摘要：植物莖尖的分裂和分化能力強(qiáng)，是良好的植物再生和遺傳轉(zhuǎn)化外植體。建立簡單高效的莖尖再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，在植物基因功能驗(yàn)證、性狀改良、新品種培育等方面發(fā)揮重要作用，從而促進(jìn)基因工程發(fā)展。本文介紹了莖尖分生組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并簡述了影響莖尖干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子及其在莖尖中的調(diào)控機(jī)制，以期加深人們對植物莖尖發(fā)育調(diào)控的認(rèn)識，為植物莖尖再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供理論基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，本文綜述了外植體苗齡、莖尖處理方式、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、溫度等因素對植物莖尖再生體系的影響，并重點(diǎn)討論和概述了當(dāng)前影響植物莖尖遺傳轉(zhuǎn)化效率的主要原因，包括預(yù)培養(yǎng)、莖尖處理方式、侵染方式、菌液濃度及侵染時間、乙酰丁香酮（AS）濃度、共培養(yǎng)時間、篩選劑等因素。結(jié)果表明，對莖尖外植體進(jìn)行適當(dāng)預(yù)培養(yǎng)和處理、在侵染過程中輔助AS或超聲波、選擇合適的侵染菌液濃度和共培養(yǎng)時間有利于提高植物莖尖的遺傳轉(zhuǎn)化效率。在此基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步探討了選擇合適的基因轉(zhuǎn)化方法、載體類型和優(yōu)化載體元件提高遺傳轉(zhuǎn)化效率的可行性，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化載體上添加發(fā)育調(diào)節(jié)因子是促進(jìn)植物再生的一種有效策略，推測該方法在植物莖尖研究中具有應(yīng)用潛力。此外，本文簡述了基因編輯發(fā)展現(xiàn)狀，總結(jié)了目前發(fā)育調(diào)節(jié)因子在基因編輯中的應(yīng)用，并對目前遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)優(yōu)化和應(yīng)用的研究熱點(diǎn)進(jìn)行了討論，對未來莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)化和應(yīng)用進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：莖尖；再生；遺傳轉(zhuǎn)化；細(xì)胞分化；基因工程

中圖分類號：S184" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）13-0001-12

隨著人口數(shù)量的增長、社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展、人民生活水平的提高以及生態(tài)環(huán)境氣候的變化，人們對植物的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性的要求日益提高。因此，快速開發(fā)和培育出更多新種質(zhì)植物以滿足生活、生產(chǎn)需求是解決這一問題的關(guān)鍵。然而，常規(guī)育種難以解決植物種質(zhì)資源貧乏、優(yōu)良品種退化、遠(yuǎn)緣雜交困難、有益性狀結(jié)合困難等問題，無法滿足人們?nèi)粘Ｉ詈蜕a(chǎn)的需求?；蚬こ碳夹g(shù)為植物產(chǎn)量的提高、品質(zhì)的改良和抗性的增強(qiáng)開辟了一條全新路徑。高效的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系是植物基因工程的基礎(chǔ)和核心。實(shí)踐證明，從植物不同部位培養(yǎng)出的外植體材料已被嘗試用于建立高效的再生體系［1］。其中，莖尖外植體具有很強(qiáng)的分裂和分化能力，以其作為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化容易獲得再生植株［2］。莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是以莖尖為轉(zhuǎn)化受體，經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)出不定芽，繼而形成完整轉(zhuǎn)化植株的技術(shù)，具有再生相對簡單、轉(zhuǎn)化周期短、無基因型限制等優(yōu)點(diǎn)［3］。目前，許多植物通過莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)均獲得了再生植株，如水稻、小麥、黑麥草、玉米、珍珠黍、高粱、矮牽牛、早熟禾、大豆、豌豆等［1，4-6］。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的主要轉(zhuǎn)化途徑，其介導(dǎo)轉(zhuǎn)入的外源基因拷貝數(shù)低、片段完整性好、遺傳穩(wěn)定性優(yōu)良、易于育種利用，但該方法也受到農(nóng)桿菌宿主專一性、受體材料基因型等因素的限制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率較低［2，7］。為了建立高效的莖尖再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，促進(jìn)基因工程的發(fā)展，對其進(jìn)行相關(guān)研究迫在眉睫。

本文結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展，對影響植物莖尖再生和農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化效率及植物遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素等進(jìn)行綜述，旨在為進(jìn)一步利用莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因育種奠定基礎(chǔ)。

1 莖尖分生組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)與發(fā)育

分生組織是高等植物產(chǎn)生與分化各種器官的基礎(chǔ)［8］。分生組織在植物體內(nèi)可以分為頂端分生組織和側(cè)生分生組織，其中頂端分生組織中的莖尖分生組織（SAM）在植物胚發(fā)育時形成，是植物營養(yǎng)發(fā)育、器官分化的起點(diǎn)［9］。SAM的維持和分化涉及生長素、細(xì)胞分裂素和多肽的相互作用，例如不敏感受體激酶CLV3能夠協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄因子WUS基因的表達(dá)，CLV3肽會反過來抑制WUS基因的表達(dá)，從而形成一個反饋循環(huán)，有助于維持細(xì)胞功能［10］。根據(jù)原套-原體學(xué)說，從總體上看莖尖分生組織可以分為原套、原體2個部分，其中L1、L2層的細(xì)胞組建成了原套，原體則是由L3層及以下多層細(xì)胞構(gòu)成的。除了上述學(xué)說之外，又可以按照分區(qū)學(xué)說劃分為中央分生組織區(qū)（CZ）、肋狀分生組織區(qū)（RZ）和外緣分生組織區(qū)［11］（PZ）（圖1）。其中，CZ區(qū)由全能干細(xì)胞組成，處于未分化狀態(tài)，植物細(xì)胞分裂周期長，分裂頻率低，因此CZ區(qū)是進(jìn)行莖尖組織培養(yǎng)的最佳選擇［12］。植物分生組織分化成成熟器官在一定程度上由發(fā)育調(diào)節(jié)因子決定，如在擬南芥中，這類調(diào)節(jié)因子包括WUS、端分生組織特異調(diào)控因子STM和CLV3［13］。WUS基因在維持植物干細(xì)胞群數(shù)量上具有關(guān)鍵的調(diào)控作用［14-15］。WUS對分生組織的功能至關(guān)重要，若WUS轉(zhuǎn)錄因子基因發(fā)生突變，則會導(dǎo)致SAM丟失。STM基因?qū)ηo端分生組織的建成與維持都具有非常重要的作用［16］。莖尖干細(xì)胞的增殖由CLV3控制［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，WUS和STM發(fā)生直接的相互作用，并能共同結(jié)合CLV3基因的啟動子以激活其表達(dá)，從而調(diào)控莖端分生組織干細(xì)胞活性［16］。

