摘要：為篩選新的防治黃瓜枯萎病的生防菌資源。從昆蟲體表及體內(nèi)分離昆蟲共生細(xì)菌，采用對峙法、生長速率法和盆栽法對分離的細(xì)菌進(jìn)行抑菌活性測定，篩選出具有較強抑菌活性的昆蟲共生菌，并對其抑菌機制進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明，從蠐螬和蟬幼蟲體表及體內(nèi)共分離得到104株細(xì)菌，獲得2株抑菌活性較好的昆蟲共生細(xì)菌QC02和QC04，其發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumebrium）的抑制率分別為56.03%、51.17%，盆栽防效分別為44.00%、47.00%；經(jīng)過初步鑒定，菌株QC02和QC04分別為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）和多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。2株共生細(xì)菌發(fā)酵濾液可顯著抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長、孢子萌發(fā)，并且可產(chǎn)生纖維素酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等多種胞外酶，含有表面活性素、伊枯草菌素、豐原素等脂肽類抗生素相關(guān)基因。結(jié)果表明，菌株QC02和QC04在防治植物病害方面具有較好的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌；多黏類芽孢桿菌；黃瓜枯萎病；抑菌活性；生防菌

中圖分類號：S436.421.1₊3" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）19-0143-08

收稿日期：2023-11-14

基金項目：天津市科技計劃項目（編號：21ZYCGSN00520）。

作者簡介：葉 敏（1996—），男，江蘇常州人，碩士研究生，從事微生物源農(nóng)藥研究與應(yīng)用。E-mail：3080508568@qq.com。

通信作者：田小衛(wèi)，博士，副教授，從事微生物源農(nóng)藥研究與應(yīng)用。E-mail：1267542@qq.com。

尖孢鐮刀菌在十大植物病原真菌中排名第五，可以引起多種植物的土傳病害，而黃瓜枯萎病是其中較為嚴(yán)重的一種，發(fā)病率一般為10%～30%，嚴(yán)重時可達(dá)70%，可以導(dǎo)致黃瓜幼苗死亡、減產(chǎn)并導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失^［1-2］。防治黃瓜枯萎病的方法多樣，包括培育抗病品種、嫁接、種子和土壤消毒、輪作或休耕、使用化學(xué)農(nóng)藥及利用拮抗微生物進(jìn)行生物防治。其中，常用和有效的方法是使用化學(xué)殺菌劑，但使用不當(dāng)會造成環(huán)境污染、病原菌抗藥性增強以及農(nóng)藥殘留威脅人類健康等嚴(yán)重問題^［3-4］。生物防治是一種環(huán)境友好型的防治方法，包括使用拮抗微生物、非致病性的病原菌以及其他可以激活寄主植物對病原體抗性的微生物及其制劑^［5］。

具有良好防效的菌株是生物防治重要的種質(zhì)資源，擴展篩選范圍是獲得這些菌株的重要途徑。為了尋找對黃瓜枯萎病有良好生物防治潛力的微生物，大量有潛力的菌株從植物根際、植物體內(nèi)和海洋中分離和篩選出來^［6-8］。而從動物體內(nèi)篩選的案例較少，尤其是從與植物有復(fù)雜相互作用的昆蟲體內(nèi)獲得生防微生物的情況較少^［9］。昆蟲消化道和表皮具有特殊的微生境，其中的微生物多種多樣，可以產(chǎn)生多種功能的生物活性物質(zhì)^［10-13］。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲共生微生物對植物病害具有生物防治功能。例如，從以色列葡萄黃化病媒介昆蟲Hyalesthes obsoletus中分離得到的1株Dylla樣細(xì)菌可以內(nèi)生定殖葡萄緩解植原體引起的葡萄黃化病^［14］。因此，動物源微生物也是生防微生物資源開發(fā)的重要方向之一。

本研究針對土傳真菌性病害黃瓜枯萎病，首次從地下昆蟲蠐螬和蟬幼蟲體表和腸道內(nèi)分離篩選具有良好生物防治潛力的菌株，并初步探討了其抑菌機制，為挖掘防治土傳真菌性病害的昆蟲共生細(xì)菌提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 共生細(xì)菌分離材料

