌（B菌）與Staphylococcus warneri（登錄號(hào)MG972924.1）相似度99.86%，1株菌（C菌）與Sphingomonas sp.（登錄號(hào)AM900776.1）相似度為100%，28株菌（D菌）與Liquorilactobacillus satsumensis（登錄號(hào)KU060283.1）相似度99.86%，詳見(jiàn)表1。

2.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果如圖2所示，A菌與Paenibacillus humicus（登錄號(hào)MT808854.1）聚為一支，B菌與Staphylococcus warneri（登錄號(hào)MG972924.1）聚為一支，C菌與Sphingomonas sp.（登錄號(hào)AM900776.1）聚為一支，D菌與Liquorilactobacillus satsumensis聚為一支（登錄號(hào)KU060283.1）。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果與同源序列比對(duì)結(jié)果一致，初步推測(cè)A菌為Paenibacillus humicus，B菌為Staphylococcus warneri，C菌為Sphingomonas sp.，D菌為L(zhǎng)iquorilactobacillus satsumensis。

Staphylococcus warneri為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，主要存在于在人體和動(dòng)物皮膚黏膜表面[10-11]，一般不致病，但該菌可通過(guò)靜脈注射等方法進(jìn)入人體，引發(fā)多種疾病[12]。目前，在牦牛乳[13]、發(fā)病盔形溞[11]、發(fā)病羅非魚(yú)苗[12]等中分離鑒定出了該菌，也有文獻(xiàn)報(bào)道該菌還存在于發(fā)酵食品中，可發(fā)酵蔗糖和乳糖產(chǎn)酸[14]，導(dǎo)致食品變酸腐敗。

Sphingomonas sp.為革蘭氏陰性細(xì)菌，主要存在于常見(jiàn)于土壤和水生環(huán)境中，具有較強(qiáng)的生命力[15]，能夠降解芳香族化合物、重金屬等物質(zhì)，在環(huán)境修復(fù)方面具有極高的應(yīng)用價(jià)值[16]。Sphingomonas sp.在生長(zhǎng)過(guò)程中可分泌鞘氨醇膠，其中的威蘭膠無(wú)毒無(wú)害，具有較好的持水性，可長(zhǎng)期保持果汁飲品中果肉的口感，還可延長(zhǎng)果汁飲品的保質(zhì)期。另外，威蘭膠具有良好的增稠效果，且不易受pH值的影響，可作為添加劑添加于果凍、飲料、酸奶及果醬中[17]。Sphingomonas sp.還會(huì)產(chǎn)生瓊膠酶，該酶可高效降解瓊膠生成瓊膠寡糖，瓊膠寡糖因具有防腐功能，被廣泛地應(yīng)用于食品醫(yī)藥領(lǐng)域[18]。

Liquorilactobacillus satsumensis為乳酸菌，在生長(zhǎng)過(guò)程中利用糖類(lèi)產(chǎn)生乳酸。有文獻(xiàn)報(bào)道，與部分乳酸菌相比，其發(fā)酵速度和產(chǎn)酸能力較弱，但其產(chǎn)生的發(fā)酵液酸度適中，在適宜消費(fèi)者乳酸菌飲料酸度范圍，是較好的果蔬類(lèi)發(fā)酵微生物之一[19]。目前，鮮見(jiàn)對(duì)Paenibacillus humicus的研究。

3 結(jié)論

本文選用4種固體培養(yǎng)基對(duì)腐敗椰果罐頭中的細(xì)菌進(jìn)行分離，得到38株細(xì)菌，經(jīng)16S rDNA分子生物學(xué)方法鑒定為4種菌，分別為Phingomonas sp.、Liquorilactobacillus satsumensis、Staphylococcus warneri和Paenibacillus humicus。推測(cè)Sphingomonas sp.和Liquorilactobacillus satsumensis是企業(yè)為保持產(chǎn)品較好口感以及適宜酸度，在椰果罐頭中添加的兩種菌；一線(xiàn)生產(chǎn)人員參與產(chǎn)品從原料到封口滅菌的生產(chǎn)過(guò)程，而人體皮膚黏膜表面存在Staphylococcus warneri，推測(cè)Staphylococcus warneri來(lái)自生產(chǎn)人員；Paenibacillus humicus的來(lái)源還需進(jìn)一步研究。

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基金項(xiàng)目：江西省撫州市社會(huì)發(fā)展指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目（撫科社字〔2023〕7號(hào)序列號(hào)3）。

作者簡(jiǎn)介：宋美玲（1989—），女，江西撫州人，碩士，講師。研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

通信作者：黃勝和（1977—），男，江西撫州人，博士，教授。研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail： hsh712@163.com。