【摘要】目的"觀察中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）形成在川崎病（KD）急性期中的變化，探討其參與KD血管損傷的可能和相關(guān)藥物的保護(hù)機(jī)制。方法"留取2022年1月—2023年6月東莞市婦幼保健院收治的40例KD患兒靜脈注射丙種球蛋白前、后與對(duì)照組40例健康同齡兒童血樣，對(duì)外周血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)的血漿中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和循環(huán)游離DNA（cfDNA）、LL-37、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ），以及血管性血友病因子（vWF）、內(nèi)皮細(xì)胞微粒（EMPs）及血小板衍生微粒（PDMP）水平進(jìn)行比較并分析。結(jié)果"KD急性期患兒外周血中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和TNF-α、IL-6以及NETs主要成分cfDNA和LL-37水平增高，DNaseⅠ水平下降，丙種球蛋白治療后恢復(fù)，且與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；同時(shí)血漿中vWF、EMPs和PDMP也均增高，丙種球蛋白治療后下降，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；有冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張者KD急性期的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、TNF-α、cfDNA及vWF、EMPs、PDMP較無(wú)冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張者高，DNaseⅠ則較之低；相關(guān)分析提示，NETs主要成分cfNDA與EMPs、vWF及PDMP水平呈正相關(guān)，與DNaseⅠ水平呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論"KD急性期存在NETs過(guò)表達(dá)和DNaseⅠ降解能力下降與患者病情相關(guān)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)cfDNA在早期診斷和病情嚴(yán)重程度評(píng)估中有一定臨床價(jià)值；NETs可能參與了KD的血管炎癥內(nèi)皮損傷-凝血軸反應(yīng)；提示丙種球蛋白通過(guò)減少NETs損傷途徑發(fā)揮一定藥理保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】川崎??；血管炎；中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)；內(nèi)皮細(xì)胞微粒；血管性血友病因子；血小板衍生微粒

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.11.018

A Preliminary Study of Involvement of Neutrophil Extracellular Traps on Vascular Injury in Acute Phase of Kawasaki Disease

ZHANG Wei1，DUAN Gaoyang2，GUO Yao2，TANG Mingsheng2，WU Fengzhi1，JIANG Fengzhi²

（1.The First Clinical School of Medicine，Guangdong Medical University，Zhanjiang 524023，Guangdong，China；2.Department of Pediatrics，Dongguan Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Guangdong Medical University，Dongguan 523112，Guangdong，China）

【Abstract】Objective"To observe the changes of neutrophil extracellular traps （NETs） formation in the acute phase of Kawasaki disease （KD），and explore the possible involvement of NETs in KD vascular injury and the protective mechanism of related drugs.Methods"Blood samples of 40 KD children treated in Dongguan Maternal and Child Health Care Hospital before and after intravenous immunoglobulin （IVIG） treatment and 40 healthy children of the same age as control group were collected during the period from January 2022 to June 2023.The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α），interleukin-6 （IL-6），circulating cell-free DNA （cfDNA），LL-37，deoxyribonuclease I （DNaseⅠ），von Willebrand factor （vWF），endothelial microparticles （EMPs），platelet-derived microparticles （PDMP） in plasma detected by ELISA and peripheral blood neutrophil count of all the specimen were compared and analyzed.Results"In the acute phase of KD，neutrophil count，the level of TNF-α，IL-6，and cfDNA and LL-37 as main components of NETs increased and DNaseⅠ decreased，while those recovered after IVIG treatment，and there were no statistical difference compared with the control group.At the same time，vWF，EMPs and PDMP in plasma also increased，and decreased after treatment with IVIG，and there were no statistical difference compared with the control group.In the acute phase of KD，neutrophil count，TNF-α，cfDNA，vWF，EMPs and PDMP were higher in patients with coronary artery dilatation than those without coronary artery dilation，while DNaseⅠ was lower.Correlation analysis showed that cfNDA，the main component of NETs，was positively correlated with the concentration of EMPs，vWF and PDMP，and negatively correlated with DNaseⅠ.Conclusion"NETs over-expression and DNaseⅠ degradation during KD acute phase are associated with the patient’s condition ，and dynamic monitoring of cfDNA has certain clinical value in early diagnosis and assessment of condition severity.NETs may be involved in the vascular inflammatory endothelial injury and coagulation axis reaction of KD.Furthermore，it suggests that IVIG exerts the pharmacological protective effect by reducing the damage of NETs pathway.

