摘要：茶樹具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而低溫脅迫不僅會(huì)影響茶葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，還會(huì)導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益下降，因此茶樹抗低溫育種研究迫在眉睫。稀有冷誘導(dǎo)（RCI2）基因是一類與低溫脅迫密切相關(guān)的基因，目前有關(guān)茶樹低溫脅迫的研究并不太多，本研究團(tuán)隊(duì)首次通過(guò)生物信息學(xué)手段從茶樹基因組中鑒定出11個(gè)RCI2基因，并對(duì)基因的氨基酸序列、保守結(jié)構(gòu)域及啟動(dòng)子順式作用元件和低溫脅迫表達(dá)模式等進(jìn)行分析。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)和基序分析，發(fā)現(xiàn)茶樹RCI2基因結(jié)構(gòu)高度保守；啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果顯示，大部分茶樹RCI2基因含有如ARE、ABRE等與抗逆相關(guān)的啟動(dòng)子順式作用元件，相關(guān)基因可能具有較強(qiáng)的抗應(yīng)激能力并參與復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。低溫脅迫下基因的轉(zhuǎn)錄豐度分析結(jié)果顯示，CsRCI2B、CsRCI2D、CsRCI2I和CsRCI2J都受到低溫誘導(dǎo)表達(dá)，而qRT-PCR分析結(jié)果顯示，CsRCI2B、CsRCI2J在低溫脅迫下6 h、7 d時(shí)的表達(dá)量顯著升高，CsRCI2I在低溫脅迫下7 d時(shí)的表達(dá)顯著受到抑制，表明上述3個(gè)基因可能參與低溫脅迫響應(yīng)途徑。通過(guò)突變位點(diǎn)數(shù)量統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，CsRCI2B、CsRCI2I和CsRCI2J的變異位點(diǎn)分別有90、96、79個(gè)，突變位點(diǎn)遠(yuǎn)少于大部分基因，表明這些基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可能在進(jìn)化過(guò)程中規(guī)避了有害突變并在茶樹體內(nèi)發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果初步證實(shí)，茶樹CsRCI2B、CsRCI2I和CsRCI2J響應(yīng)低溫脅迫并具有潛在的重要作用，也為后續(xù)茶樹抗逆育種研究提供參考信息和信息支撐。

關(guān)鍵詞：茶樹；RCI2基因；低溫脅迫；突變；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：Q786；S794.4" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）19-0057-07

收稿日期：2024-04-09

基金項(xiàng)目：信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院林學(xué)院/信陽(yáng)市林木遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：張畢陽(yáng)（1986—），男，河南信陽(yáng)人，博士，講師，研究方向?yàn)椴莸厣锒鄻有?。E-mail：175332224@qq.com。

通信作者：李文楊，碩士，副教授，研究方向?yàn)榻?jīng)濟(jì)林豐產(chǎn)栽培及逆境生理研究。E-mail：wylee126@126.com。

低溫脅迫是影響作物產(chǎn)量的重要因素，茶樹經(jīng)受低溫脅迫后，會(huì)大大限制其產(chǎn)量。其次，伴隨著環(huán)境的變化，茶樹不僅會(huì)逐漸適應(yīng)，而且由于環(huán)境變化通常對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖造成壓力，也會(huì)促使植物在適應(yīng)過(guò)程中推動(dòng)本身的進(jìn)化^［1］。在非生物脅迫中，溫度及干旱脅迫具有更大的普遍性，相關(guān)研究更有意義，目前普遍認(rèn)為，非生物脅迫會(huì)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育并導(dǎo)致植物在分子層面的基因表達(dá)發(fā)生變化^［2］。為了更好地分析植物內(nèi)在的基因進(jìn)化情況，可以通過(guò)高通量測(cè)序分析植物基因是否發(fā)生變異以及用K_a/K_s（氨基酸替代率與同義替代率的比值）衡量基因演化過(guò)程中的選擇壓力，從而進(jìn)一步分析植物在非生物脅迫下是否會(huì)發(fā)生進(jìn)化^［3-4］。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，基因的插入與缺失、SNP和InDel在植物中可以對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生影響，這可能導(dǎo)致植物性狀發(fā)生變化^［5-6］。基因的突變以及插入和缺失可以影響基因的功能、調(diào)控區(qū)域、表達(dá)水平等，從而影響植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、抗病性等性狀^［7-8］。結(jié)合以上方法，可以在分析時(shí)結(jié)合基因的功能、進(jìn)化壓力和物種間的差異，以更全面地理解基因演化的動(dòng)力學(xué)^［9］。