2 植物莖尖再生技術(shù)研究進(jìn)展

大量國內(nèi)外研究報道證實(shí)，植株苗齡的選擇、莖尖處理方式、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、溫度和光照均會影響莖尖的從頭再生。

2.1 植株苗齡的選擇

植株的苗齡是影響再生過程中的一個因素。選擇生長活躍、生理代謝旺盛的細(xì)胞或組織作為外植體，能較快獲得再生植株［18-19］，甘薯莖尖經(jīng)44 d培養(yǎng)后，得到無菌試管苗，而其他外植體（如莖段、葉片和葉柄）發(fā)生不同程度的黃化、褐化，枯萎等現(xiàn)象，再生率降低，污染率升高［20］。大多數(shù)植物在幼苗發(fā)育階段的外植體比成熟階段的外植體具有更強(qiáng)的形態(tài)發(fā)生能力。隨著植物的發(fā)育，器官的再生能力會逐漸減弱甚至完全消失［21］。Long等調(diào)查了不同苗齡的玉米幼苗莖尖的愈傷誘導(dǎo)率，發(fā)現(xiàn)2～6 cm 長的幼苗誘導(dǎo)愈傷率最高，大于6 cm、小于 2 cm 的幼苗褐變率較高，不利于植物再生。適當(dāng)苗齡的植物細(xì)胞的生長活性最強(qiáng)，再生效果好，反之，再生效果則差［22］。胡有良等在構(gòu)建大麥莖尖再生體系時發(fā)現(xiàn)，3 d苗齡的大麥莖尖愈傷誘導(dǎo)率最高，10 d苗齡的莖尖愈傷未分化，其他苗齡（1、2、5、8 d）莖尖的誘導(dǎo)率均不理想［23］。

在植物中，常采用莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)得到無菌苗。因此在選擇外植體植株苗齡時，要根據(jù)植物的種類、生長特性進(jìn)行綜合考慮。

2.2 莖尖處理方式

莖尖處理方式也會影響愈傷誘導(dǎo)率，傷口過小時，不易于形成愈傷組織，傷口過大時，易造成污染和死亡。大多數(shù)禾本科植物取2～6 mm的莖尖接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)便可成功建立再生體系，如谷子［24］、高粱［25］。為了明確大麥莖尖高頻再生體系的影響因素，胡有良等研究了大麥莖尖切段的大小對大麥莖尖愈傷誘導(dǎo)率和植物再生的影響，發(fā)現(xiàn)切取大麥莖尖頂端分生組織2 mm時的效果最好，莖尖愈傷誘導(dǎo)率、植株再生率分別為93.9%、311%［23］。將帶葉原基的莖尖縱向均分為2份時，芽增殖最多，去除葉原基直接接種則會在操作時耗損時間，相同時間內(nèi)產(chǎn)生的愈傷組織較少，芽分化率低［25］。莖尖的傷口適量增大有助于愈傷組織形成，對提高再生效率有一定的影響。

2.3 培養(yǎng)基

植物莖尖再生采用的基本培養(yǎng)基主要有MS、NBKNB、B5、N6培養(yǎng)基，可以通過添加不同種類及濃度的生長調(diào)節(jié)劑來進(jìn)行愈傷組織、芽分化和生根的誘導(dǎo)，其中MS培養(yǎng)基具有普遍適用性，生根時多采用1/2MS作為基本培養(yǎng)基。在桂花莖尖的培養(yǎng)過程中，初代培養(yǎng)的最適基本培養(yǎng)基是B5培養(yǎng)基。與MS培養(yǎng)基相比，B5培養(yǎng)基中的銨鹽濃度更低，推測桂花更適合銨濃度較低的生長環(huán)境［26］。草莓莖尖愈傷誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)均使用MS培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基中含有較高濃度的無機(jī)鹽，可以充分滿足幼胚的正常生長。草莓幼苗的生根過程不需要太多營養(yǎng)物質(zhì)，且少量營養(yǎng)物質(zhì)有助于植物更好地適應(yīng)環(huán)境，使用1/2MS培養(yǎng)基的效果較好，成活率達(dá)96%［27］。綜上，MS培養(yǎng)基在植物莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)中使用得最多，1/2MS培養(yǎng)基則多應(yīng)用于不定芽的分化和生根。在實(shí)際組織培養(yǎng)過程中，要根據(jù)植物種類、培養(yǎng)階段來選擇合適的培養(yǎng)基，同時碳源、植物生長調(diào)劑和其他培養(yǎng)物的添加也十分重要。