【Keywords】Kawasaki disease；Vasculitis；Neutrophil extracellular traps；Endothelial microparticles；von Willebrand factor；Platelet-derived microparticles

川崎?。↘awasaki disease，KD）又稱(chēng)為皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，1967年由日本首次報(bào)道，好發(fā)于5歲以下嬰幼兒，為兒童獲得性心臟病的首要病因^［1］，其病理上系全身自身免疫性彌漫性中小血管炎疾病，尤以冠狀動(dòng)脈損害（coronary artery lesion，CAL）最常發(fā)生，從而引起心臟不同程度缺血性損傷。臨床上KD急性期患者外周血以中性粒細(xì)胞升高為主，伴CAL的患兒活化程度更高^［2］。中性粒細(xì)胞死亡后形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs），是一種新認(rèn)識(shí)的死亡方式，稱(chēng)之為NETosis。其生成的產(chǎn)物有重要病理作用，已有研究發(fā)現(xiàn)KD急性期體內(nèi)中性粒細(xì)胞易形成NETs而加重炎癥反應(yīng)，因血管炎最終會(huì)涉及血管內(nèi)皮損傷-凝血軸反應(yīng)機(jī)制，尚未見(jiàn)NETs對(duì)其影響的直接觀察及相關(guān)干預(yù)手段是否與之相聯(lián)系的臨床研究。本研究旨在觀察KD患兒急性期靜脈注射丙種球蛋白治療前后外周血中NETs形成和血管內(nèi)皮損傷及血小板激活情況，試圖探討其病理生理意義，為相關(guān)藥物保護(hù)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1"資料與方法

1.1"研究對(duì)象

以2022年1月—2023年6月期間在東莞市婦幼保健院收治的KD患兒為研究對(duì)象，入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≤5歲的初次治療人群，符合最近更新的診斷標(biāo)準(zhǔn)^［3］；（2）確診后即按每日1 g/kg的丙種球蛋白連續(xù)靜脈注射2 d且臨床恢復(fù)良好者；（3）門(mén)診每月定期隨訪，并以發(fā)病3個(gè)月內(nèi)心臟彩超檢查顯示冠狀動(dòng)脈是否擴(kuò)張作為評(píng)價(jià)CAL的依據(jù)；（4）接受了在門(mén)診定期復(fù)診者。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往患有心血管系統(tǒng)或/和其他免疫系統(tǒng)疾病，發(fā)病近期接受過(guò)免疫功能調(diào)節(jié)類(lèi)藥物治療以及未完成隨訪者。根據(jù)隊(duì)列研究樣本量計(jì)算公式N1=N2=2［（tα/2+tβ/2）S/δ］2，α為Ⅰ類(lèi)誤差，β為Ⅱ類(lèi)誤差，tα/2和tβ/2分別代表對(duì)應(yīng)的臨界值，S為樣本標(biāo)準(zhǔn)差，δ為容許誤差，

控制好失訪率，共納入KD患兒40例，同時(shí)選取同齡健康體檢兒童40例為對(duì)照組。本次研究通過(guò)東莞市婦幼保健院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)同意實(shí)行[批準(zhǔn)號(hào)2021第（34）號(hào)]，所有受試者家長(zhǎng)均對(duì)試驗(yàn)知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2"標(biāo)本采集與處理

KD組在入院明確診斷后采集外周靜脈血3～4 mL于乙二胺四乙酸二鈉管，并于靜脈注射丙種球蛋白后24 h再采集3～4 mL外周靜脈血；對(duì)照組則在入選時(shí)采集外周靜脈血3～4 mL。以上標(biāo)本均在收集后立即使用離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，移液器取上清血漿至EP管中，保存于-80 ℃冰箱備集中檢測(cè)。