分離材料為蠐螬和蟬幼蟲。蠐螬于2022年7月采集于安徽省蚌埠市禹會區(qū)高埂村（32°49″40′N，117°22″15′E）土壤中，而蟬幼蟲于2022年8月采集于天津農(nóng)學(xué)院東校區(qū)欒樹林（39°5″31′N，117°6″2′E）。所有樣品采集與處理過程中均佩戴手套操作。

1.1.2 供試病原菌

抑菌活性供試病原菌有尖孢鐮刀菌黃瓜專化型（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporum f.sp.niveum）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）、草莓疫霉菌（Phytophthora fragariae）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、茄鏈格孢菌（Alternaria solani）、蘿卜鏈格孢菌（Alternaria raphani）、蘋果殼囊孢菌（Cytospora mali），均保存于天津農(nóng)學(xué)院植物病理實驗室。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨固體（NA）培養(yǎng)基用于共生細(xì)菌的分離培養(yǎng)，牛肉膏蛋白胨液體（NB）培養(yǎng)基用于共生細(xì)菌發(fā)酵；常規(guī)和濃縮馬鈴薯葡萄糖固體（PDA）培養(yǎng)基用于病原真菌培養(yǎng)和抑菌活性測定，濃縮配方如下：去皮馬鈴薯20%、葡萄糖2%和瓊脂1.8%。

1.2 試驗方法

1.2.1 昆蟲共生細(xì)菌的分離

體表附生菌分離：使用無菌蒸餾水（SDW）沖洗昆蟲表面3次，去除表面的瞬時微生物，然后使用無菌濾紙擦干表皮。使用無菌棉拭子擦拭昆蟲背部、腹部各20次，每個拭子頭浸泡在10 mL 0.85%氯化鈉溶液中并渦旋。

腸道內(nèi)生細(xì)菌分離：蠐螬和蟬幼蟲腸道解剖后置于研缽中，加入生理鹽水研磨。使用相同的溶液分別將昆蟲拭子浸泡液和腸道研磨液稀釋100、1 000倍，取100 μL稀釋液涂布到NA平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取具有明顯特征的菌落，純化2次后4 ℃保存。

1.2.2 拮抗細(xì)菌的篩選

采用對峙法篩選對黃瓜枯萎病菌具有抑菌活性的細(xì)菌。將細(xì)菌接種至NB培養(yǎng)基于37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng) 4 d 的黃瓜枯萎病菌上挑取直徑6 mm的菌絲塊放置PDA平板的中心，將20 μL 10₉ CFU/mL細(xì)菌發(fā)酵液劃線涂布于距離菌絲塊2 cm處，28 ℃黑暗培養(yǎng) 4 d。試驗重復(fù)3次。菌絲生長的抑制率（GI）計算公式為：GI=［（R - r）/R］×100%；其中，R表示細(xì)菌遠(yuǎn)端的真菌菌落徑向距離，r表示細(xì)菌近端的真菌菌落徑向距離。

1.2.3 對其他植物病菌的抑菌活性測定

采用生長速率法，測定對黃瓜枯萎病菌具有拮抗作用的細(xì)菌。將具有活性的細(xì)菌發(fā)酵后，發(fā)酵液采用 0.22 μm 濾芯過濾后按1 ∶5（體積比）加入融化降溫的PDA培養(yǎng)基中混勻并倒平板。將培養(yǎng)好的病原菌打成直徑為6 mm的菌餅倒接于平板中，使有菌絲面朝下。28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后檢查結(jié)果，測定菌落直徑，計算抑制率。

1.2.4 盆栽試驗 對黃瓜種子表面消毒后，浸入50～60 ℃溫水中5～6 h，然后播種至含有營養(yǎng)土的盆缽中，待幼苗生長至2葉期接種黃瓜枯萎病菌，孢子濃度為10₇ CFU/mL。

預(yù)防處理：將2葉期的黃瓜幼苗從盆缽中取出，使用消毒后的剪刀輕微傷根。使用50 mL 10₈ CFU/mL 拮抗細(xì)菌發(fā)酵液進(jìn)行土壤灌根處理。在用細(xì)菌處理72 h后，灌根接種30 mL黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液。