此外，碳源是植物再生過程中的重要成分。葡萄糖、蔗糖和麥芽糖是植物莖尖再生培養(yǎng)基常用的碳源，可為植物再生提供能量，是調(diào)節(jié)滲透環(huán)境的主要因子。在植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生期間，低蔗糖濃度有利于體細(xì)胞胚胎形成［22］。此外，適宜濃度的蔗糖對誘導(dǎo)愈傷組織有促進(jìn)作用，但是過高的蔗糖濃度可能會導(dǎo)致愈傷組織在繼代培養(yǎng)中褐化甚至死亡［28］。在用谷子莖尖愈傷誘導(dǎo)體細(xì)胞胚時，需要提高糖濃度，且蔗糖相較于葡萄糖更適合愈傷的形成［24］，可能由于葡萄糖的滲透壓較高，易造成細(xì)胞失水，從而不利于莖尖再生培養(yǎng)。當(dāng)銀杏莖尖再生在無蔗糖的培養(yǎng)基上時，無褐化情況，并且有明顯的生長趨勢。隨著蔗糖濃度的升高，銀杏莖尖的生長越弱，褐化現(xiàn)象越嚴(yán)重，更易污染［29］。在組織培養(yǎng)過程中去除糖后，增強(qiáng)了光合作用，減少了褐化，成活率得到提高。

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑及其他物質(zhì)

植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度配比是外植體的形態(tài)建成的關(guān)鍵。細(xì)胞分裂素、生長素類物質(zhì)是最常用的植物生長調(diào)節(jié)劑。細(xì)胞分裂素是培養(yǎng)過程中廣泛用于不定芽誘導(dǎo)的激素。常用的細(xì)胞分裂素包括6-芐基腺嘌呤（6-BA）、噻二唑苯基脲（TDZ）、激動素（KT）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）［30］。對長白落葉松莖尖進(jìn)行再生研究發(fā)現(xiàn)，在 6-BA 與 2，4-D 組合配比處理下，愈傷增殖快，質(zhì)地疏松，適于后續(xù)分化培養(yǎng)［31］。此外，其他生長素也在促進(jìn)組織培養(yǎng)、再生過程中發(fā)揮了重要作用。當(dāng)6-BA和NAA濃度之比較高時，植物易出芽；當(dāng)兩者濃度之比較低時，植物易生根。在草莓莖尖再生試驗(yàn)中，用005 mg/L NAA+0.10 mg/L 6-BA作為培養(yǎng)基，莖尖誘導(dǎo)率達(dá)71.11%，當(dāng)6-BA濃度為0.40 mg/L時，苗變短，若不添加6-BA，則幼苗長勢變?nèi)酰?7］。

生長素是再生過程中最重要的決定因素。外源生長素通過誘導(dǎo)乙烯合成的外源性前體的產(chǎn)生，從而促進(jìn)外植體的愈傷組織的形成。2，4-D是一種合成生長素，廣泛用于多個物種的試驗(yàn)中。2，4-D濃度會影響愈傷組織的形成，并且最佳濃度因不同物種或基因型而異。在谷子莖尖再生體系中，增加 2，4-D 濃度后，長生06、長農(nóng)35的愈傷誘導(dǎo)率上升，但是晉谷21的愈傷誘導(dǎo)率降低［24］。2，4-D也常與其他激素聯(lián)合使用。在高粱莖尖再生過程中，當(dāng)KT濃度為0.25 mg/L時，愈傷組織產(chǎn)生大量根；當(dāng)KT濃度大于0.5 mg/L時，則產(chǎn)生較多芽而不是愈傷組織；當(dāng)2，4-D濃度小于0.5 mg/L時，植株的再生能力較差。因此可見，愈傷組織誘導(dǎo)出芽效率最高的激素組合是0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT［32］。

此外，在莖尖再生培養(yǎng)基上添加氨基酸類物質(zhì)能有效提高莖尖的再生效率。其中，添加甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）和酪蛋白水解物（AHC）能夠提高洋蔥莖尖的愈傷誘導(dǎo)率，從而進(jìn)一步提高其再生效率［7］。在MS培養(yǎng)基中添加甘露醇或硝酸銀，能夠提高單倍體玉米莖尖愈傷組織的質(zhì)量［22］。在海南龍竹莖尖再生中添加谷氨酰胺（Gln）、脯氨酸（Pro）和酪蛋白水解物（AHC）后，對愈傷組織芽的誘導(dǎo)率達(dá)51.65%，可能是由于有機(jī)添加劑來源多樣化，提高了愈傷組織質(zhì)量，促進(jìn)了芽的發(fā)生［33］。不同植物莖尖再生體系見表1。

2.5 溫度、光照等條件

植物莖尖的培養(yǎng)取決于植物自身的培養(yǎng)習(xí)性和植物莖尖生長狀態(tài)，在適宜的光照度、時間等作業(yè)條件下，有利于其再生。例如，將大麥莖尖在光照度為3 000 lx、光照時間為16 h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，再生率最高［23］；將白芨莖尖在光照度為1 593 lx、光照時間為12 h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，成活率高達(dá)90%［37］；當(dāng)光照度為2 400～2 900 lx、光照時間為 14 h/d 時，草莓莖尖的再生率為96%［27］。若植物的光照度減弱，有可能會誘導(dǎo)參與酚類合成和氧化的酶活性增強(qiáng)，從而促進(jìn)酚類物質(zhì)的合成或增強(qiáng)酚類物質(zhì)的氧化，使褐化現(xiàn)象嚴(yán)重。

3 植物莖尖遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系用Ti或Ri質(zhì)粒將1段DNA片段通過感染植物莖尖傷口轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞中，然后通過減數(shù)分裂，將其傳遞至下一代，實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)化，具有不受季節(jié)限制、轉(zhuǎn)化周期短的優(yōu)點(diǎn)［3］。常規(guī)育種工作量大、周期長、效率低，因此采用莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良對于農(nóng)作物或園藝植物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義［49-50］。