1.3"指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1"血漿檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（參考范圍：20～30 pg/mL）、白細(xì)胞介素-"6（interleukin-6，IL-6）（參考范圍：1～5 pg/mL）、抗菌肽LL-37（LL-37）（參考范圍：2～6 ng/mL）、循環(huán)游離DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）（參考范圍：30～60 ng/mL）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ）（參考范圍：3～10 ng/mL）、內(nèi)皮細(xì)胞微粒（endothelial microparticles，EMPs）（參考范圍：25～50 ng/mL）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）（參考范圍：0.5～1 ng/mL）、血小板衍生微粒（platelet-derived microparticles，PDMP）（參考范圍：30～50 ng/mL）等水平，以上試劑均購(gòu)于武漢新啟迪生物科技有限公司。嚴(yán)格按照各試劑盒中提供說(shuō)明書(shū)規(guī)定的測(cè)定步驟操作。

1.3.2"心臟彩超檢查

所有患兒均完成治療前及隨后3個(gè)月每月1次共4次的心臟彩超檢查，測(cè)定左、右冠狀動(dòng)脈主干及左前降支、回旋支及右冠狀動(dòng)脈中段內(nèi)徑，以任一支擴(kuò)張判定為CAL：（1）主干內(nèi)徑＞3 mm；（2）局部?jī)?nèi)徑較鄰近處擴(kuò)大超過(guò)1.5倍；（3）內(nèi)徑z值≥2.0^［2］。心臟彩超檢查由本院功能科完成。

1.4"統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和GraphPad 9.0繪圖。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，方差齊者多組間行方差分析，兩兩組間行LSD檢驗(yàn)，方差不齊或非正態(tài)分布者則用中位數(shù)和上下四分位數(shù)間距（Q25，Q75）表示，多組間采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，兩組間行Mann-Whitney Ｕ秩和檢驗(yàn)。Spearman法行兩變量間相關(guān)性分析，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。以上檢驗(yàn)方法均以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2"結(jié)果

2.1"一般資料

本研究共40例 KD患兒，男女分別為24例和16例，年齡（2.28±1.72）歲。對(duì)照組40例，男女各20例，年齡（1.78±1.09）歲。各組間年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨訪期內(nèi)共8例出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張情況。

2.2"KD患兒丙種球蛋白治療前、后與對(duì)照組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和血漿中炎癥因子、NETs成分及DNaseⅠ水平比較

對(duì)丙種球蛋白治療前、后與對(duì)照組外周血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和血漿中IL-6、TNF-α、cfDNA、LL-37和DNaseⅠ水平進(jìn)行對(duì)比分析，3組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩比較顯示治療前與治療后和對(duì)照組仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而治療后與對(duì)照組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示KD急性期中性粒細(xì)胞、炎癥因子和NETs成分明顯升高，而DNaseⅠ水平則下降，丙種球蛋白治療好轉(zhuǎn)后均趨恢復(fù)近正常兒童水平。見(jiàn)表1。

2.3"KD患兒丙種球蛋白治療前、后與對(duì)照組血漿中vWF、EMPs、PDMP水平比較

對(duì)丙種球蛋白治療前、后與對(duì)照組血漿中vWF、EMPs、PDMP進(jìn)行比較，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩兩比較顯示治療前與治療后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），后者與對(duì)照組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示急性期三者水平升高，在治療后回降。見(jiàn)表1。

2.4"不同程度冠狀動(dòng)脈損傷KD急性期患兒丙種球蛋白治療前中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和炎癥因子、NETs成分、DNaseⅠ及vWF、EMPs、PDMP水平比較""根據(jù)KD患兒心臟彩超檢查是否存在冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張分為CAL與無(wú)冠狀動(dòng)脈損害（non-coronary artery lesion，NCAL）兩組，對(duì)其治療前外周血中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-6、TNF-α、cfDNA、LL-37、DNaseⅠ及vWF、EMPs、PDMP水平進(jìn)行比較，其中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、TNF-α、cfDNA、vWF、EMPs、PDMP在CAL組較NCAL組水平更高，DNaseⅠ則較低，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.5"相關(guān)性分析

