摘要:脫水素(dehydrin,DHN)作為一種高親水性蛋白,在植物響應(yīng)各種生物、非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究在馬鈴薯基因組中鑒定出7個(gè)StDHNs基因,不均勻地分布在3條染色體上,編碼氨基酸數(shù)目為80-243 aa,內(nèi)含子數(shù)目均為1;StDHNs蛋白分子量在8.54 - 25.12 kDa之間,等電點(diǎn)為5.24- 7.38,共3個(gè)保守motifs,保守基序及進(jìn)化關(guān)系分析表明StDHN家族成員在進(jìn)化上具有高度的保守性。轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析結(jié)果顯不,StDHN5、StDHN6、StDHN7在特定逆境脅迫下顯著高表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)模式分析表明,StDHN5、StDHN6受到鹽和ABA脅迫的顯著誘導(dǎo),StDHN7響應(yīng)干旱脅迫。本研究結(jié)果可為深入研究馬鈴薯DHN基因家族的功能及其在逆境脅迫抗性中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
關(guān)鍵詞:馬鈴薯;DHN基因家族;生物信息學(xué)分析;表達(dá)分析
中圖分類號(hào):S532:Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2024) 10-0018-08
胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesisabundant proteins,LEA蛋白)是生物體中廣泛存在的一類與滲透調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白,該類蛋白的編碼基因在植物種子胚胎發(fā)育晚期表達(dá)量豐富,而且在環(huán)境脅迫如干旱、低溫、鹽脅迫和ABA等條件下其mRNA會(huì)大量累積。積累親水性蛋白是植物應(yīng)對(duì)細(xì)胞脫水的主要途徑,脫水素(de-hydrin,DHN)是一種植物中廣泛存在的高親水性蛋白,屬于LEA第二家族成員,被稱為L(zhǎng)EADⅡ蛋白,也稱響應(yīng)脫落酸(abscisic acid-respon-sive,RAB)蛋白或水脅迫蛋白(water stress pro-tein,WSP),并廣泛存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、液泡、線粒體和葉綠體等植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。
近年來(lái)脫水素基因的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注,在擬南芥、小麥、水稻、大豆、枇杷、蘋果和葡萄,等植物中均有報(bào)道,大量的DHNs參與了植物對(duì)冷、熱、鹽和干旱等脅迫的響應(yīng)。在番茄中過(guò)表達(dá)雪蓮SiDHN基因,可抑制細(xì)胞膜損傷,促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性;在干旱脅迫下,過(guò)表達(dá)脫水素基因MtCAS31可以降低苜蓿根系的導(dǎo)水率,從而減少水分流失,提高植株抗旱性:ABA處理后,過(guò)表達(dá)OsDhn-Rab16D基因的水稻植株莖和根比野生型更長(zhǎng),說(shuō)明脫水素對(duì)ABA作出響應(yīng),解除了ABA對(duì)植物根和莖生長(zhǎng)的抑制作用:沉默辣椒脫水素基因CaDHN4會(huì)降低辣椒對(duì)低溫和鹽脅迫的耐受性,而在擬南芥中過(guò)表達(dá)CaDHN4基因則可以保護(hù)擬南芥免受寒冷和鹽脅迫的影響。
馬鈴薯是一種重要的糧食、經(jīng)濟(jì)作物,是世界第四大主要糧食作物,富含碳水化合物、維生素和礦物質(zhì),被廣泛用于食品中。馬鈴薯在全球范圍內(nèi)廣泛種植,其生產(chǎn)和供應(yīng)對(duì)世界糧食安全具有重要戰(zhàn)略意義。但馬鈴薯在逆境環(huán)境下的生長(zhǎng)能力有限,嚴(yán)重影響其產(chǎn)量,因此,進(jìn)行抗逆育種研究以提高其適應(yīng)性和產(chǎn)量具有重要意義。DHN基因家族在植物的逆境適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,但有關(guān)馬鈴薯DHN基因家族的研究較少。本研究從馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)中鑒定出其DHN基因家族成員,并利用生物信息學(xué)方法結(jié)合熒光定量PCR進(jìn)行鑒定與分析,以期為深入研究該家族基因的功能及馬鈴薯抗逆育種奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 馬鈴薯DHN基因家族鑒定
