摘" 要：對(duì)畢節(jié)市市內(nèi)采集的3類瓦斯?jié)舛炔煌拿旱V礦石樣本進(jìn)行非靶向代謝產(chǎn)物分析，以了解其分布情況、豐度等信息。采集市內(nèi)距離相近的3類不同瓦斯?jié)舛让旱V礦石，使用色譜儀聯(lián)合質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在3類礦石中標(biāo)注到化合物369種，其中，氨基酸、多肽和類似物（Amino acids， peptides， and analogues）占12.97%，某種數(shù)據(jù)庫(kù)未描述的化合物（Not Available）占12.97%，脂肪酸和偶聯(lián)物（Fatty acids and conjugates）占5.48%，為占比最靠前的3類化合物；低瓦斯煤礦（Ao）與高瓦斯煤礦（Bo）差異化合物87種、低瓦斯煤礦（Ao）與突出瓦斯煤礦（Co）差異化合物64種，高瓦斯煤礦（Bo）與突出瓦斯煤礦（Co）差異化合物100種。該研究較為系統(tǒng)地觀察畢節(jié)市內(nèi)3類不同瓦斯?jié)舛让旱V的生物代謝產(chǎn)物，分析它們之間存在的差異和可能的原因，并作KEGG信號(hào)通路預(yù)測(cè)，為本區(qū)域內(nèi)的煤礦開采、疾病防治、礦區(qū)生物相關(guān)研究等提供參考數(shù)據(jù)。

關(guān)健詞：煤礦；代謝組學(xué)；環(huán)境代謝組學(xué)；微生物；小分子代謝物

中圖分類號(hào)：R313" " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " " 文章編號(hào)：2095-2945（2024）33-0091-05

Abstract： Non-targeted metabolite analysis was carried out on three types of coal mine ore samples with different gas concentrations collected in Bijie City to understand their distribution， abundance and other information. Three types of coal mine ores with different gas concentrations with similar distances in the city were collected， tested using a chromatograph combined with a mass spectrometer， and the detection data were analyzed. 369 compounds were marked in three types of ore， including amino acids， peptides， and analogues which accounted for 12.97%， a compound not described in the database （not available） accounted for 12.97%， fatty acids and conjugates accounted for 5.48%， making it the top three types of compounds; there are 87 different compounds between low gas coal mines（Ao） and high gas coal mines（Bo）， 64 different compounds between low gas coal mines （Ao） and outburst gas coal mines（Co）， and 100 different compounds between high gas coal mines （Bo） and outburst gas coal mines（Co）. This study systematically observed the biological metabolites of three types of coal mines with different gas concentrations in Bijie City， analyzed the differences and possible reasons between them， and predicted the KEGG signal path to provide reference data for coal mining， disease prevention and control， and bio-related research in mining areas in the region.

Keywords： coal mine; metabolomics; environmental metabolomics; microorganisms; small molecule metabolites

