摘要：為獲得抗白葉枯病和稻瘟病的水稻恢復系材料，選擇攜帶抗白葉枯病基因Xa23的抗病品系RF76及攜帶抗稻瘟病基因Pia的甬優(yōu)1540（F1）為供體材料，與多個優(yōu)良雜交水稻恢復系進行多代雜交和回交，在分離群體中利用分子標記輔助選擇和田間表型鑒定選擇相結合的方法，獲得70份農藝性狀穩(wěn)定且導入Pia、Xa23、Pia+Xa23目標基因的水稻恢復系。采用白葉枯病鑒別菌系P6對230份重點株系及其雜交組合進行抗性鑒定，所有材料在孕穗期都表現(xiàn)為抗白葉枯病。稻瘟病抗性鑒定結果表明，含Pia基因的恢復系及其配組的雜交稻組合稻瘟病抗性優(yōu)于親本材料RF76，均表現(xiàn)為中抗及以上。以此恢復系配置的雜交組合“華浙優(yōu)2473”參加浙江省單季秈稻雜交稻區(qū)試及生產試驗，農藝性狀表現(xiàn)良好，2年抗性鑒定結果顯示，稻瘟病和白葉枯病抗性均達到中抗以上。試驗結果表明，Pia和Xa23的導入，結合連續(xù)抗病試驗的篩選，獲得抗稻瘟病和白葉枯病的恢復系材料，將其用于配組雜交稻組合，在生產中具有良好的應用前景。

關鍵詞：水稻；分子標記；白葉枯?。坏疚敛。籔ia基因；Xa23基因

中圖分類號：S435.111.4+1；S435.111.4+7文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）11-0111-05

稻瘟病、白葉枯病是影響我國水稻生產的主要病害，每年都會發(fā)生不同程度的危害，在病害流行年份會導致水稻嚴重減產。稻瘟病是由稻瘟病菌引起的，發(fā)病嚴重時可導致50%以上減產，甚至造成部分區(qū)域絕產［1］。白葉枯病由水稻黃單胞桿菌水稻致病變種引起，在流行年份，發(fā)病地區(qū)一般減產20％～30％，嚴重的可達80％［2］。20世紀80—90年代，浙江省水稻白葉枯病發(fā)生較重，沉寂了近20年后，2014年發(fā)病又呈上升趨勢。2014—2016年，浙江省晚稻在生育后期發(fā)病點多、面廣，溫州、臺州、寧波、紹興、金華、麗水、衢州等地均有發(fā)生，局部呈現(xiàn)快速擴散蔓延之勢。據(jù)統(tǒng)計，全省2020年發(fā)病面積1.67萬hm2，2021年達到3.27萬hm2以上，個別地區(qū)危害尤其嚴重，臺州、金華、衢州等地已出現(xiàn)發(fā)病晚稻連片絕收現(xiàn)象，防控形勢十分嚴峻，對全省水稻安全生產構成嚴重威脅。

培育和推廣具有多種抗性的水稻品種是最經濟、有效、安全的病蟲害防治途徑［3］。近年來，關于水稻抗性基因的研究日益增多，截至目前，500多個數(shù)量性狀和100多個稻瘟病抗性基因已被鑒定出，38個抗病R基因被成功克隆，并且在稻瘟病抗性遺傳育種方面取得了巨大進展［4］。

Pia是日本水稻品種（愛知旭）所含有的抗病基因，先前研究表明，Pia的抗譜較窄，抗性效果較弱［5］。但研究表明，一些抗性效果較弱的抗病基因與其他抗病基因聚合在一起，可發(fā)揮重要的作用［6］。Okuyama等的研究進一步解釋了Pia基因的抗稻瘟病功能，是Pia內的SasRGA4和SasRGA5 2個基因長期平衡選擇的結果［7］。因此筆者所在課題組以Pia為靶基因，結合稻瘟病表型鑒定，篩選出聚合Pia抗病基因的材料。

目前已鑒定出42個抗白葉枯病基因［8］。Xa23基因在全生育期具有抗性廣譜、高抗性且抗性轉移效應強等特點，由章琦等于普通野生稻中鑒定而來，后育成了含Xa23近等基因系的CBB23［9］。基于CBB23開發(fā)的標記已被應用于水稻輔助選擇育種工作中，在水稻抗白葉枯病分子育種中有著廣闊的應用前景［10-12］。本研究利用水稻抗白葉枯病中間材料RF76對廣親和恢復系進行抗性改良，以期通過回交轉育技術和分子標記輔助選擇技術得到具有白葉枯病抗性基因Xa23的雜交水稻新恢復系。通過分子標記輔助選擇技術聚合多個抗病基因，培育抗性強的水稻新品種（組合），以期提高水稻綜合抗性水平。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供體親本：水稻抗白葉枯病中間材料RF76（含Xa23）。受體親本：廣親和恢復系甬優(yōu)1540（F1）。鑒定菌系：浙江省稻瘟病優(yōu)勢小種和水稻白葉枯病鑒別菌系P6，由浙江省農業(yè)科學院植物保護與微生物研究所提供。