3.1 莖尖預(yù)培養(yǎng)

對植物莖尖在農(nóng)桿菌浸染前進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，有助于提高其轉(zhuǎn)化效率。在用農(nóng)桿菌對虎杖莖尖進(jìn)行侵染前進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，可以提高莖尖的再生分化率，但是當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時間過長或過短時，莖尖死亡率上升，轉(zhuǎn)化率下降，因此適當(dāng)?shù)念A(yù)培養(yǎng)時間對于遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立有促進(jìn)作用［5］。將黃麻莖尖置于含有篩選劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的延長，再生率下降。當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時間為1 d時，轉(zhuǎn)化效果最佳；當(dāng)預(yù)培養(yǎng)2 d以上進(jìn)行侵染時，莖尖的再生率顯著下降［51］。預(yù)培養(yǎng)有利于外植體在切口處形成微愈傷，改變其生理生化狀態(tài)，促進(jìn)植物組織細(xì)胞結(jié)合并連接外源基因，提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化率。

3.2 莖尖處理方式

不同的莖尖處理方式對侵染效率的影響不同，若傷口過大，則莖尖易死亡；若傷口過小，則莖尖侵染程度很低。一般直接用操作刀造成傷口，如從離體植物中解剖出3 mm長的莖尖，并放置在培養(yǎng)基上［52］。在黃麻莖尖培養(yǎng)過程中，將莖尖縱切成大小不等分的兩半，并且只培養(yǎng)較大的一半進(jìn)行轉(zhuǎn)化，成功獲得轉(zhuǎn)化苗［51］。在高速渦旋過程中添加玻璃粉，可以在一定程度上對莖尖分生組織造成不可逆的傷害。在添加0.2 g玻璃粉后對84個棉花莖尖進(jìn)行侵染，轉(zhuǎn)化和成苗率最高，而添加大于0.4 g玻璃粉處理80個莖尖，莖尖分生組織受到的創(chuàng)傷比較嚴(yán)重，造成嚴(yán)重褐化，少數(shù)莖尖出現(xiàn)農(nóng)桿菌污染，使轉(zhuǎn)化和成苗率下降［53］。

3.3 莖尖的侵染方式

農(nóng)桿菌的侵染方式一般是利用菌液對創(chuàng)傷細(xì)胞進(jìn)行浸泡浸染。Sarkar等用直接侵泡法侵染植物表面，當(dāng)菌液D600 nm為0.8、侵染時長為1 h時，木豆轉(zhuǎn)化率達(dá)到6.66%［54］。超聲波處理和真空滲透輔助的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法能夠促進(jìn)農(nóng)桿菌的吸附，提高轉(zhuǎn)化效率。超聲波具有空化作用，會使愈傷組織表面產(chǎn)生微孔，促進(jìn)農(nóng)桿菌菌液滲透到愈傷組織中［55］，從而加速農(nóng)桿菌對植物細(xì)胞的侵染，提高轉(zhuǎn)化效率。對小麥莖尖進(jìn)行超聲波處理發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時間為 20 s、頻率為5 kHz時，轉(zhuǎn)化效率顯著提高，獲得了轉(zhuǎn)基因植株［56］。此外，超聲波具有熱化作用，但是在超聲過程中會使介質(zhì)溫度升高，從而對外植體造成不可逆的傷害。因此，對于莖尖分生組織較為脆弱的外植體而言，要選擇最適宜的超頻波段和時長，從而減少外植體的損傷，提高效率［57-59］。在農(nóng)桿菌侵染莖尖愈傷的過程中輔助一定時間的真空滲入處理，可以有效提高莖尖愈傷的瞬時轉(zhuǎn)化率。可能由于在真空環(huán)境下，外界壓力能夠使農(nóng)桿菌更容易進(jìn)入到愈傷組織里面，而且負(fù)壓能夠使受體材料形成更多的小傷口，從而提高侵染的機(jī)會［60］。適宜的真空滲透時間對莖尖轉(zhuǎn)化效率有促進(jìn)作用，對谷子進(jìn)行真空滲透處理10 min時最有利于基因的轉(zhuǎn)化，并且隨著滲透時間的延長，對莖尖的傷害越大，莖尖存活率越低，當(dāng)真空滲透處理時間超過 15 min 后，存活率低于20%［61］。當(dāng)對大麥真空處理5 min時，瞬時表達(dá)效率最高，其他處理時間（0、2.5、7.5、10 min）的瞬時表達(dá)效率較低［1］。真空滲透處理對提高轉(zhuǎn)化效率有一定作用，但傷害較大，因此使用該方法時，要注意外植體的質(zhì)量。

3.4 菌株濃度及侵染時間

在根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，適當(dāng)?shù)木簼舛仁寝D(zhuǎn)化成敗的關(guān)鍵因素之一，當(dāng)菌液濃度過低時，會由于根癌農(nóng)桿菌數(shù)量不足而達(dá)不到侵染的目的；當(dāng)菌液濃度過高時，又會因營養(yǎng)不足使菌液中的死菌數(shù)量增多，從而降低感染率（表2）。適當(dāng)提高菌液濃度可提高虎杖莖尖的轉(zhuǎn)化率，當(dāng)菌液的D600 nm=0.6時，轉(zhuǎn)化率是D600 nm=0.2時的2倍，但當(dāng)菌液D600 nm=0.8時，轉(zhuǎn)化效率顯著降低［5］。當(dāng)菌液D600 nm=0.6時，用其侵染谷子莖尖，轉(zhuǎn)化效果最佳；當(dāng)菌液D600 nm=0.4或0.8時，用其侵染谷子莖尖，GUS瞬時表達(dá)效率均低于D600 nm=0.6的菌液［24］。適宜的菌液濃度對遺傳轉(zhuǎn)化效率有直接影響。用D值法檢測細(xì)菌細(xì)胞密度時，既有活菌，也有死菌，不能代表農(nóng)桿菌的真實(shí)生存能力［58］。因此，最佳菌液濃度仍需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