環(huán)境代謝組學(xué)是一門新興的學(xué)科，其主要用于研究和提示環(huán)境中天然生存的細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)的小分子代謝物及其相互作用，通過對(duì)環(huán)境樣品的高通量分子檢測(cè)和分析，代謝組學(xué)能夠提供基于宏數(shù)據(jù)下關(guān)于生理生態(tài)學(xué)、生態(tài)毒理學(xué)、疾病學(xué)等多學(xué)科的豐富信息。目前，基于高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀的方式成為代謝組學(xué)研究的主流平臺(tái)，其原理是將待測(cè)樣本均質(zhì)化處理為流相微粒后，使其在質(zhì)譜儀中于特定條件下規(guī)律涌動(dòng)，之后與數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的化合物數(shù)據(jù)作全面對(duì)比，從而可以精準(zhǔn)測(cè)定出樣本內(nèi)化合物的種類和豐度，對(duì)環(huán)境生境內(nèi)的化合物作全面的了解，并對(duì)差異環(huán)境生境中的物質(zhì)作分析。目前，這種方法廣泛受到醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品科學(xué)的重視，已被超前學(xué)科應(yīng)用于眼科疾病診斷、腫瘤學(xué)研究、作物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)估和環(huán)境影響因子尋找等多學(xué)科方向[1]。鑒于現(xiàn)有數(shù)學(xué)方法的改進(jìn)，通過數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，還可以發(fā)現(xiàn)意想不到的關(guān)系和代謝物反應(yīng)，并提供環(huán)境內(nèi)生物的功能性預(yù)測(cè)抑或是疾病相關(guān)性等方面的評(píng)估[2]。煤礦的原生環(huán)境中含有豐富的微生物構(gòu)成，這些微生物的存在對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的影響及其間的關(guān)系已成為交叉學(xué)科應(yīng)用研究的熱點(diǎn)，未來有望在礦區(qū)復(fù)墾、感染預(yù)防、瓦斯治理等方面得到規(guī)?；膽?yīng)用[3-4]。由于深埋的煤礦環(huán)境下其他生物較少，故微生物在煤礦環(huán)境中可能成為影響生物代謝的最重要一環(huán)，但目前國(guó)內(nèi)外缺乏針對(duì)煤礦環(huán)境生物代謝的相關(guān)研究，因此本研究采用高通量非靶向代謝產(chǎn)物檢測(cè)的方法對(duì)煤儲(chǔ)豐富的畢節(jié)市內(nèi)煤礦進(jìn)行調(diào)查，系統(tǒng)地分析市內(nèi)距離相近的3類不同瓦斯?jié)舛让旱V礦石生境內(nèi)代謝產(chǎn)物，為本區(qū)域內(nèi)的煤礦開采、疾病防治和礦區(qū)生物相關(guān)研究等提供數(shù)據(jù)參考。

1" 研究方法

1.1" 主要試劑與儀器

滅菌鑷子（杭州微生物科技有限公司）、采集袋（比克曼生物科技有限公司）、冷凍真空濃縮儀（Maxi Vacbeta，GENE COMPANY）、Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，USA）、Waters UPLC I-Class Plus（Waters，USA）、甲醇（上海振興化工二廠）、乙腈（上海振興化工二廠）和超純水儀（上海和泰儀器有限公司）等。

1.2" 標(biāo)本采集與標(biāo)記

選擇畢節(jié)市內(nèi)煤礦密度較高的區(qū)域采樣，以保證樣本的代表性；根據(jù)瓦斯?jié)舛鹊牟煌?，以距離相近的3類不同瓦斯?jié)舛龋ǖ屯咚姑旱V、高瓦斯煤礦、突出瓦斯煤礦）煤礦內(nèi)的礦石為采集對(duì)象，以盡量減少環(huán)境變化帶來的影響。本次采集到低瓦斯煤礦（標(biāo)記為Ao，經(jīng)緯度：106.11°E，27.32°N）、高瓦斯煤礦（標(biāo)記為Bo，經(jīng)緯度：106.22°E，27.38°N）、突出瓦斯煤礦（標(biāo)記為Co，經(jīng)緯度：106.17°E，27.38°N）共3組礦石，其中煤礦瓦斯?jié)舛葹橥怀鐾咚姑旱V高于高瓦斯煤礦高于低瓦斯煤礦，采樣均在井下約500 m深度的礦井中人為活動(dòng)較少的地方進(jìn)行，每組煤礦各采集環(huán)境重復(fù)樣本4個(gè)礦石以做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采集時(shí)嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作以避免人為污染，采集到的礦石放入專用采集袋，標(biāo)記后立即將樣本放入冷藏保溫箱待用。