對(duì)上述外周血指標(biāo)行兩變量間Spearman相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)其中cfDNA水平與vWF、EMPs和PDMP水平均呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r分別為0.645、0.500和0.552，P＜0.001），與DNaseⅠ水平則成負(fù)相關(guān)（r=-0.660，P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

3"討論

在兒童急性發(fā)疹性疾病中KD的發(fā)病率較高，尤其亞裔人群，近年中國(guó)北京和上海4歲內(nèi)小兒每年就有超過(guò)100/10萬(wàn)的新發(fā)病例^［4］。引起特異性CAL是KD的重要特征，可引起冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張，一旦發(fā)生冠狀動(dòng)脈瘤則預(yù)后不良，但其發(fā)病機(jī)制仍不明確，迄今普遍認(rèn)為系特定遺傳背景下腸道或呼吸道感染觸發(fā)的異常血管免疫炎癥反應(yīng)，可能與誘發(fā)的超抗原物質(zhì)過(guò)度釋放及多種細(xì)胞因子共同參與等有關(guān)^［5］。

中性粒細(xì)胞占外周血白細(xì)胞的50%～70%，是人體內(nèi)數(shù)量最多的固有免疫系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞，具有強(qiáng)大的抗微生物功能，并對(duì)適應(yīng)性免疫起著重要的輔助和調(diào)節(jié)作用。臨床上常發(fā)現(xiàn)KD急性期表現(xiàn)為外周血中性粒細(xì)胞持續(xù)顯著升高。中性粒細(xì)胞有多種死亡方式，其中壞死、凋亡和自噬為完全性，其不會(huì)引起更多的炎癥反應(yīng)。而成熟中性粒細(xì)胞在激活后可形成一種釋放到胞外，以DNA為網(wǎng)架，并鑲附組蛋白、髓過(guò)氧化物酶、LL-37、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶等復(fù)雜成分的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即NETs而死亡^[6]。NETs的形成對(duì)于機(jī)體來(lái)說(shuō)是一把“雙刃劍”，除發(fā)揮清除病菌作用外，在體內(nèi)過(guò)多滯留則會(huì)造成直接或免疫性破壞，嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體而促發(fā)疾病^"［7-8］。其中cfDNA是主要成分，已發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者中性粒細(xì)胞功能下降伴血漿中cfDNA/NETs比例水平升高，病情嚴(yán)重者明顯較病情輕者更高，且升高程度與不良結(jié)局有關(guān)，患者治療好轉(zhuǎn)則cfDNA/NETs可逐漸下降至正常水平，反映了NETs的形成影響炎性反應(yīng)強(qiáng)度^［9-10］。LL-37是中性粒細(xì)胞特異性抗原肽，其血清中水平也可反映體內(nèi)NETs形成程度^［11］。本研究觀察到KD急性期伴隨血中IL-6、TNF-α等炎癥因子水平升高，NETs主要成分cfDNA、LL-37水平均升高，且冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張組水平較未擴(kuò)張組更高，顯示與損傷程度正相關(guān)，治療后均得以恢復(fù)，與相關(guān)研究^［12］結(jié)果一致，NETs在參與KD的冠狀動(dòng)脈血管炎性損傷過(guò)程中有比較重要的作用。既往研究^［13-14］認(rèn)為細(xì)胞因子是KD發(fā)生與發(fā)展最直接的因素，其中IL-6、TNF-α是血管炎形成的先決條件，可協(xié)調(diào)多種炎癥介質(zhì)，發(fā)病早期其釋放增多也可激活中性粒細(xì)胞，存在與NETs相互促進(jìn)機(jī)制，參與或誘發(fā)對(duì)中小血管內(nèi)皮系統(tǒng)免疫炎性損傷的發(fā)生與發(fā)展。KD急性期體內(nèi)的中性粒細(xì)胞在肉豆蔻酸酯刺激下更易形成NETs，其可通過(guò)過(guò)表達(dá)促炎細(xì)胞因子（如TNF-α和IL-6）顯著促進(jìn)外周血單核細(xì)胞中PI3K/Akt和NF-κB信號(hào)通路的激活，使缺氧誘導(dǎo)因子1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷^［15-16］。有體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)^［17］證實(shí)應(yīng)用NETs抑制劑可抑制NETs生成而改善小鼠動(dòng)脈血栓現(xiàn)象。NETs在體內(nèi)狀態(tài)取決于形成與降解平衡，DNaseⅠ是降解NETs的重要酶，可直接反映其在體內(nèi)降解情況^［18］，已有研究^［19］發(fā)現(xiàn)通過(guò)體外灌注DNaseⅠ降解NETs，可對(duì)炎癥性腸病的小鼠起到保護(hù)作用。作者同時(shí)關(guān)注了DNaseⅠ對(duì)NETs降解能力是否存在缺陷，發(fā)現(xiàn)伴隨NETs而作為反映其主要清除能力的DNaseⅠ水平呈反向改變，導(dǎo)致NETs過(guò)度堆積。在KD的治療中，丙種球蛋白是公認(rèn)的一線標(biāo)準(zhǔn)治療。本研究^［20］發(fā)現(xiàn)在KD急性期行丙種球蛋白治療后，外周血NETs和DNaseⅠ水平均有恢復(fù)，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明丙種球蛋白在此方面有重要干預(yù)作用和意義，其在減少NETs形成和促降解能力恢復(fù)方面都發(fā)揮著藥理保護(hù)作用，推測(cè)可能與其封閉效應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等作用有關(guān)。