適宜的菌液侵染時間對植物莖尖的遺傳轉(zhuǎn)化具有重要的調(diào)控作用?；⒄惹o尖的最佳侵染時間為 10 min，轉(zhuǎn)化率達(dá)5.3%，當(dāng)侵染時間為25 min時，轉(zhuǎn)化率極低且再生芽生長狀態(tài)弱，當(dāng)侵染時間為 5 min 時，轉(zhuǎn)化率較差［5］。對小麥莖尖進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，農(nóng)桿菌菌液D600 nm為0.6、侵染時間為30 min為最佳轉(zhuǎn)化條件，侵染時間過長，則會產(chǎn)生死亡或者褐化現(xiàn)象，當(dāng)侵染時間為40 min時，愈傷出現(xiàn)部分死亡［56］。

3.5 AS濃度

在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物材料的過程中，需要酚類化合物誘導(dǎo)完成，因此，外源添加酚類化合物能夠促進(jìn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率。酚類化合物乙酰丁香酮（AS）可誘發(fā)農(nóng)桿菌內(nèi)Ti或Ri質(zhì)粒DNA上Vir區(qū)基因的活化和高效表達(dá)，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中。

有研究發(fā)現(xiàn)，AS的有效使用濃度一般為50～400 μmol/L，適當(dāng)濃度的AS在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基及共培養(yǎng)基中有促進(jìn)作用［66］。在其他植物培養(yǎng)過程中，使用適宜該作物的AS含量可提高轉(zhuǎn)化效率，在玉米莖尖培養(yǎng)過程中，加入AS后，抗性愈傷誘導(dǎo)率顯著提高，在農(nóng)桿菌懸浮液中，當(dāng)AS添加濃度達(dá)60 mg/L時，產(chǎn)生抗性植株，當(dāng)AS添加濃度大于 60 mg/L 時，隨著添加AS濃度的升高，抗性植株數(shù)量迅速減少，且當(dāng)AS濃度為120 mg/L時，不再產(chǎn)生抗性植株。在農(nóng)桿菌侵染后的傷口處滴加濃度為0～150 μmol/L AS發(fā)現(xiàn)，隨AS濃度升高，抗性植株增多，轉(zhuǎn)化效率提高，當(dāng)?shù)渭拥腁S濃度超過 150 μmol/L 時，抗性植株數(shù)量減少［67］。在穇莖尖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，當(dāng)AS為100 μmol/L時，轉(zhuǎn)化效率達(dá)11.8%，而當(dāng)未添加AS時，無轉(zhuǎn)化植株，此外，添加較低濃度（50 μmol/L）和較高濃度（150、200 μmol/L）AS的轉(zhuǎn)化效率均較低［63］。

3.6 共培養(yǎng)

共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌侵染外植體傷口細(xì)胞、實(shí)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。共培養(yǎng)為農(nóng)桿菌提供適合生存的環(huán)境，促進(jìn)外植體與農(nóng)桿菌接觸，使目的基因與受體基因組整合。當(dāng)共培養(yǎng)時間太短時，T-DNA 轉(zhuǎn)移不能完成，使得外源基因很難整合到植物基因組中，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低；當(dāng)共培養(yǎng)時間太長時，農(nóng)桿菌大量增殖，導(dǎo)致外植體過度感染而褐化死亡［32，68-70］。適當(dāng)增加共培養(yǎng)時間，對虎杖莖尖分化有促進(jìn)作用，當(dāng)共培養(yǎng)時間達(dá)到3 d時，分化率達(dá)到最高［5］。在木豆莖尖培養(yǎng)過程中，延長共培養(yǎng)時間會導(dǎo)致農(nóng)桿菌過度生長，從而影響其再生和轉(zhuǎn)化效率［54］。在黃麻莖尖培養(yǎng)過程中，設(shè)置共培養(yǎng)時間為1、2、3 d，當(dāng)共培養(yǎng)時間達(dá)到3 d時，得到的GUS陽性莖尖數(shù)量最多，從而證實(shí)，適當(dāng)延長共培養(yǎng)時間能夠提高轉(zhuǎn)化效率［51］。

3.7 篩選劑的選擇

在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中，使用篩選劑可篩選抗性組織。但培養(yǎng)基中篩選劑的選擇會在一定程度上影響外植體的生理狀態(tài)［68，71］。因此，選擇合適的篩選劑對于提高陽性率有促進(jìn)作用。

篩選劑需要根據(jù)導(dǎo)入表達(dá)載體標(biāo)記基因的不同而選擇相應(yīng)的抗生素。目前，植物莖尖遺傳轉(zhuǎn)化中常用的主要篩選劑有卡那霉素（Kan）、潮霉素（Hyg）等。當(dāng)小麥莖尖篩選劑Kan的濃度大于 10 mg/L 時，分化率低；當(dāng)篩選時間為21 d、濃度為 5 mg/L 時，分化率最高［56］。只有選擇適宜的篩選濃度，才能產(chǎn)生較好的篩選效果。Saha等在黃麻莖尖中添加Hyg（2、4、6、10 mg/L）進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Hyg濃度為2 mg/L時，篩選效果不明顯；當(dāng)Hyg濃度為6 mg/L時，篩選效果明顯；當(dāng)Hyg濃度達(dá) 10 mg/L 時，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，存活率降至2.22%［51］。因此，篩選劑濃度的選擇應(yīng)在篩選效果和植物再生之間取得平衡。另外，進(jìn)行篩選培養(yǎng)前，根據(jù)外植體的生理狀態(tài)進(jìn)行無篩選劑培養(yǎng)也是提高再生率的一個選擇。新切的莖尖十分敏感且易發(fā)生壞死，在黃麻莖尖進(jìn)行普通培養(yǎng)7 d后再進(jìn)行篩選培養(yǎng) 14 d，易得到狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)基因組培苗［51］。適宜的篩選時間和篩選時長可以提高轉(zhuǎn)化效率和再生效率。