Pia基因采用GFM標記進行檢測，正反引物序列分別為Pia-1F：5′-GCGACTGACACTTTCAATAGC-3′；Pia-1R：5′-CGGTAGAGCAATTTAGAAGCAG-3′［13］。

Xa23基因采用連鎖標記RM206進行檢測，正反引物序列分別為RM206-F：CCCATGCGTTTAACTATTCT；RM206-R：CGTTCCATCGATCCGTATGG［14］。

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR 檢測

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法［15］提取DNA。PCR反應體系：20 μL反應體積中包括2×PCR Mix 10 μL，10 μmol/L的正反引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，其余為ddH2O。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取6 μL PCR產物，采用3%瓊脂糖凝膠進行電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察、采集圖像。

1.2.2 田間接種鑒定

在水稻3葉1心期，采用噴霧式接種法進行稻瘟病接種，接種后保溫保濕7 d，調查發(fā)病情況；在水稻孕穗期采用人工剪葉法接種白葉枯病：用剪刀蘸取菌液后剪去約2 cm劍葉，每株剪4～5張葉片，接種后20 d調查發(fā)病情況，記載標準［16］見表1。

1.2.3 恢復系基因導入

2016年秋在嘉興市農業(yè)科學研究院試驗基地用含Xa23基因的自選中間材料RF76與含Pia基因的材料甬優(yōu)1540（F1代）以及多個優(yōu)良雜交水稻恢復系進行雜交、 復交及回交。成熟后將收獲的雜交種（F1代）于冬季帶至海南進行加代，同時利用抗性基因Pia的GFM標記、Xa23基因的RM206標記對植株進行初步篩選，結合田間接種結果選擇抗病植株混收（F2代種子），曬干后種植F2代，再根據(jù)檢測及接種結果從F2代群體中遴選到32個株系，經品質鑒定后保留13個株系（F3代）在冬季帶至海南進行加代；從其中5個系中遴選到21個株系，經抗性、品質鑒定保留其中9個株系（F4代）于嘉興市農業(yè)科學研究院試驗基地夏季種植，經過擇優(yōu)篩選到35個株系（F5代），擇優(yōu)16個株系繼續(xù)加代，此后每一代都進行分子標記輔助選擇及抗性鑒定，篩選出70份農藝性狀穩(wěn)定且含有Pia、Xa23、Pia+Xa23目標基因的水稻恢復系。以白葉枯病鑒別菌系P6對230份重點株系及其雜交組合進行抗性鑒定，所有材料在孕穗期都表現(xiàn)為抗白葉枯病。從F5代中優(yōu)選出一系列生長較整齊且豐產性好的株系與多個不育系制種測配，同時對該株系繼續(xù)加代提純，選擇優(yōu)良株系進行小面積制種。于2020年秋定名TF473的恢復系，與華浙2A所配組合定名為華浙優(yōu)2473，2年抗性鑒定稻瘟病和白葉枯病抗性均達到中抗以上。

2 結果與分析

2.1 抗性基因分子標記在抗感親本間的多態(tài)性分析

利用與稻瘟病抗性基因Pia連鎖的GFM標記、與白葉枯病抗性基因Xa23連鎖的RM206標記對不育系華浙2A、攜帶抗白葉枯病基因Xa23的恢復系供體親本RF76、攜帶抗稻瘟病基因Pia的恢復系供體親本甬優(yōu)1540（F1代）及部分中間選育材料進行多態(tài)性分析。結果（圖1）顯示，Pia基因的GFM標記在不育系華浙2A和Pia供體親本甬優(yōu)1540（F1代）中擴增出約150 bp的片段，而在RF76中擴增出約190 bp的片段，說明RF76中不含Pia基因?；騒a23的RM206標記在Xa23供體親本RF76中擴增出約120 bp的片段，而在受體材料甬優(yōu)1540（F1代）和不育系華浙2A中擴增出約170 bp的片段，說明甬優(yōu)1540（F1代）和不育系華浙2A均不含Xa23基因。Pia基因的GFM標記和Xa23基因的RM206連鎖標記在互為供受體的RF76與甬優(yōu)1540（F1代）間都具有明顯的多態(tài)性。