1.3" 礦石樣本非靶向代謝產(chǎn)物測(cè)定和數(shù)據(jù)分析

在超凈工作臺(tái)內(nèi)將樣本在緩慢解凍后，置于管中，加入提取液（甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1，-20 ℃預(yù)冷）和內(nèi)標(biāo)液，放入研磨儀中研磨，水浴超聲后，冰箱靜置。離心后取上清，置于冷凍真空濃縮儀抽干后，加入復(fù)溶液進(jìn)行復(fù)溶后離心，取上清置于上樣瓶中。色譜條件：所使用的色譜柱為BEHC18色譜柱（Waters，USA），以含甲酸的水和甲醇作正離子相，另外以含甲酸銨的水和甲醇作負(fù)離子相，設(shè)定流速達(dá)0.35 mL/min并穩(wěn)定，柱溫在45 ℃對(duì)樣本進(jìn)行梯度洗脫。質(zhì)譜條件：采集一級(jí)信息條件設(shè)定如下，質(zhì)譜掃描質(zhì)核比范圍調(diào)整為70～1 050，一級(jí)分辨率調(diào)整為70 000，AGC設(shè)調(diào)整為3e6，最大注入時(shí)間（Injection Time，IT）調(diào)整為100 ms。按照母離子強(qiáng)度，選擇Top3模式進(jìn)行碎裂；采集二級(jí)信息條件設(shè)定如下，二級(jí)分辨率為17 500，AGC為1e5，最大注入時(shí)間（Injection Time，IT）為 50 ms，碎裂能量（Stepped Nce）設(shè)置為20、40、60 eV。離子源（ESI）參數(shù)設(shè)置：鞘氣流速（Sheath Gas Flow Rate）為40，輔助氣流速為10，噴霧電壓（Spray Voltage）正離子模式為3.80，負(fù)離子模式為3.20，離子傳輸管溫度（Capillary Temperature）為320 ℃，輔助氣加熱溫度為350 ℃。下機(jī)后使用metaX對(duì)軟件導(dǎo)出結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的處理，以獲得可以用于正式分析的化合物和定量值，獲得的數(shù)據(jù)與HMDB（www.hmdb.ca）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和注釋，然后對(duì)其注釋的情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，進(jìn)一步使用數(shù)據(jù)通過單變量分析和多變量分析來篩選2個(gè)生物組別間的差異代謝物，對(duì)比并繪制PLS-DA分析圖和Upset圖；另外，使用獲得的數(shù)據(jù)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genome.jp/kegg）對(duì)比以獲得關(guān)鍵生物信號(hào)通路相關(guān)信息，繪圖及統(tǒng)計(jì)使用R語言軟件。

2" 結(jié)果

2.1" 檢測(cè)情況

在正離子模式和負(fù)離子模式2種模式下檢測(cè)到的離子數(shù)詳見表1；PLS-DA分析結(jié)果如圖1所示，各個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)的距離代表了樣本間聚集和離散程度，距離越近表明樣本間相似性越高，距離越遠(yuǎn)表明樣本間差異性越大。

2.2" HMDB化合物注釋情況

所有樣本標(biāo)注到的化合物如圖2所示，通過HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，整體標(biāo)注到多種化合物，標(biāo)注出前20種，其余合并為其他（others），根據(jù)化合物豐度排列，前三的化合物為：氨基酸、多肽和類似物（Amino acids， peptides， and analogues）占比為12.97%，某種數(shù)據(jù)庫(kù)未描述的化合物（Not Available）占比為12.97%，脂肪酸和偶聯(lián)物（Fatty acids and conjugates）占比為5.48%。進(jìn)一步分別對(duì)3組樣本進(jìn)行兩兩比對(duì)，差異化合物結(jié)果如圖3所示。Ao與Bo有87個(gè)差異化合物，Ao與Co有64個(gè)差異化合物，Bo與Co有100個(gè)差異化合物，這些差異化合物集中在羧酸和衍生物（Carboxylic acids and derivatives）、脂肪酰胺（Fatty Acyls）、有機(jī)羥基化合物（Organooxygen compounds）、苯及其取代衍生物（Benzene and substituted derivatives）、有機(jī)氮化合物（Organonitrogen compounds）等。

2.3" KEGG信號(hào)通路預(yù)測(cè)情況

KEGG預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物與植物次生代謝產(chǎn)物生物合成（Biosynthesis of plant secondary metabolites），α-亞麻酸代謝（Alpha-Linolenic acid metabolism），丙烷、哌啶和吡啶類生物堿的生物合成（Tropane， piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis），甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism）等多種信號(hào)通路有關(guān)，如圖4所示，在圖中本研究列出排名前20的重要相關(guān)信號(hào)通路。