馬鈴薯的基因組數(shù)據(jù)來(lái)自http://www. bioin-formaticslab. cn/pubs/dm8。同時(shí)從Pfam下載DHN保守結(jié)構(gòu)域(PF00257)的隱馬爾可夫模型,并以該結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)作為種子模型,通過(guò)HM-MER檢索確定馬鈴薯DHN基因家族成員。
1.2 生物信息學(xué)分析
利用生物信息學(xué)分析軟件(表1)對(duì)馬鈴薯DHN基因家族成員進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析、進(jìn)化關(guān)系分析及染色體定位分析。
1.3 轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析
從Spud DB(http://spuddb.uga.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載DHN基因表達(dá)特征的RNA-seq數(shù)據(jù)集并進(jìn)行分析。該數(shù)據(jù)集包含生物脅迫處理(病毒感染)和非生物脅迫處理(鹽、甘露醇、β-氨基丁酸、苯并噻二唑、脫落酸、生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、高溫)及馬鈴薯不同組織(萼片、葉、根、芽、愈傷組織、匍匐莖、塊莖、花、葉柄、花瓣、雄蕊、心皮、果實(shí))的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)錄本豐度用FPKM值表示。將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)利用TBtools進(jìn)行熱圖展示,分析DHNs基因在不同逆境脅迫條件及不同組織中的表達(dá)特征。
1.4 馬鈴薯DHNs基因的表達(dá)模式分析
脅迫處理試驗(yàn)于2023年8月進(jìn)行。將培養(yǎng)20 d的馬鈴薯DMI-3組培苗轉(zhuǎn)移至1/2MS液體培養(yǎng)基中適應(yīng)生長(zhǎng)一周后,進(jìn)行脅迫處理。共設(shè)置150 mmol/L NaCl脅迫、260 μmol/L甘露醇模擬干旱脅迫、50 μmol/L脫落酸(ABA)及35℃高溫脅迫4種處理,每個(gè)處理4次重復(fù),分別在處理o、3、24 h取樣,液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。使用Vazyme公司的FastPure@ Universal Plant TotalRNA Isolation Kit試劑盒提取總RNA,然后用Vazyme公司的HiScrip@Ⅲ lst Strand cDNA SynthesisKit (+gDNA wiper)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
根據(jù)候選基因的CDS序列,利用NCBI的Primer- BLAST設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT -qPCR)引物(表2)。RT - qPCR反應(yīng)體系共20μL,包含2 X SYBR qPCR Mix 10 μL、cDNA 2 μL、上游和下游引物各0.4 μL、RNase Free H2O 7.2μL。RT-qPCR反應(yīng)在Roche Light Cycler96熒光定量PCR儀中進(jìn)行,反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min;94℃10 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次,并且以GAPD日基因?yàn)閮?nèi)參基因,按照富含酸性氨基酸。
2 結(jié)果與分析
2.1 馬鈴薯DHN基因家族鑒定和編碼蛋白的理化性質(zhì)分析
根據(jù)DHN保守結(jié)構(gòu)域(PF00257),在馬鈴薯基因組中檢索鑒定出7個(gè)DHNs基因,參照基因在染色體上的位置,將其依次命名為StDHNl -StDHN7(表3)。對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),StDHN4蛋白質(zhì)最短(80個(gè)氨基酸),StDHN1最長(zhǎng)(243個(gè)氨基酸),7個(gè)StDHNs蛋白質(zhì)平均長(zhǎng)度為156.14個(gè)氨基酸:分子量最小的為StDHN4(8.54 kDa),最大的為StDHN1(25. 12kDa),平均分子量為16.78 kDa;等電點(diǎn)(pI)最小為5.24(StDHN7),最大為7.38 (StDHN1),平均等電點(diǎn)為6.47,其中57.14%的StDHNs蛋白pI小于7,說(shuō)明馬鈴薯DHN基因家族編碼的多數(shù)蛋白
