【摘要】目的 探討醒腦靜在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中的腦保護(hù)效果及其作用機(jī)制，評(píng)估醒腦靜對(duì)大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能、炎癥反應(yīng)及神經(jīng)元損傷的影響。方法 選取健康成年Sprague Dawley（SD）大鼠60只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（20只）、模型組（20只）及醒腦靜組（20只）。醒腦靜組大鼠灌胃給藥醒腦靜3 mL/kg體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)給藥5 d，給予假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積純凈水。末次給藥后30 min用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型。3組大鼠均術(shù)后飼養(yǎng)至再灌注72 h。比較再灌注24 h和72 h 3組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分、神經(jīng)功能評(píng)分及血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10

（IL-10）水平，以及再灌注72 h 3組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)。結(jié)果 與再灌注24 h比，再灌注72 h醒腦靜組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分升高，神經(jīng)功能評(píng)分降低，再灌注24、72 h，與手術(shù)組比，模型組和醒腦靜組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分均降低，神經(jīng)功能評(píng)分均升高，與模型組比，醒腦靜組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分均升高，神經(jīng)功能評(píng)分均降低（均Plt;0.05）；與再灌注24 h比，再灌注72 h模型組與醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均降低，再灌注24、72 h，與假手術(shù)組比，模型組和醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均升高，與模型組比，醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均降低（均Plt;0.05）；與假手術(shù)組比，再灌注72 h模型組和醒腦靜組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)出現(xiàn)明顯改變，腦組織結(jié)構(gòu)不完整，神經(jīng)元出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，與模型組比，醒腦靜組大鼠的腦組織病理形態(tài)學(xué)變化相對(duì)較輕，腦組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，神經(jīng)元壞死相對(duì)較少。結(jié)論 醒腦靜在大鼠腦缺血再灌損傷中具有顯著的腦保護(hù)作用，能夠保護(hù)大鼠腦組織結(jié)構(gòu)的完整性，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)元損傷，進(jìn)而改善其神經(jīng)功能和運(yùn)動(dòng)功能。

【關(guān)鍵詞】醒腦靜 ; 腦缺血再灌注損傷 ; 腦保護(hù) ; 神經(jīng)功能評(píng)分

【中圖分類號(hào)】R749.05 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-3718.2024.15.0024.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.15.008

腦缺血再灌注損傷是在腦血流中斷后恢復(fù)血流供應(yīng)過(guò)程中，腦組織因再灌注引起的損傷，其病理機(jī)制復(fù)雜，涉及多種生物學(xué)過(guò)程，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、鈣超載、血腦屏障破壞等[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是研究腦缺血再灌注損傷機(jī)制和治療方法的重要手段。大鼠因其腦結(jié)構(gòu)和功能與人類相似，因此，常通過(guò)線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，模擬人類腦缺血再灌注損傷過(guò)程，研究其病理機(jī)制和潛在治療方法。中醫(yī)理論認(rèn)為腦缺血再灌注損傷屬于“中風(fēng)”范疇，其病機(jī)主要為氣血瘀滯、痰熱內(nèi)閉、神明失養(yǎng)[2]。醒腦靜是一種中藥復(fù)方制劑，主要成分包括麝香、郁金、梔子、冰片等，具有清熱解毒、活血化瘀、鎮(zhèn)靜安神等功效[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，醒腦靜具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種藥理作用，能增強(qiáng)血腦屏障的通透性，減輕腦水腫，改善腦缺血再灌注損傷的病理狀態(tài)，具有潛在的治療價(jià)值[4]?；诖?，本研究旨在探討醒腦靜在大鼠腦缺血再灌注損傷中的腦保護(hù)效果及其作用機(jī)制，通過(guò)行為學(xué)評(píng)估、血清指標(biāo)檢測(cè)及腦組織病理學(xué)觀察，系統(tǒng)評(píng)價(jià)醒腦靜的腦保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只Sprague Dawley（SD）大鼠[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2022-0004]，體質(zhì)量250～300 g，平均（277.47±13.59） g；大鼠周齡11～12周，平均（11.50±0.50）周。飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，采用12 h晝夜循環(huán)照明系統(tǒng)，大鼠均自由進(jìn)食、飲水。本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2023102702）。