3" 討論與結(jié)論

煤炭是含有豐富的碳、氫、氧、硫、磷和氟等元素的化石燃料，因此成為一些微生物選擇駐存的環(huán)境有機(jī)物，人們已經(jīng)開始把這些微生物與煤炭之間微妙的相互作用用于工業(yè)生產(chǎn)中，如利用煤儲(chǔ)層生物改造加強(qiáng)煤層氣開采、使用甲烷氧化菌降解礦內(nèi)瓦斯等[5-6]，而微生物群落在礦質(zhì)上的生存會(huì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物將對(duì)環(huán)境造成影響。本研究中觀察到在3類地質(zhì)條件相近的煤礦中，存在豐富的代謝產(chǎn)物構(gòu)成，其中氨基酸和多肽類物質(zhì)（Amino acids， peptides， and analogues）占比最高，它們是蛋白質(zhì)基本構(gòu)成單位和碳基生物的功能基本載體[7]，此結(jié)果契合了煤礦環(huán)境中豐富的微生物群落構(gòu)成，目前工業(yè)微生物的應(yīng)用仍處在探索階段，人們正在嘗試結(jié)合基因工程技術(shù)改造微生物的能力，從而推進(jìn)微生物的規(guī)?；I(yè)應(yīng)用[8]；另外，脂肪酸類化合物（Fatty acids and conjugates）也在本次檢測(cè)中有較高的豐度，這類化合物除作為生物一般代謝產(chǎn)物觀察外，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)該類化合物對(duì)某些環(huán)境影響因子有一定的響應(yīng)預(yù)警作用[9]，在煤礦工業(yè)中的應(yīng)用價(jià)值值得進(jìn)一步研究；有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)一類數(shù)據(jù)庫(kù)未描述的化合物（Not Available）豐度在礦石中較高，這可能是區(qū)域性特有的代謝產(chǎn)物，其潛在功能性仍待發(fā)掘。在對(duì)3類煤礦的差異代謝產(chǎn)物對(duì)比中，一些常見的生物有機(jī)化合物差異較大，這說明3類煤礦中微生物的群落和分布是可能存在較大差別的。此外，發(fā)現(xiàn)哌啶類化合物、吲哚及其衍生物和黃酮類化合物存在差異，此3類化合物與藥物有相關(guān)性，哌啶類如氯雷他定、地洛他定類抗組胺藥等，吲哚類如吲哚美辛等非甾體類抗炎藥等，黃酮類如鹽酸黃酮哌酯等，說明在煤礦天然環(huán)境中存在潛在的產(chǎn)藥菌群且它們受到環(huán)境的影響較大，其中煤礦瓦斯?jié)舛仁强赡艿挠绊懸蛩?，使用PLS-DA分析對(duì)比了3類不同瓦斯?jié)舛让旱V的所有代謝產(chǎn)物集合，證實(shí)了它們之間的相對(duì)離散關(guān)系，但在檢測(cè)到的化合物總量上三者沒有顯著區(qū)別（Pgt;0.05）。基于獲得數(shù)據(jù)，本研究進(jìn)一步對(duì)化合物涉及的生物信號(hào)通路作了功能預(yù)測(cè)，結(jié)果中可以見到如α-亞麻酸代謝（Alpha-Linolenic acid metabolism）等多種與常見微生物一般生存代謝相關(guān)的預(yù)測(cè)作用通路[10]，但發(fā)現(xiàn)有植物次生代謝產(chǎn)物生物合成（Biosynthesis of plant secondary metabolites）、膽汁合成（Bile secretion）等動(dòng)植物相關(guān)的其他通路，這說明盡管處于深埋環(huán)境，微生物仍然不是影響環(huán)境代謝的唯一因素。

本研究系統(tǒng)地觀察了畢節(jié)市內(nèi)3類不同瓦斯?jié)舛让旱V的代謝產(chǎn)物，并分析了3類瓦斯?jié)舛炔煌拿旱V代謝產(chǎn)物的差異，為本區(qū)域該類環(huán)境中的生物代謝情況提供了基本參考數(shù)據(jù)，其中氨基酸、多肽和類似物（Amino acids， peptides， and analogues），某種數(shù)據(jù)庫(kù)未描述的化合物（Not Available），脂肪酸和偶聯(lián)物（Fatty acids and conjugates）為環(huán)境內(nèi)豐度最高的化合物，數(shù)據(jù)庫(kù)未描述的化合物（Not Available）可能是區(qū)域環(huán)境內(nèi)的特有化合物；3類不同瓦斯?jié)舛让旱V中存在多種差異化合物，說明在3類不同瓦斯?jié)舛鹊拿旱V中，可能受瓦斯?jié)舛鹊挠绊懀h(huán)境生物代謝有一定的差別；KEGG預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)多種微生物、動(dòng)植物相關(guān)代謝通路。

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