2.2 材料的抗性基因分子改良系創(chuàng)制

將含有Pia基因的親本甬優(yōu)1540（F1代）、含有Xa23基因的親本RF76分別與多個優(yōu)良雜交水稻恢復系進行雜交，并對F1代植株進行復交，聚合Pia和Xa23。利用抗性基因Pia和Xa23的基因標記對F2代植株進行檢測，選擇擴增出目的條帶且性狀優(yōu)良的植株，種植成F3，此后每一代都結合接種鑒定結果及分子標記進行選擇，直至得到純合的抗病品系。圖2為高世代材料的分子檢測結果。從圖2可以看出，經過幾代轉育，高世代材料基本都攜帶有抗病基因。經過配組得到一系列優(yōu)良的聚合Xa23和Pia基因的恢復系材料。

2.3 恢復系及雜交組合的抗病性檢測

苗期稻瘟病接種鑒定結果（表2）表明，Pia受體親本材料RF76對浙江的優(yōu)勢小種菌株表現(xiàn)為感病，而Pia供體親本甬優(yōu)1540（F1代）表現(xiàn)為抗?。话ɑ謴拖礣F465（R10）和TF473（R11）在內的11個穩(wěn)定材料對浙江省的優(yōu)勢小種菌株均表現(xiàn)為抗性，綜合抗性評價為抗病，表明Pia可用于該地區(qū)的稻瘟病抗性改良。對用恢復系TF465和TF473配組的雜交稻組合浙禾優(yōu)165、浙禾優(yōu)256、浙禾優(yōu)365、華浙優(yōu)2473進行接種鑒定，綜合抗性評價為抗病。

以白葉枯病鑒別菌系P6對重點株系及其雜交組合進行抗性鑒定，結果（表3）表明，除對照甬優(yōu)1540（F1代）及未檢測出Xa23基因的材料R9外，所有材料在孕穗期都表現(xiàn)抗白葉枯病。本研究利用Xa23基因通過回交轉育技術和分子標記輔助選擇技術對雜交水稻的骨干恢復系進行遺傳改良，得到具有白葉枯病抗性基因Xa23的雜交水稻新恢復系及雜交組合，并通過田間鑒定進一步驗證了標記RM206檢測的準確性。

3 討論與結論

培育推廣抗性品種是水稻病蟲害防治最經濟、環(huán)保、有效的措施。聚合多個抗病基因是水稻持久抗病的最有效方法［17］。研究表明，具有單一抗性基因的株系與同時含有2個抗性基因的抗性水平相當且農藝性狀與受體材料相比差異不顯著［18］。分子標記輔助育種能夠從基因層面進行直接選擇，是實現(xiàn)多個優(yōu)良性狀高效聚合的最佳手段之一［19］。潘曉飚等利用分子標記輔助選擇和田間鑒定選擇相結合的方法，獲得5個聚合抗稻瘟病基因及白葉枯病基因的改良系，對比試驗效果顯著［20］。倪大虎通過基因聚合復交，得到4個聚合Pi9、Xa21及Xa23 3個基因的株系，F(xiàn)2代群體分子標記輔助選擇準確率高達98%［21］。本研究選擇攜帶抗白葉枯病基因Xa23的抗病品系RF76及攜帶抗稻瘟病基因Pia的甬優(yōu)1540（F1代）為供體材料，與多個優(yōu)良雜交水稻恢復系進行多代雜交和回交，采用分子標記結合人工接種等鑒定方法快速聚合多個抗病基因，結果表明，聚合Xa23和Pia的恢復系及配組的雜交組合，對浙江省的稻瘟病、白葉枯病優(yōu)勢小種均有較好的綜合抗性水平。

近年來，Pia基因的GFM標記以及Xa23基因的連鎖標記RM206已成功運用到水稻的遺傳改良中，為本研究奠定了豐厚的基礎［13-14］。本研究中Pia基因的GFM標記和Xa23基因的RM206連鎖標記在互為供受體的RF76與甬優(yōu)1540（F1代）間都具有明顯的多態(tài)性，通過分子標記輔助選擇，篩選攜帶抗病基因的材料，經田間接種鑒定，結果高度一致。從而得到抗稻瘟病、白葉枯病的雜交稻新組合，并通過審定。進一步驗證了Pia基因的GFM標記以及Xa23基因的連鎖標記RM206選擇基因的適用性和準確性。

經過改良的恢復系與多個不育系進行測配，雜交組合對稻瘟病和白葉枯病均有較好的綜合抗性水平。多個組合已參加各級區(qū)試及生產試驗，其中華浙優(yōu)2473通過了浙江省審定，該組合抗白葉枯病、抗稻瘟病并且產量高、米質優(yōu)，在白葉枯病、稻瘟病頻繁高發(fā)的當下具有較好的發(fā)展前景。

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