2.2 馬鈴薯DHN家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析
&DHN家族成員的基因結(jié)構(gòu)如圖1a所示,均只有1個(gè)內(nèi)含子,其中&DHN3和&DHN7的序列較長(zhǎng),超過(guò)1 000 bp。而&DHN2的序列最短,在500 bp左右。StDHN家族蛋白共有3個(gè)保守mo-tif基序(圖1b、c),分別為S片段(RSSSSSSSSSEDDGEGCRRKK)、K片段(EKKGMMDKIKEKIPGHH)和Y片段(YGNPVRLTDEYCNPVQQT),這些保守motif是該家族的鑒定特征:但不同家族成員的保守motif數(shù)目與分布不同,StDHN4只含有S片段,StDHN2和StDHN7僅含有S和K片段,其余StDHN家族成員含有全部motifs。
2.3 馬鈴薯及不同物種DHNs的進(jìn)化關(guān)系分析
根據(jù)馬鈴薯DHN家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)可知,StDHNs被分為a、b兩大類,分別包含5個(gè)和2個(gè)家族成員。結(jié)合蛋白保守基序分析(圖1)發(fā)現(xiàn),進(jìn)化樹同一分支中的StDHN成員大多具有相似的motif組成,如b類分支中的兩個(gè)成員都含有motif1和motif2,而a類分支中除StDHN4外均含有motif1、motif2和motiB。
為揭示馬鈴薯DHNs與其他作物DHNs的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,構(gòu)建了馬鈴薯、擬南芥和水稻DHNs蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果(圖3)顯示,25個(gè)DHN成員被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共3組,馬鈴薯、擬南芥和水稻的DHNs在每組中均有涉及。Ⅱ、Ⅲ組分別有8個(gè)和7個(gè)成員,少于Ⅰ組所含成員數(shù)。Ⅰ組中大多數(shù)AtDHNs聚在一個(gè)分支,Ⅱ組中所有AtDHNs聚在一個(gè)分支,Ⅲ組中所有OsDHNs聚在一個(gè)分支,而StDHNs中只有StDHN3和StDHN4單獨(dú)成簇,推測(cè)這兩個(gè)成員發(fā)揮的功能相似且與其他StDHNs成員具有差異。
2.4 馬鈴薯DHN基因家族的染色體定位分析
由圖4可見(jiàn),7個(gè)&DHNs基因不均勻地分布在1、2、4號(hào)染色體上,1號(hào)染色體上分布有StDHN1、&DHN2,2號(hào)染色體上分布的基因最多(StDHN3、StDHN4、StDHN5、StDHN6),4號(hào)染色體上只有StDHN7 -個(gè)基因。
2.5 馬鈴薯DHN基因家族的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析
為了進(jìn)一步探究&DHN基因家族在馬鈴薯抵御逆境脅迫中的作用,利用已公布的馬鈴薯RNA-seq數(shù)據(jù)集,對(duì)&DHN家族成員在不同處理下的表達(dá)數(shù)據(jù)(FPKM值)進(jìn)行分析,結(jié)果(圖5)顯示。StDHN1、StDHN2、StDHN3、StDHN4在所有處理下均無(wú)明顯表達(dá),&DHN5表達(dá)活躍度一般,&DHN6在苯并噻二唑處理的葉片中、ABA及高溫脅迫下明顯高表達(dá),StDHN7在鹽脅迫及甘露醇模擬干旱脅迫下明顯高表達(dá),而在高溫脅迫下表達(dá)量明顯降低。同時(shí),由圖6可知,StDHN5、&DHN6、StDHN7主要在馬鈴薯根、塊莖及成熟的果實(shí)中表達(dá)。
2.6 馬鈴薯DHNs基因在逆境脅迫下的表達(dá)分析
基于轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果,通過(guò)qRT-PCR分析StDHN5、&DHN6、StDHN7基因在鹽、干旱、高溫脅迫及ABA處理下的表達(dá)情況,以進(jìn)一步驗(yàn)證它們?cè)隈R鈴薯抵御逆境脅迫中發(fā)揮的作用。結(jié)果(圖7)表明,StDHN5在ABA處理24 h、StDHN6在鹽脅迫和ABA處理24 h、&DHN7在干旱脅迫3h表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)表達(dá),特別是StDHN6基因在ABA處理24 h的表達(dá)量顯著上調(diào),其余條件下3個(gè)基因均下調(diào)表達(dá)。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),StDHN5在干旱和高溫脅迫下、&DHN7在4種處理下均表現(xiàn)為處理3h的表達(dá)量高于處理24 h的,而其余條件下3個(gè)基因的表達(dá)量則表現(xiàn)相反。3個(gè)基因間比較,&DHN7在干旱脅迫3h、StDHN6在鹽脅迫和ABA處理24 h的表達(dá)量明顯較高。除鹽脅迫和ABA處理下的&DHN7外,StDHN5、&DHN6、StDHN7基因在不同逆境脅迫下的RT-qPCR分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄表達(dá)結(jié)果基本一致。