治療處理：對2葉期黃瓜幼苗傷根后，使用 30 mL 黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液灌根。72 h后，使用50 mL 10₈ CFU/mL細(xì)菌發(fā)酵液灌根。使用無菌蒸餾水代替細(xì)菌發(fā)酵液作為對照。將黃瓜植株置于25 ℃溫室中培養(yǎng)。每個處理5株黃瓜，重復(fù)4次。

接種處理后14、21 d，參考Cao等的方法評估每種植物的外部癥狀：0級，無枯萎或黃化；1級，子葉黃化；2級，子葉萎蔫；3級，第1張真葉枯萎；4級，第2～3張真葉枯萎；5級，所有葉片枯萎或死亡^［15］。疾病嚴(yán)重程度指數(shù)（DSI）：DSI =∑ （等級×該等級的植物數(shù)量）/（5×評估植物總數(shù)）×100。相對防治效果=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

1.2.5 拮抗細(xì)菌對病原菌的影響

對菌絲生長的抑制：如“1.2.3”節(jié)中所述制備細(xì)菌發(fā)酵濾液，與濃縮PDA培養(yǎng)基混合稀釋成2、4、6、8倍并倒平板。在平板中心接種直徑6 mm的黃瓜枯萎病菌菌絲塊，28 ℃黑暗培養(yǎng)。使用馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）代替發(fā)酵濾液作為對照，每個處理重復(fù)3次。4 d后觀察并測量黃瓜枯萎病菌菌落直徑，計算抑制率。

對分生孢子萌發(fā)的抑制：如“1.2.3”節(jié)中所述制備細(xì)菌發(fā)酵濾液，使用PDB稀釋2、4、10倍。將100 μL 10₆ CFU/mL黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液離心取沉淀，加入100 μL細(xì)菌發(fā)酵濾液，混勻后28 ℃孵育24 h。使用PDB培養(yǎng)基作為對照，每個處理重復(fù)3次。通過光學(xué)顯微鏡觀察100個分生孢子的萌發(fā)情況計算孢子萌發(fā)率。

對菌絲形態(tài)的影響：觀察細(xì)菌處理后的黃瓜枯萎病菌的菌絲形態(tài)變化，使用稍加修改的載玻片培養(yǎng)技術(shù)^［16］。向裝有載玻片的培養(yǎng)皿中倒入融化的馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基，厚度超過載玻片1 mm。待平板冷卻凝固后，在平板底面標(biāo)記出載玻片中心點作為黃瓜枯萎病菌接種位置，從這一點向兩邊偏移1 cm處標(biāo)記出細(xì)菌接種位置和對照點。挑取黃瓜枯萎病菌菌絲接種在中心點，在細(xì)菌接種位置接種2 μL 10₉ CFU/mL細(xì)菌發(fā)酵液，干燥后于28 ℃培養(yǎng)。待病原菌菌落邊緣生長接近對照點，取出載玻片并使用0.01%臺盼藍(lán)-乳酸苯酚溶液或0.5%中性紅溶液染色病原真菌，使用光學(xué)顯微鏡觀察病原真菌菌絲形態(tài)變化。

1.2.6 生防相關(guān)基因和胞外酶的檢測

采用特異性引物（表1），對拮抗細(xì)菌基因組中編碼伊枯草菌素、桿菌肽、豐原素、多黏菌素、殺鐮孢菌素等脂肽類抗生素和Yndj蛋白、表面活性素、纖維素酶、葡聚糖酶等抑菌代謝物的生物合成基因進(jìn)行檢測^［17-18］。擴增體系（25 μL）：ddH₂O 8.5 μL、上下游引物各1.0 μL、模板2.0 μL、2×Easy Taq MasterMix（+Dye） 12.5 μL。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用表1中的前6對引物分別對QC02進(jìn)行PCR擴增，擴增條件為預(yù)變性94 ℃ 4 min；變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s（引物110F/110R、147F/147R、ITUCF1/ITUCR3、ituD2F/ituD2R、bamC2F/bamC2R）或60 ℃ 30 s（引物ysnEf/ysnEr），72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。使用表中的后8對引物分別對QC04進(jìn)行PCR擴增，擴增條件為預(yù)變性94 ℃ 4 min；變性 94 ℃ 40 s，退火56 ℃ 40 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。