1.2 主要試劑與儀器 醒腦靜注射液（河南天地藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z41020664，規(guī)格：10 mL/支），緩沖生理鹽水（北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S10870001，規(guī)格：1.5 mL/支），水合氯醛/糖漿組合包裝[特豐制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20210012，規(guī)格：水合氯醛濃縮液0.671 g∶0.5 g/糖漿4.5 mL]，發(fā)光二極管熒光顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)德國(guó)有限公司，型號(hào)：DM2500）。

1.3 研究方法

1.3.1 動(dòng)物分組和干預(yù) 取健康成年SD大鼠60只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（20只）、模型組（20只）

及醒腦靜組（20只）。醒腦靜組大鼠灌胃給藥醒腦靜3 mg/kg體質(zhì)量，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥5 d，給予假手術(shù)組和模型組大鼠等體積純凈水。末次給藥后30 min造模。

1.3.2 大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）大鼠模型構(gòu)建 造模前1 d禁食不禁水，假手術(shù)組大鼠實(shí)施假手術(shù)，未實(shí)現(xiàn)腦缺血后的再灌注，模型組和醒腦靜組大鼠均實(shí)施手術(shù)，實(shí)現(xiàn)腦缺血后的再灌注。延大鼠頸部正中作一10～15 mm切口，分離兩側(cè)頜下腺，于兩側(cè)頜下腺之間剪開(kāi)筋膜，顯露實(shí)驗(yàn)大鼠的右側(cè)胸鎖乳突肌，由玻璃分針鈍性分離胸鎖乳突肌與舌骨肌間的肌間隙，暴露頸總動(dòng)脈，依次分離出頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。頸外動(dòng)脈近心端穿手術(shù)絲線，依次結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端與頸外動(dòng)脈近心端，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾住頸內(nèi)動(dòng)脈的近心端，在頸總動(dòng)脈分為頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈的近端用絲線結(jié)扎，以防穿尼龍絲處的切口滲血。在頸總動(dòng)脈距離頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處約5 mm處造口，由此口小心地插入尼龍絲（栓線向內(nèi)上方的角度插入，以防進(jìn)入翼鄂動(dòng)脈），長(zhǎng)度為18～20 mm，結(jié)扎頸總動(dòng)脈以固定尼龍絲和防止出血，縫合皮膚。術(shù)后注意保暖，術(shù)后的大鼠行單籠飼養(yǎng)，準(zhǔn)備相對(duì)柔軟的鼠糧及充足的飲用水。阻塞2 h后，輕輕拔出栓線約10 mm實(shí)現(xiàn)腦缺血后的再灌注。假手術(shù)組只分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，不結(jié)扎，不插線，完成后直接縫合皮膚。

1.3.3 橫木行走實(shí)驗(yàn) 橫木寬2.0 cm，長(zhǎng)120 cm，厚1.0 cm，距離地面80 cm水平懸空放置。造模前進(jìn)行橫木行走訓(xùn)練，使大鼠全部順利通過(guò)橫木。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]：

0分代表不能待在橫木上；1分代表待在橫木上不能行動(dòng)；2分代表試圖通過(guò)但從橫木上摔下；3分代表通過(guò)橫木，但損傷后肢滑落步數(shù)超過(guò)總步數(shù)的50%；4分代表滑落步數(shù)超過(guò)1次但不超過(guò)總步數(shù)的50%；5分代表僅滑落1次；6分代表順利通過(guò)。術(shù)前訓(xùn)練4 d，每天1次，直至所有大鼠評(píng)分達(dá)到6分。

1.3.4 神經(jīng)功能評(píng)分 采用Zea Longa評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估[6]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分代表無(wú)明顯神經(jīng)癥狀；1分代表不能完全伸展左側(cè)前爪；2分代表行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分代表行走時(shí)向左側(cè)傾倒；4分代表不能自主行走；5分代表死亡。