4 植物遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展和優(yōu)化

4.1 遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究進(jìn)展

遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是探究基因功能和開展遺傳育種的重要手段。植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可以突破不同物種間的生殖隔離，且靶標(biāo)性極高［72］。人類通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，定向改良植物的遺傳性狀，獲得了新品種作物。自從人們1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因植物以來，植物基因工程的研究開始得到蓬勃發(fā)展［73］。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法具有高效、簡便、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物基因工程領(lǐng)域。基因槍法是1987年由Sanford等最先提出的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，是繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法后又一應(yīng)用廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)［74］。但是目前此方法只能轉(zhuǎn)移小于10" kb的DNA片段，較大的DNA片段在轟擊過程中易斷裂，導(dǎo)致DNA整合混亂［75］。DNA修復(fù)技術(shù)可解決DNA整合混亂。采用基因槍法將GUS基因轉(zhuǎn)化至水稻未成熟的胚中，水稻的轉(zhuǎn)化效率能提高到7692%［76］。與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法相比，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化迅速且高度穩(wěn)定［77］，但受體種類受限，且最終產(chǎn)物翻譯不準(zhǔn)確［78］。脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化可以通過質(zhì)膜融合或原生質(zhì)體內(nèi)吞作用將外源DNA引入原生質(zhì)體［79］，目前還沒有脂質(zhì)體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化成功的例子［78］。1992年，研究者首次利用碳化硅纖維將含有目的基因的質(zhì)粒傳遞至煙草細(xì)胞中［80］。2008年，研究者利用碳化硅纖維介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得抗鹽棉花［81］。但是，碳化硅晶體介導(dǎo)的處理由于會損傷細(xì)胞，從降低細(xì)胞的再生能力，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低下。碳化硅纖維有致癌風(fēng)險，操作過程中需謹(jǐn)慎進(jìn)行［82］。為了解決細(xì)胞損傷、轉(zhuǎn)化效率低及DNA整合混亂等問題，納米顆粒介導(dǎo)的基因傳遞法誕生，該方法可以在不使用外部作用力的情況下，將生物分子傳遞到完整的植物細(xì)胞中［83］，包括納米磁性顆粒、肽納米顆粒、層狀雙氫氧化物納米片、DNA納米結(jié)構(gòu)和碳納米管。例如，目前人們已經(jīng)利用磁性納米顆粒介導(dǎo)的基因傳遞法將Bt基因轉(zhuǎn)入棉花花粉中，從而成功獲得抗蟲植株［84］。

4.2 轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)化方案

植物遺傳轉(zhuǎn)化可以通過賦予作物理想的遺傳特性來提高作物產(chǎn)量和對非生物或生物脅迫的耐受性［85］。然而，目前高效率的遺傳轉(zhuǎn)化仍然是許多作物遺傳轉(zhuǎn)化工作面臨的挑戰(zhàn)［78］，建立簡單高效的再生體系、轉(zhuǎn)化體系對于通過分子技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)植物品質(zhì)的改良至關(guān)重要。采用適宜的遺傳轉(zhuǎn)化方法、基因傳遞載體和選擇標(biāo)記基因及應(yīng)用植物生長因子等是提高植物遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要途徑。