稀有冷誘導(dǎo)（RCI2）基因是一類高度保守并高度疏水的小分子蛋白質(zhì)編碼基因，一般認(rèn)為它們具有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TMDs），同時(shí)大部分RCI2基因具有親水性C端尾部，目前已知它們與非生物脅迫密切相關(guān)。RCI2基因最初在小麥草中發(fā)現(xiàn)，起初由于在小麥草中響應(yīng)早期鹽脅迫誘導(dǎo)而被命名為ESI3^［10］。目前關(guān)于RCI2基因的研究已經(jīng)涉及較多植物，如擬南芥、玉米和小麥等，從其結(jié)構(gòu)到功能及機(jī)制探究等都有相關(guān)報(bào)道^［11-13］。關(guān)于RCI2基因，Rocha已對(duì)其表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)論述^［14］，不僅分析了其在不同物種中具有多功能性，如AtRCI2A、AtRCI2B可能在低溫或其他環(huán)境條件導(dǎo)致的水分脅迫下作為膜蛋白穩(wěn)定劑參與植物應(yīng)對(duì)低溫脅迫的途徑^［15］；經(jīng)過(guò)藥理學(xué)過(guò)程處理后進(jìn)行活細(xì)胞成像發(fā)現(xiàn)，RCI2基因?qū)囟让{迫具有獨(dú)特的特征，推測(cè)RCI2基因在不同溫度變化下的表達(dá)翻譯具有很大動(dòng)態(tài)變化。上述研究得出結(jié)論，RCI2主要參與非生物脅迫中與溫度相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。AtRCI2A、AtRCI2B可能在低溫或其他環(huán)境條件導(dǎo)致的水分脅迫下作為膜蛋白穩(wěn)定劑。此外，最近有報(bào)道顯示，RCI2基因通過(guò)FM464、NaCl等藥理學(xué)過(guò)程進(jìn)行活細(xì)胞成像，使RCI2基因?qū)囟让{迫具有獨(dú)特的應(yīng)對(duì)特征^［16-17］。因此，研究RCI2基因在冷熱等不同應(yīng)力條件下的動(dòng)態(tài)變化，可能為RCI2依賴的應(yīng)力耐受性提供新的機(jī)制。結(jié)合RCI2基因的功能分析，推測(cè)基因在植物非生物脅迫下的表達(dá)發(fā)生變化，植物在長(zhǎng)期生長(zhǎng)過(guò)程中，大多數(shù)基因不僅會(huì)在短期應(yīng)激非生物脅迫，也會(huì)對(duì)反反復(fù)復(fù)的脅迫產(chǎn)生記憶，進(jìn)而進(jìn)行一場(chǎng)長(zhǎng)期的應(yīng)答過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，植物接受了大量外部壓力，從而會(huì)使植物發(fā)生基因突變，進(jìn)而進(jìn)化。在研究中，通常需要結(jié)合更多試驗(yàn)和數(shù)據(jù)，如表達(dá)譜、功能試驗(yàn)和突變分析，以全面理解基因的演化、表達(dá)和功能之間的關(guān)系。