1.3.5 腦組織病理分析 ⑴組織取材：切開(kāi)胸腹皮肉，充分暴露心臟，經(jīng)心尖插管，剪開(kāi)心耳，用緩沖生理鹽水沖洗5 min，用4%多聚甲醛（0.l mol/L磷酸緩沖液，pH值7.4）心內(nèi)灌注固定。大鼠尾部變硬后，開(kāi)顱取全腦，冠狀位取視交叉向尾端3～4 mm組織塊，投入相同固定液于4 ℃固定1周，石蠟包埋后，4 ℃保存。⑵蘇木精 - 伊紅（HE）染色：將石蠟切片，切片厚度5 μm，將切片用不同濃度的二甲苯和乙醇脫蠟，蘇木素浸泡染色25 min后用水沖洗。鹽酸乙醇分化液浸泡30 s，純凈水浸泡15 min，0.5%伊紅染液浸泡2 min，沖洗。乙醇梯度脫水，樹(shù)脂封片，光鏡下觀察其組織形態(tài)的變化。

1.4 觀察指標(biāo) ⑴運(yùn)動(dòng)功能和神經(jīng)功能。分別于再灌注24 h和72 h比較3組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分和神經(jīng)功能功能評(píng)分。⑵血清學(xué)指標(biāo)。每組大鼠分別于再灌注24 h和72 h后經(jīng)腹腔注射10 %水合氯醛（0.35 mL/100 g體質(zhì)量），腹主動(dòng)脈取血，離心（3 000～4 000 r/min，10～15 min，4 ℃）后得到上層血清，使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)3組大鼠血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）水平。⑶腦組織病理形態(tài)。再灌注72 h比較3組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布且方差齊，以（ x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分和神經(jīng)功能評(píng)分比較 與再灌注24 h比，再灌注72 h醒腦靜組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分升高，神經(jīng)功能評(píng)分降低；再灌注24、72 h，與假手術(shù)組比，模型組與醒腦靜組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分均降低，神經(jīng)功能評(píng)分均升高；與模型組比，醒腦靜組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分均升高，神經(jīng)功能評(píng)分均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見(jiàn)表1。

2.2 3組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平比較 與再灌注24 h比，再灌注72 h 模型組與醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均降低；再灌注24、72 h，與假手術(shù)組比，模型組和醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均升高；與模型組比，醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見(jiàn)表2。

2.3 3組大鼠腦組織HE染色與病理形態(tài)學(xué)比較 再灌注72 h后，與假手術(shù)組比，模型組和醒腦靜組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)出現(xiàn)明顯改變，腦組織結(jié)構(gòu)不完整，神經(jīng)元出現(xiàn)壞死現(xiàn)象；與模型組比，醒腦靜組大鼠的腦組織病理形態(tài)學(xué)變化相對(duì)較輕，腦組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，神經(jīng)元壞死較少，見(jiàn)圖1。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一種臨床常見(jiàn)的造成腦損傷的原因，其發(fā)生往往與休克、心跳驟停等多種情況密切相關(guān)。在腦缺血再灌注過(guò)程中，缺血引起的腦組織損傷往往比缺血本身更嚴(yán)重。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦缺血再灌注損傷屬“中風(fēng)”范疇，“腦髓損傷，神機(jī)失用”是病機(jī)關(guān)鍵。醒腦靜主要由麝香、郁金、梔子、冰片配伍而成，具有保護(hù)腦組織、改善腦部血液循環(huán)、抗炎等作用。醒腦靜在臨床上主要用于治療多種原因?qū)е碌哪X部疾病，研究表明，醒腦靜在腦缺血再灌注損傷中可能具有一定的保護(hù)作用[7-8]。

本研究中，再灌注24、72 h，與假手術(shù)組比，模型組與醒腦靜組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分均降低，神經(jīng)功能評(píng)分均升高；與模型組比，醒腦靜組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)評(píng)分均升高，神經(jīng)功能評(píng)分均降低。這提示醒腦靜能夠有效改善腦缺血再灌注損傷大鼠的平衡能力和神經(jīng)功能。醒腦靜具有鎮(zhèn)靜安神的作用，能夠抑制腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，改善運(yùn)動(dòng)功能和神經(jīng)功能。良好的血液供應(yīng)對(duì)于維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要，而醒腦靜具有活血化瘀的作用，可改善腦部血液循環(huán)，促進(jìn)腦組織的血液供應(yīng)和氧氣供給，減輕腦組織損傷[9]。