植物遺傳轉(zhuǎn)化常用的轉(zhuǎn)基因方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法［86］、基因槍法［87］等。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是一種通用的植物轉(zhuǎn)化方法，此方法簡單易行、轉(zhuǎn)化率髙，且不需要特殊的儀器設(shè)備，已成為應(yīng)用最為廣泛的植物轉(zhuǎn)化方法。目前，影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化率的因素除了前文所描述的再生系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)外，還包括基因傳遞載體的選擇和載體元件（如啟動子、報告基因）的優(yōu)化。在通常情況下，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時使用雙元表達(dá)載體（pGA482GG［88］、pCAMBIA2301s［89］和pBI121［90］等）。在試驗(yàn)過程中，最好針對不同的轉(zhuǎn)化受體篩選合適的載體，以提高轉(zhuǎn)化效率。在黨參中，使用pCAMBIA1301載體的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)91.07%［91］，而采用載體pDONR-207或過表達(dá)載體pEarleyGate202的轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)低于90.00%［92］。啟動子作為最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對調(diào)控靶基因的表達(dá)模式起著至關(guān)重要的作用。在大麥中，應(yīng)用Glub1啟動子的相對表達(dá)量是應(yīng)用Ubi-i啟動子的3～25倍［93］。雙元載體骨架上的驅(qū)動篩選標(biāo)記的啟動子對轉(zhuǎn)化效率有較大影響。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，雙孢蘑菇GPD啟動子、構(gòu)巢曲霉trpC啟動子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率分別為15%、1%［94］。另外，報告基因能夠確保從非修飾細(xì)胞中快速準(zhǔn)確地選擇修飾細(xì)胞，從而節(jié)約篩選時間和提高轉(zhuǎn)化效率［95-96］。β-葡糖醛酸酶（GUS）是被廣泛使用的報告基因系統(tǒng)之一，目前已有上千種轉(zhuǎn)基因植物利用GUS作為報告基因，如小麥［97］、白楊［98］、大麥［99］和茶［100］。目前常用的報告基因有綠色熒光蛋白基因（GFP［101-102］、SGFP［103］、EGFP［104］）和紅色熒光蛋白基因（DsRed［105］）。通過使用GFP或者DsRed標(biāo)記對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行篩選，已成功獲得了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥、水稻、黃瓜和玉米轉(zhuǎn)基因陽性植株［101-104］?；ㄇ嗨乜梢宰鳛橐环N無創(chuàng)報告基因，其中RUBY系統(tǒng)作為報告基因具有廣闊的應(yīng)用前景。在水稻中，利用RUBY產(chǎn)生的顏色可區(qū)分轉(zhuǎn)基因（紅色）和非轉(zhuǎn)基因組織（淡黃色）［106］。除雙元表達(dá)載體外，近些年來，以細(xì)胞穿透肽（CPP）為媒介的肽基基因傳遞系統(tǒng)被認(rèn)為是一種高效、穩(wěn)定的非病毒的轉(zhuǎn)基因工具［107］。CPP通過二硫鍵連接DNA負(fù)載物，并經(jīng)內(nèi)吞進(jìn)入受體細(xì)胞。受體細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽促使二硫鍵斷裂釋放DNA負(fù)載物，在植物中實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移［108］?；驑尫ㄒ彩沁z傳轉(zhuǎn)化的常用方法之一。Klein等首次使用包裹煙草花葉病毒 RNA的金屬鎢顆粒轟擊洋蔥細(xì)胞并得到遺傳表達(dá)，證明該法可行［109］。影響基因槍轉(zhuǎn)化效率的因素主要包括轉(zhuǎn)化參數(shù)的選擇、受體類型和基因型等。其中，基因槍參數(shù)的選擇最為關(guān)鍵，在實(shí)際操作中，需要根據(jù)不同物種和受體及基因槍型號來選擇最佳參數(shù)，再配合相應(yīng)的培養(yǎng)和篩選條件，達(dá)到最高的轉(zhuǎn)化效率［110］。在對煙草進(jìn)行轟擊時，壓強(qiáng)參數(shù)已經(jīng)從1 550 Pa優(yōu)化至1 350 Pa，效果最佳的為1 μm的金粒子，效率可以達(dá)到鎢粒子的2.5 ～ 54倍［110］。當(dāng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法不能在單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化中使用時，基因槍法解決了這一難題［111］。1988年，Rhodes等通過基因槍法首次得到轉(zhuǎn)基因玉米［112］，3年后（1991年）Gould等才通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法得到玉米轉(zhuǎn)基因植株［113］。另外，簡化載體主干及通過構(gòu)建只包括基因啟動子、編碼區(qū)及終止子的表達(dá)盒這種簡單的整合方式來提高基因槍轟擊法的轉(zhuǎn)化效率已被證實(shí)有效［114］。目前，研究者已經(jīng)利用最小基因盒對葡萄胚性細(xì)胞懸液進(jìn)行粒子轟擊，并得到裂葉葡萄植株［114］。此外，已經(jīng)有研究者利用基因槍法在煙草［115］、玉米［116］、棉花［117］等植物上建立了成熟的基因槍轉(zhuǎn)化體系，并得到了抗病［118］、抗逆［119］和品質(zhì)優(yōu)良［120］的植株。

轉(zhuǎn)化植物再生困難還受植物基因型的限制［120］。發(fā)育調(diào)節(jié)因子的過表達(dá)可能是打破基因型限制、促進(jìn)植物再生的一種有效策略。調(diào)控植物生長發(fā)育相關(guān)基因BABY BOOM（BBM）、WUS、Growth-regulating factor （GRF）的異位表達(dá)是解決轉(zhuǎn)化后再生率低問題的有效途徑［14-15，121］。WUS基因最初被認(rèn)為是在擬南芥莖尖分生組織中維持多能干細(xì)胞池的必要條件［122］，現(xiàn)已證明其在體細(xì)胞胚胎發(fā)生中有促進(jìn)作用。轉(zhuǎn)化含有WUS基因的過表達(dá)載體后，其再生效率優(yōu)于對照材料［123］。在白樺中過表達(dá)WUS基因后，轉(zhuǎn)基因系植物分化的不定芽明顯多于對照組，再生效率也比對照組高［124］。WUS、BBM是體細(xì)胞胚形成的正向作用因子，它們的表達(dá)可促進(jìn)體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變［125］。在玉米遺傳轉(zhuǎn)化過程中，同時過表達(dá)WUS、 BBM后，轉(zhuǎn)化效率可以獲得顯著提高，有研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的BBM和WUS的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因體系也適用于高粱、秈稻的遺傳轉(zhuǎn)化［126］。在玉米幼胚轉(zhuǎn)化時，過表達(dá)WUS、BBM，可將轉(zhuǎn)化效率提升至15%［127］。但是，WUS是影響植物細(xì)胞分化的重要基因之一，過表達(dá)WUS后容易造成植物器官發(fā)育異常。在小麥細(xì)胞中過表達(dá)WUS類似基因后，會造成莖縱向伸長不足，從而影響包穗，使產(chǎn)量下降［128］。隨著農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法研究的不斷深入，轉(zhuǎn)化體系逐漸得到完善，轉(zhuǎn)化效率的提升成為進(jìn)一步發(fā)展的重點(diǎn)。一些植物品種本身的遺傳轉(zhuǎn)化效率低，若用其表達(dá)一些特定基因，則有可能提高轉(zhuǎn)化效率。有研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)BBM、WUS2可促進(jìn)高粱、甘蔗未熟胚胎的轉(zhuǎn)化，從而提高轉(zhuǎn)化效率［127］。發(fā)育調(diào)節(jié)因子雖然是一種促進(jìn)再生的有效因素，但在其表達(dá)時也會出現(xiàn)負(fù)反饋。為了解決這種負(fù)反饋，應(yīng)用生長調(diào)節(jié)因子（GRF）、轉(zhuǎn)錄輔助因子（GIF）相互作用并形成功能性轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。在該復(fù)合體中，GIF負(fù)責(zé)將基因重新整合，GRF則使基因表達(dá)或者抑制。GRF-GIF調(diào)節(jié)干細(xì)胞及其快速分裂，進(jìn)而促進(jìn)了植物再生［129］。目前，許多植物通過GRF-GIF復(fù)合體獲得再生植株，包括大豆［130］、玉米［131］和柑橘［132］。相關(guān)GRF-GIF復(fù)合體應(yīng)用至遺傳轉(zhuǎn)化研究中，具有良好的表現(xiàn)，推測其在植物莖尖研究中具有應(yīng)用潛力。