茶樹［Camellia sinensis（L.） O. Ktze.］原產(chǎn)于東亞，目前在世界范圍內(nèi)廣泛種植，茶含有多酚類化合物和咖啡堿等，同時(shí)兼具抗氧化、抗衰老、治療疾病等多種醫(yī)學(xué)功效，因而深受大眾喜愛(ài)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。非生物脅迫會(huì)影響茶樹的產(chǎn)量、質(zhì)量^［18-19］。本研究基于對(duì)茶樹中RCI2基因的首次鑒定分析，并進(jìn)行進(jìn)化分析/選擇壓力分析和非生物脅迫下的表達(dá)模式分析，同時(shí)參考數(shù)據(jù)庫(kù)，分析基因在進(jìn)化過(guò)程中氨基酸的插入與缺失，深度解析茶樹基因在非生物脅迫下可能存在的進(jìn)化關(guān)系，以期為了解茶樹如何進(jìn)化及篩選抗逆性較強(qiáng)的茶樹品種提供支撐信息。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗(yàn)材料采自信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院教學(xué)實(shí)踐園，于2024年3月在實(shí)踐園區(qū)選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的2年生福鼎大白茶樹進(jìn)行處理，設(shè)置如下人工氣候室生長(zhǎng)條件：溫度（24±2） ℃，濕度 65%。以未進(jìn)行4 ℃處理的植株作為對(duì)照（CK），以于4 ℃處理7 d為處理組，同時(shí)設(shè)置處理后恢復(fù)7 d的處理。收集每種處理后的1芽3葉（混樣），每個(gè)處理保持3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取樣后用液氮速凍并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 茶樹RCI2基因家族成員的鑒定

從擬南芥信息資源（TAIR；http：//www.arabidopsis.org/）中下載8個(gè)已報(bào)道的擬南芥RCI2蛋白序列作為查詢序列在茶樹中進(jìn)行同源BlastP。在Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)中下載PMP3結(jié)構(gòu)域隱馬爾可夫模型（PF01679），按E值lt;10^-10對(duì)茶樹基因組進(jìn)行檢索^［20］。為了進(jìn)一步篩選候選基因，將所得基因的蛋白序列上傳至Pfamscan（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/）與NCBI-CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）上，以E值lt;10^-10進(jìn)行檢索，根據(jù)檢索結(jié)果查看基因是否含有PMP3結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，使用DNAMAN軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，以確定基因結(jié)構(gòu)無(wú)誤。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析和K_a/K_s壓力分析

使用MEGA 6.0軟件，用Neighbour-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行bootstrap測(cè)試（n=1 000），進(jìn)化樹使用Evolview（https：//evolgenius.info//evolview-v2）在線工具進(jìn)行美化?；蛑g的重復(fù)事件使用DNASP 6.0軟件計(jì)算非同義突變頻率（K_a）、同義突變頻率（K_s）和非同義突變頻率與同義突變頻率的比值（K_a/K_s）。

1.4 茶樹RCI2基因基序與啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件分析

使用MEME （https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在線分析網(wǎng)站對(duì)RCI2基因的保守基序進(jìn)行鑒定，參數(shù)配置參照之前的研究方法。使用TBtools提取目的基因啟動(dòng)子前2 000 bp序列，并將RCI2基因啟動(dòng)子序列提交至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），用于鑒定順勢(shì)作用元件。使用TBtools軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行作圖^［21］。

1.5 熱圖構(gòu)建及qRT-PCR分析

基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹基因組公共數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tpia.teaplants.cn/）^［22］，使用TBtools軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。RNA提取使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（北京華越洋生物技術(shù)有限公司）提取，引物設(shè)計(jì)用Primer 5.0設(shè)計(jì)。以CsPTB-RT作為茶樹內(nèi)部對(duì)照的特異性引物（表1）。實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)：1 μL cDNA模板，10 μL SYBR Premix ExTaq（TaKaRa，Kyoto，Japan），2 μL 特異性引物，7 μL ddH₂O。PCR熱循環(huán)參數(shù)如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)。在信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院公共試驗(yàn)平臺(tái)上，使用ABI Step One Plus熒光定量系統(tǒng)對(duì)來(lái)自不同節(jié)點(diǎn)樣品的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