3 討論與結(jié)論
干旱、鹽堿等非生物脅迫通常對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。DHN是一類能夠應(yīng)答逆境脅迫的親水性蛋白,具有穩(wěn)定細(xì)胞膜、結(jié)合金屬離子、作為分子伴侶等功能。目前,在園藝作物中鑒定到的DHN基因家族成員較多,其中蘋果有12個(gè),梨和獼猴桃各有7個(gè),葡萄和黃瓜各有4個(gè)。本研究從馬鈴薯全基因組中也鑒定到7個(gè)StDHN基因家族成員。
馬鈴薯DHN基因家族成員不均勻地分布在l、2、4號(hào)染色體上,均含有1個(gè)內(nèi)含子;編碼蛋白的氨基酸數(shù)目為80 - 243 aa,分子量為8.54 -25.12 kDa,等電點(diǎn)為5.24-7.38;不同成員的保守motif數(shù)目與分布不同,但處于系統(tǒng)進(jìn)化樹同一分支中的&DHNs基因具有相似的motif組成,證明了該基因家族進(jìn)化的保守性。此外,構(gòu)建了馬鈴薯、擬南芥和水稻DHNs的系統(tǒng)進(jìn)化樹,可分為3組,分別包含3、3、1個(gè)馬鈴薯DHNs蛋白,表明了馬鈴薯DHN家族成員之間的多樣性。
利用已公布的馬鈴薯RNA - seq數(shù)據(jù)集對(duì)StDHN基因家族成員進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析,結(jié)果表明只有StDHN5、StDHN6、StDHN7基因在脅迫中有明顯表達(dá),且主要在根、塊莖及成熟的果實(shí)中表達(dá),推測(cè)它們可能在馬鈴薯塊莖發(fā)育中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。目前已有一些植物的DHNs基因功能得到驗(yàn)證,通過(guò)調(diào)控這些基因的表達(dá)可提高植物的耐逆境脅迫能力。然而,馬鈴薯DHN基因家族及其在逆境脅迫響應(yīng)方面的研究還較少。本研究在轉(zhuǎn)錄組分析的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析了鹽、干旱、高溫脅迫及ABA處理下StDHN5、StDHN6、StDHN7基因在馬鈴薯幼苗中的表達(dá)模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn),StDHN5在鹽和ABA處理3h下調(diào)表達(dá),之后表達(dá)量上升,尤其在ABA處理24 h的表達(dá)量明顯上調(diào),但在干旱及高溫脅迫下均下調(diào)表達(dá),且表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì):StDHN6在鹽脅迫和ABA處理24 h顯著上調(diào)表達(dá),其余條件下均顯著下調(diào)表達(dá):&DHN7只在干旱處理3h上調(diào)表達(dá),其他脅迫處理下均下調(diào)表達(dá),且表達(dá)量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。綜合來(lái)看,StDHN5、&DHN6的RT-qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析結(jié)果基本一致,而StDHN7在鹽脅迫和ABA處理下的表達(dá)情況,RT-qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析結(jié)果存在差異,這可能是因?yàn)椋HN7基因的熒光表達(dá)受取樣部位的影響較大。
綜上,本研究從馬鈴薯基因組中鑒定出7個(gè)DHN家族基因,并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、轉(zhuǎn)錄組表達(dá)模式等進(jìn)行了分析,同時(shí)對(duì)其在不同脅迫處理下的表達(dá)模式進(jìn)行RT-qPCR分析,發(fā)現(xiàn)馬鈴薯DHN基因家族在響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用,這為今后進(jìn)一步開展馬鈴薯DHN家族基因的生物學(xué)功能及作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。
基金項(xiàng)目:山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(重大科技創(chuàng)新工程)項(xiàng)目(2022LZGC017)