通過胞外酶檢測平板檢測拮抗細(xì)菌分泌的生防功能胞外酶^［19-24］。細(xì)菌37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)，分別取5 μL發(fā)酵液滴加或劃線接種在纖維素酶、葡聚糖酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、果膠酶和淀粉酶檢測平板上，2 d后觀察是否有透明圈產(chǎn)生。

1.2.7 菌株鑒定

使用EasyPure@ Bacteria Genomic DNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司），按照說明書提取拮抗細(xì)菌基因組。使用NanoDrop 1 000 UV-VIS超微量紫外分光光度計測定基因組DNA的濃度和純度，并將濃度調(diào)整為50.0 ng/μL。利用細(xì)菌通用引物27F和1492R擴增拮抗細(xì)菌的16S rDNA，約1 400 bp。擴增體系與“1.2.6”節(jié)相同。擴增條件為預(yù)變性94 ℃ 4 min；變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶單一后送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。利用BLAST程序與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的序列進(jìn)行比對分析。選擇合適的比對序列，通過MEGA 7.0軟件進(jìn)行Clustal W對齊，利用鄰接樹法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用R 4.1.2進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行各試驗組間差異顯著性檢驗（ɑ=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的篩選

從昆蟲樣品中共分離出共生細(xì)菌104株，包括50株蠐螬腸道內(nèi)生細(xì)菌、41株蟬幼蟲腸道內(nèi)生細(xì)菌和13株蟬幼蟲表皮附生細(xì)菌。通過對峙培養(yǎng)篩選出2株拮抗活性較強的菌株QC02和QC04，均為蠐螬腸道內(nèi)生細(xì)菌，對黃瓜枯萎病菌菌絲生長抑制率分別為56.03%、51.17%（圖1）。

由圖2可知，菌株QC02和QC04具有廣譜的抑菌活性，對供試的8種植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，對蘋果腐爛病菌的抑菌活性最強，抑制率分別為73.02%、68.94%。

2.3 盆栽試驗

菌株QC02和QC04對黃瓜枯萎病的盆栽防治效果如表2所示。感染黃瓜枯萎病菌的黃瓜植株在接種后14 d發(fā)病嚴(yán)重，呈現(xiàn)泛黃和枯萎癥狀，21 d全部枯萎。菌株QC02治療和預(yù)防處理的黃瓜在接種后21 d的相對防效分別為35.00%和44.00%，而菌株QC04治療和預(yù)防處理的黃瓜在接種后21 d的相對防效分別為27.00%和47.00%。總體來看，菌株QC02對黃瓜枯萎病的治療效果最好，菌株QCO4預(yù)防處理后可有效緩解黃瓜枯萎病的發(fā)生。

2.4 拮抗細(xì)菌對黃瓜枯萎病菌的影響

2.4.1 對菌絲生長的影響

稀釋2倍的菌株QC02和QC04發(fā)酵濾液可抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長，抑制率分別為85.19%、57.20%（圖3）。隨著稀釋倍數(shù)的增加，病原菌菌絲生長抑制率下降，稀釋8倍的菌株QC02發(fā)酵濾液的抑菌率仍可達(dá)45.76%。

2.4.2 對孢子萌發(fā)的影響

稀釋2倍的菌株QC02發(fā)酵濾液對黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)具有較強的抑制效果，抑制率為70.51%，而菌株QC04發(fā)酵濾液的抑制率僅為27.90%（圖4）。隨著稀釋倍數(shù)的增加，菌株QC02發(fā)酵濾液的抑制率下降，稀釋10倍后與菌株QC04發(fā)酵濾液抑制率無顯著差異。

2.4.3 對菌絲形態(tài)的影響 菌株QC02（圖5-A、圖5-B）和QC04（圖5-C、圖5-D）對峙培養(yǎng)的黃瓜枯萎病菌菌絲變細(xì)、縮短和變形。靠菌株QC04一側(cè)的菌絲被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色，中性紅染成微紅色，表明菌株QC04對黃瓜枯萎病菌具有殺菌活性而不是抑菌活性。