1.6 基于全基因組測(cè)序的變異位點(diǎn)分析

在茶樹基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.teaplant.top/teagvd）^［23］中檢索目的基因變異位點(diǎn)情況并統(tǒng)計(jì)目的基因變異位點(diǎn)數(shù)量，統(tǒng)計(jì)基因變異位點(diǎn)的插入與缺失氨基酸數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹RCI2基因成員的鑒定

從茶樹CSS（cv.Shuchazao）基因組中共鑒定出11個(gè)RCI2基因，基于進(jìn)化分析及染色體位置，將這些基因重新命名為CsRCI2A～CsRCI2K。在茶樹中，RCI2基因分布于5條染色體上，2個(gè)基因未組裝，基因氨基酸序列長(zhǎng)度為54～72 aa，相對(duì)分子量為5.95～8.07 ku，等電點(diǎn)為4.00～8.35，大部分基因都編碼酸性蛋白（表2）。此外，茶樹CsRCI2基因的平均親水性整體上大于1，基因均編碼疏水性蛋白。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了分析基因的功能，還對(duì)這些基因進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，通過(guò)進(jìn)化分析找到相似性較大的基因并對(duì)其進(jìn)行功能上的推測(cè)，對(duì)茶樹、擬南芥RCI2基因氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。對(duì)茶樹RCI2基因的氨基酸序列與擬南芥RCI2的氨基酸序列進(jìn)行共同比對(duì)發(fā)現(xiàn)，基因PMP3保守結(jié)構(gòu)域高度保守（圖1）。由圖2可見，基因之間的同源性相對(duì)來(lái)說(shuō)較高，并且在不同物種間同源性較高的基因也可能具有相似功能。

2.3 CsRCI2基因的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，CsRCI2基因的基序數(shù)量為4個(gè)，所有基因都高度保守并含有基序1、基序2，部分基因特異性包含基序3、基序4。因此，茶樹CsRCI2基因在進(jìn)化發(fā)育過(guò)程中的差異性可能較低。通過(guò)外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步分析還可以發(fā)現(xiàn)，CsRCI2基因大多只有1個(gè)內(nèi)含子（圖3），基因結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，基因之間的相似性可能較大。

2.4 基因共線性分析和進(jìn)化選擇壓力分析

K_a/K_s通常被用來(lái)衡量基因的選擇壓力，筆者通過(guò)DNASP 6.0軟件進(jìn)行相關(guān)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，茶樹RCI2基因之間有2對(duì)基因具有復(fù)制事件產(chǎn)生，其中CsRCI2B～CsRCI2A基因?qū)χg的復(fù)制事件是片段復(fù)制事件，K_a/K_slt;1，比較特殊的是CsRCI2C～CsRCI2K基因?qū)Φ腒_s值為0（表3）。

2.5 茶樹CsRCI2基因啟動(dòng)子的順式作用元件

為了進(jìn)一步分析CsRCI2基因在低溫脅迫下可能存在的響應(yīng)機(jī)制，筆者對(duì)CsRCI2基因上游2 kb的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析。結(jié)果表明，共有262個(gè)順式作用元件，分析其功能可以將其分為3類，分別是脅迫相關(guān)（干旱誘導(dǎo)、厭氧誘導(dǎo)、缺氧特異誘導(dǎo)性、防御和壓力反應(yīng)、低溫響應(yīng)）、發(fā)育相關(guān)（玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控、分生組織表達(dá)、晝夜節(jié)律控制、胚乳表達(dá)、種子特異性調(diào)控、類黃酮生物合成基因調(diào)控、柵欄葉肉細(xì)胞、光響應(yīng)元件）、激素相關(guān)（赤霉素反應(yīng)、水楊酸反應(yīng)、脫落酸反應(yīng)、MeJA響應(yīng)、生長(zhǎng)素反應(yīng)）的順式作用元件（圖 4）。結(jié)果表明，11個(gè)基因都含有數(shù)量不等的非生物脅迫相關(guān)順式作用元件 9個(gè)基因含有1個(gè)或多個(gè)ARE順式作用元件，2個(gè)基因含有低溫響應(yīng)元件LTR，8個(gè)基因含有脫落酸響應(yīng)順式作用元件（ABRE）。眾所周知，ABRE、MBS、LTR這幾種順式作用元件在非生物脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。此外，大部分基因在生長(zhǎng)發(fā)育及與激素相關(guān)的順式作用元件上都有分布，說(shuō)明在茶樹中CsRCI2基因參與了復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.6 基因表達(dá)模式分析及qRT-PCR分析