在腦缺血再灌注過(guò)程中，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥因子釋放，會(huì)進(jìn)一步加重腦組織損傷，NSE是神經(jīng)元損傷的標(biāo)志物，當(dāng)腦組織出現(xiàn)急性缺血缺氧導(dǎo)致壞死時(shí)，大量NSE會(huì)釋放；IL-6和IL-10主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，IL-6水平可反映腦缺血損傷程度，IL-10是抗炎因子，在腦缺血早期處于應(yīng)激代償狀態(tài)，可抑制炎癥因子的活性。本研究中，再灌注24、72 h，與假手術(shù)組比，模型組和醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均升高；與模型組比，醒腦靜組大鼠血清NSE、IL-6及IL-10水平均降低。這提示醒腦靜能夠減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低炎癥因子水平，減輕神經(jīng)元損傷。醒腦靜具有較好的抗炎、改善血液循環(huán)的作用，通過(guò)改善腦組織缺血缺氧狀態(tài)和血腦屏障的通透性，減少炎癥因子對(duì)腦組織的損傷。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比，醒腦靜組大鼠的腦組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，神經(jīng)元壞死相對(duì)較少。這提示醒腦靜能夠有效保護(hù)腦組織結(jié)構(gòu)完整性，減輕神經(jīng)元損傷。醒腦靜具有抗氧化作用，能夠清除再灌注過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而保護(hù)腦組織結(jié)構(gòu)；醒腦靜還具有抗凋亡作用，通過(guò)抑制腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)元損傷，促進(jìn)腦組織修復(fù)[10]。

綜上，醒腦靜在大鼠腦缺血再灌損傷中具有顯著的腦保護(hù)作用，通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)元損傷，進(jìn)而保護(hù)腦組織結(jié)構(gòu)的完整性，還改善了運(yùn)動(dòng)功能和神經(jīng)功能。未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步深入研究，為醒腦靜治療腦缺血再灌損傷提供更多的科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

孫亞萍， 霍瑞卿， 趙敏菡， 等. 益氣活血化濁解毒方調(diào)節(jié)脂多糖和TLR4/MyD88/MAPK信號(hào)通路減輕大鼠腦缺血再灌注損傷研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2023， 38（12）： 5997-6002.

張平文， 王義宣. 醒腦靜注射液治療創(chuàng)傷性腦出血患者的臨床研究[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志， 2023， 39（23）： 3351-3355.

郭金赫， 范祥. 醒腦靜注射液治療腦出血研究進(jìn)展[J]. 中成藥， 2021， 43（2）： 450-453.

王麗琴， 孫逸坤， 王曉峰， 等. 醒腦靜注射液對(duì)大鼠腦出血模型血腦屏障通透性及相關(guān)蛋白的影響[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥， 2021， 14（6）： 993-999.

楊奕櫻， 劉楊， 劉明， 等. 淫羊藿苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠恢復(fù)早期的神經(jīng)保護(hù)作用研究[J].中藥新藥與臨床藥理， 2020， 31（6）： 662-667.

盧小葉， 呂倩憶， 李棋龍， 等. Zea-longa評(píng)分與改良Garcia評(píng)分應(yīng)用于針刺治療CIRI大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)估的研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2021， 41（9）： 1356-1360.

劉浩琦， 張涵萊， 李媛媛， 等. 基于GC-MS代謝組學(xué)的醒腦靜注射液干預(yù)腦缺血再灌注大鼠模型的作用機(jī)制研究[J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2022， 28（8）： 572-578.

曲曉宇， 張?jiān)旅鳎?張四喜， 等. 醒腦靜注射液保護(hù)大鼠腦缺血 - 再灌注損傷及血腦屏障的作用研究[J]. 中藥材 ，2018， 41（9）： 2196-2200.

賈賀， 李惠勉， 劉超， 等. 醒腦靜注射液對(duì)急性腦梗死患者局部腦血流、腦水腫及MMP、NSE的影響[J]. 吉林中醫(yī)藥， 2020， 40（9）： 1202-1205.

陳歡， 司海超， 馬新強(qiáng)， 等. 丁苯酞聯(lián)合醒腦靜預(yù)防頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后腦高灌注綜合征的療效及對(duì)其腦氧代謝、氧化應(yīng)激的影響[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2023， 18（7）： 1462-1465， 1475.

1 基金項(xiàng)目：2022年百色市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：百科20224163）

作者簡(jiǎn)介：吳曉文，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：重癥醫(yī)學(xué)。