免疫性血管炎本質(zhì)上會(huì)涉及血管內(nèi)皮損傷-凝血軸過(guò)程，血管內(nèi)皮損傷、血小板激活、纖溶亢進(jìn)及血流動(dòng)力學(xué)異常等在KD病程中有著重要意義，血小板與白細(xì)胞相互作用，通過(guò)重新編程免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)^［21-22］。vWF是血小板、巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的一種大分子黏附糖蛋白，循環(huán)中vWF主要來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞，是臨床上廣泛認(rèn)可的血管內(nèi)皮損害特異標(biāo)志物^［23］。EMPs作為血管內(nèi)皮細(xì)胞激活物，循環(huán)中存在時(shí)可促進(jìn)炎性反應(yīng)、加重血管內(nèi)皮功能障礙，從而加速血管炎進(jìn)展^［24］。PDMP則是血小板激活相關(guān)有效標(biāo)志物^［25］。本研究同期檢測(cè)了KD患兒外周血中上述與血管損傷和血小板激活相關(guān)的代表性指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在KD急性期均明顯升高，丙種球蛋白治療后下降，進(jìn)一步對(duì)cfDNA、LL-37和DNaseⅠ行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)其中cfDNA與EMPs、vWF和PDMP水平均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.500、0.645、0.552（均P＜0.001），與DNaseⅠ則成負(fù)相關(guān)（r=-0.660，P＜0.001），提示NETs途徑參與了KD重要的血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、血小板活化等的血管炎性反應(yīng)。

綜上可見(jiàn)，KD急性期中性粒細(xì)胞激活后在體內(nèi)形成過(guò)多的NETs，同時(shí)DNaseⅠ等對(duì)其降解能力下降導(dǎo)致NETs水平異常升高，從而參與冠狀動(dòng)脈等血管內(nèi)皮免疫炎性損傷，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，丙種球蛋白可能在該方面發(fā)揮了重要的藥理作用。本研究樣本量雖偏少，但關(guān)注的是急性期，結(jié)合NETs生成特點(diǎn)，仍可提示急性期KD患者血循環(huán)中NETs成分對(duì)病情判斷是一個(gè)值得臨床重視的生物標(biāo)志物和重要的治療靶點(diǎn)。由于現(xiàn)在臨床上對(duì)KD的重視，多能及早識(shí)別和規(guī)范治療，本研究中重癥病例少，在更多分層研究和更長(zhǎng)時(shí)間隨訪監(jiān)測(cè)方面存在不足，有待進(jìn)一步擴(kuò)大研究以明確結(jié)論并闡明其分子機(jī)制，以期開(kāi)發(fā)出更有針對(duì)性的治療方法。

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收稿日期：2024-07-20