為了初步分析基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式，并從表達(dá)模式中分析基因在壓力狀況下可能具有的相似性，從安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹基因組公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載低溫下基因的FPKM表達(dá)數(shù)據(jù)，并構(gòu)建了熱圖進(jìn)行分析。圖5結(jié)果顯示，CsRCI2B、CsRCI2D、CsRCI2I和CsRCI2J這4個(gè)基因在低溫處理下均受到誘導(dǎo)表達(dá)，而且這些基因隨著不同處理時(shí)間的變化及不同組織間的轉(zhuǎn)錄豐度變化都表現(xiàn)出很大的差異，如CsRCI2B、CsRCI2D和CsRCI2J在低溫處理不同階段的表達(dá)量顯著上升，表明這些基因可能在低溫脅迫下正向調(diào)節(jié)低溫脅迫，同時(shí)CsRCI2I的表達(dá)量在低溫處理下顯著下降，表明CsRCI2I可能在低溫脅迫下負(fù)調(diào)控。

為了進(jìn)一步分析候選基因是否受低溫誘導(dǎo)并在低溫脅迫下發(fā)揮作用，對(duì)候選基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示，CsRCI2B、CsRCI2J的表達(dá)量分別在處理6 h、7 d時(shí)顯著升高（圖6-A、圖6-D），而 CsRCI2D的表達(dá)量在低溫處理下沒(méi)有發(fā)生顯著變化，CsRCI2I在低溫處理后7 d的表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降（圖6-B、圖6-C）。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析結(jié)果表明，CsRCI2B和CsRCI2J可能在低溫脅迫下正向調(diào)控低溫脅迫，CsRCI2I可能在茶樹中是1個(gè)響應(yīng)低溫的負(fù)調(diào)控因子。

2.7 基因變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

選擇壓力分析和表達(dá)分析只能初步分析基因是否介導(dǎo)非生物脅迫，但是基因在非生物脅迫下是否會(huì)介于壓力的存在導(dǎo)致突變（如氨基酸的插入與缺失），這一點(diǎn)并不能完全確認(rèn)。因此，筆者在茶樹基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索了所有茶樹RCI2基因的氨基酸插入與缺失情況，發(fā)現(xiàn)CsRCI2B、CsRCI2D、CsRCI2I、CsRCI2J和CsRCI2H這5個(gè)基因的總變異數(shù)量低于100，其他基因的變異數(shù)量介于109～323（表4）。

3 討論

目前已知RCI2在擬南芥、水稻、玉米、棉花和紫花苜蓿中都已完成鑒定^［24-25］。本研究通過(guò)鑒定，共發(fā)現(xiàn)11個(gè)茶樹RCI2基因，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)化分析、基因結(jié)構(gòu)分析、啟動(dòng)子順式作用元件分析及表達(dá)分析和變異位點(diǎn)分析，希望通過(guò)對(duì)這些基因的分析發(fā)現(xiàn)茶樹在非生物脅迫下進(jìn)化的痕跡。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，CsRCI2A、CsRCI2B和擬南芥的AtRCI2A、AtRCI2B高度相似。已有研究發(fā)現(xiàn)，AtRCI2A、AtRCI2B參與低溫脅迫，結(jié)合在低溫和PEG處理下的表達(dá)分析結(jié)果，認(rèn)為CsRCI2A、CsRCI2B可能參與非生物脅迫?；驈?fù)制是基因多樣化的基礎(chǔ)，從而實(shí)現(xiàn)遺傳新穎性，基因復(fù)制也是物種進(jìn)化與適應(yīng)的主要來(lái)源^［26］。K_a/K_s分析結(jié)果顯示，CsRCI2B、CsRCI2A在進(jìn)化過(guò)程中，基因的功能在演化過(guò)程中相對(duì)穩(wěn)定，基因可能會(huì)保持相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平，同時(shí)變異的積累相對(duì)較小，不會(huì)導(dǎo)致劇烈的功能改變。上述結(jié)果表明，CsRCI2A、CsRCI2B可能和擬南芥AtRCI2A、AtRCI2B一樣在茶樹非生物脅迫下發(fā)揮重要核心功能。