2.5 生物防治相關(guān)基因及酶的檢測

應(yīng)用特異性引物，對菌株QC02和QC04基因組進(jìn)行PCR擴增。擴增結(jié)果表明，菌株QC02具有表面活性素、Yndj蛋白、伊枯草菌素、桿菌肽、豐原素和IAA合成酶基因，菌株QC04具有多黏菌素、殺鐮孢菌素、纖維素酶和β-1，3-葡聚糖酶酶等生防物質(zhì)合成酶基因（圖6）。通過胞外酶檢測培養(yǎng)基上透明圈的觀察發(fā)現(xiàn)2種細(xì)菌可分泌葡聚糖酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和淀粉酶等重要的真菌細(xì)胞壁降解酶（圖7）。

2.6 昆蟲拮抗共生細(xì)菌的鑒定

菌株QC02和QC04的16s rDNA序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對，與芽孢桿菌屬物種相似性達(dá)99.7%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，2株細(xì)菌分別與貝萊斯芽孢桿菌、多黏類芽孢桿菌屬菌株聚在同一分支（圖8）。因此，將菌株QC02和QC04初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）和多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。

3 討論與結(jié)論

本研究從蠐螬腸道中篩選出的細(xì)菌QC02和QC04對黃瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、小麥根腐病菌、黃瓜灰霉病菌、草莓灰霉病菌、番茄早疫病菌、蘿卜黑斑病菌和蘋果腐爛病菌等8種病原真菌表現(xiàn)出較強的拮抗活性，抑菌率在50%以上。經(jīng)初步鑒定，菌株QC02和QC04分別屬于貝萊斯芽孢桿菌和多黏類芽孢桿菌。

芽孢桿菌的抑菌活性與其代謝產(chǎn)物具有密切的聯(lián)系，許多芽孢桿菌如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等可通過非核糖體途徑產(chǎn)生各種脂肽類抗生素抑制病原真菌^［25-26］。例如，解淀粉芽孢桿菌SQR9產(chǎn)生豐原素和桿菌肽可有效防治黃瓜枯萎病^［27］。通過PCR檢測，發(fā)現(xiàn)菌株QC02和QC04具有多種脂肽類抗生素合成相關(guān)基因。除此之外，分泌胞外酶在芽孢桿菌破壞真菌細(xì)胞壁發(fā)揮抑菌作用的過程中起到重要作用。Yang等從油菜根際土壤中篩選得到的多黏類芽孢桿菌HX-140可以產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶和抗真菌揮發(fā)性有機化合物，有效降低黃瓜枯萎病55.6%的侵染率^［28］。多黏類芽孢桿菌P.SC09-21菌株能產(chǎn)生抑制辣椒疫霉的蛋白酶，且處理后黃瓜的PR蛋白基因cap4和CaChi2的表達(dá)水平也有所提高^［29］。納豆芽孢桿菌tk-1脂肽類生物表面活性劑被證明在抗腫瘤、抗菌、抗凝和降膽固醇方面效果顯著^［30］。本研究篩選的菌株QC02和QC04均可產(chǎn)生纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶，能夠抑制病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，其作用機制及代謝產(chǎn)物還需進(jìn)一步分析和研究。

盆栽試驗結(jié)果表明，使用菌株QC02和QC04發(fā)酵液的預(yù)防效果分別為44.00%、47.00%，與已報道的幾種生防菌株防效相似或者更高。以Streptomyces albospinus CT205菌為例，2011年和2012年的黃瓜枯萎病防治效果分別為8.7%和51.9%^［31］。菌株QC02的治療效果超過QC04，這與其發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌的抑制作用相一致。另外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)多黏類芽孢桿菌WLY78產(chǎn)生的殺鐮刀菌素能夠激活黃瓜的系統(tǒng)抗性^［32］。菌株QC04的預(yù)防效果超過QC02，可以推測QC04生防效果不僅與發(fā)酵液抑菌活性相關(guān)，而且與其誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性相關(guān)。因此，菌株QC04對黃瓜的誘導(dǎo)抗性有待進(jìn)一步研究。

本研究篩選的2株昆蟲共生細(xì)菌對黃瓜枯萎病的防治均有一定的效果，后期可通過發(fā)酵條件優(yōu)化、作用機制及制劑研制等方面進(jìn)行深入研究，充分挖掘菌株的深層生防潛力，有望進(jìn)一步研發(fā)生防菌劑應(yīng)用于黃瓜生產(chǎn)中。

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