在基因基序和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，基因結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，同時(shí)內(nèi)含子數(shù)量相對(duì)較少，而較少的內(nèi)含子表明基因具有更強(qiáng)的抗應(yīng)激能力，可以快速激活基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而CsRCI2基因大多只有1個(gè)內(nèi)含子，表明CsRCI2基因也可能具有較強(qiáng)的應(yīng)激能力，這在其他物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)相關(guān)證據(jù)，如研究人員發(fā)現(xiàn)在紫花苜蓿中MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C基因受低溫誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因植株也具有更強(qiáng)的耐冷性^［25］。通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子順式作用元件的分析，也可以找到CsRCI2基因可能在低溫等非生物脅迫下可能具有功能的證據(jù)，11個(gè)基因中不僅含有數(shù)量不等的脅迫相關(guān)順式作用元件，還含有激素相關(guān)的順式作用元件，這與陸地棉的研究結(jié)果類似，二者都發(fā)現(xiàn)MBS、LTR和ARE脅迫相關(guān)的順式作用元件^［24］。上述結(jié)果也證明，CsRCI2基因可能在非生物脅迫下參與非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

結(jié)合基因表達(dá)分析、qRT-PCR分析和突變位點(diǎn)數(shù)量分析，發(fā)現(xiàn)CsRCI2B、CsRCI2I和CsRCI2J不僅在不同脅迫下具有較高的轉(zhuǎn)錄豐度，同時(shí)這些基因都具有較少的變異位點(diǎn)，因此推測(cè)這些基因在受到低溫脅迫后的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了氨基酸的突變，并且基因不僅保持了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒(méi)有太多變異位點(diǎn)，而且在茶樹體內(nèi)發(fā)揮了重要作用，規(guī)避了有害突變。因此，在茶樹中的RCI2基因在外部環(huán)境影響下可能大部分出現(xiàn)功能退化，而核心基因沒(méi)有發(fā)生過(guò)多有害突變，并可在植物受到低溫脅迫后發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

植物基因在面對(duì)長(zhǎng)期外部環(huán)境壓力時(shí)可能經(jīng)歷表達(dá)和進(jìn)化的調(diào)整，以適應(yīng)新的環(huán)境條件。這種響應(yīng)通常是植物適應(yīng)性演化的一部分，旨在提高生存和繁殖的成功率。基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果顯示，茶樹RCI2基因結(jié)構(gòu)高度保守，同時(shí)這些基因在茶樹受到低溫脅迫時(shí)可能具有較強(qiáng)的抗應(yīng)激能力并參與復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合對(duì)茶樹RCI2基因進(jìn)化和在低溫脅迫下的表達(dá)分析結(jié)果，可以看出茶樹CsRCI2B、CsRCI2I 和CsRCI2J可能通過(guò)其差異表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)外部環(huán)境壓力。上述基因在長(zhǎng)期壓力下可能導(dǎo)致適應(yīng)性表達(dá)水平的提高，這些基因可能參與低溫脅迫響應(yīng)途徑。基因的變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的外部環(huán)境壓力可能引起自然選擇，促使帶有有益變異的個(gè)體在群體中的相對(duì)頻率提高。同時(shí)茶樹中大多數(shù)RCI2基因的變異是不利于其進(jìn)化的，因?yàn)橹挥凶儺愇稽c(diǎn)相對(duì)較少的基因在低溫脅迫下展現(xiàn)出高表達(dá)。本研究結(jié)果為CsRCI2基因在低溫脅迫下的研究提供了信息支撐，也為后續(xù)茶樹抗逆育種提供了參考信息。

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