5 植物基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展

基因編輯是一項(xiàng)對生物體基因進(jìn)行靶向修飾的新技術(shù)，包含巨型核酸酶（MegNs）、鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）和規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇（CRISPR/Cas）［133］。20世紀(jì)80年代后期發(fā)現(xiàn)的巨型核酸酶是一種脫氧核糖核酸內(nèi)切酶，可以識別12～40 bp的DNA序列，但是受到酶體巨大、特定長序列限制，其應(yīng)用較難［134］。基于ZFNs的基因編輯技術(shù)則主要受限于ZFNs對細(xì)胞有毒性和脫靶效應(yīng)［135］。2009年，為了解決ZFN技術(shù)的局限性，TALEN技術(shù)誕生［136］。CRISPR/Cas系統(tǒng)是繼ZFN、TALEN技術(shù)后最新發(fā)現(xiàn)的基因編輯技術(shù)，更簡單有效。其中，CRISPR/Cas9技術(shù)的建立和完善，為育種工作提供了有力的工具，極大地推動了作物品質(zhì)改良的研究［137］。BnaEOD3基因在不同作物的種子大小控制中起著關(guān)鍵作用，油菜中能夠有效產(chǎn)生BnaEOD3基因的靶向突變，并穩(wěn)定傳遞到T1、T2代中，從而提高油菜籽重量，為油菜籽育種提供了寶貴資源［138］。Jeong等通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得不依賴春化的早開花表型大白菜，實(shí)現(xiàn)了對植物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)［139］。在對植物進(jìn)行基因編輯、促進(jìn)植物適應(yīng)復(fù)雜生態(tài)環(huán)境的同時，可以進(jìn)一步提高植物的遺傳效率，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻進(jìn)行定點(diǎn)編輯，能夠迅速獲得溫敏雄性核不育的高產(chǎn)水稻［140］。發(fā)育調(diào)節(jié)因子和基因編輯技術(shù)結(jié)合，能夠使無性植物外植體誘導(dǎo)出分生組織，再得到基因編輯植株，并且將這些突變傳遞給下一代，從而消除了無菌培養(yǎng)的必要，提高了基因編輯效率［141］?；蚓庉嫼蟮姆阎?，成功嵌入了CLV、WUS基因，提高了番茄的轉(zhuǎn)基因效率和產(chǎn)量［142］。GRF-GIF復(fù)合體可作為一種植物再生助推器，從而提高植物的陽性再生率，還能進(jìn)一步應(yīng)用至基因編輯中得到新品種［143］，因此，該復(fù)合體為進(jìn)一步提高基因編輯效率提供了良好的轉(zhuǎn)化工具。雖然CRISPR/Cas9技術(shù)為基因組定向修飾帶來了新突破，但是該技術(shù)研究時間尚短，如小概率的脫靶現(xiàn)象仍存在，因此該技術(shù)仍需繼續(xù)探索。目前，全球生物公司正在競相開發(fā)具有理想性狀的基因編輯作物，并將其推向國際市場，例如日本具有降血壓功效的番茄已經(jīng)上市［144］，但是未來這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展仍取決于各國如何監(jiān)管基因編輯作物。2023年4月28日，中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了中國首個基因編輯生物安全證書，標(biāo)志著編輯產(chǎn)品已經(jīng)可以用于育種及生產(chǎn)環(huán)節(jié)。基因編輯技術(shù)在保障糧食生產(chǎn)、可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展、應(yīng)對氣候變化等方面的作用更加凸顯。但據(jù)我們所知，莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)未應(yīng)用到基因編輯研究中，若將該技術(shù)與莖尖結(jié)合，再加大發(fā)育調(diào)節(jié)因子的研究與應(yīng)用，推測可提高轉(zhuǎn)化再生效率。此外，對靶基因進(jìn)行改進(jìn)有望突破基因編輯瓶頸。

6 研究展望

多年來，植物莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的開發(fā)及優(yōu)化，為植物基因功能解析、優(yōu)良品種培育作出了重要貢獻(xiàn)。隨著主要農(nóng)作物重要功能基因的挖掘及轉(zhuǎn)基因新品種培育的展開，發(fā)展并優(yōu)化莖尖遺傳轉(zhuǎn)化的安全高轉(zhuǎn)基因技術(shù)始終是中國轉(zhuǎn)基因植物研發(fā)的重點(diǎn)方向之一。

近年來，研究者雖然在莖尖再生和遺傳轉(zhuǎn)化方法上獲得了一定成果，但轉(zhuǎn)化再生體系仍不完善，轉(zhuǎn)化效率依舊處于較低階段。隨著再生體系的不斷優(yōu)化和轉(zhuǎn)化效率的不斷提高，轉(zhuǎn)基因研究遭遇的瓶頸問題在今后的研究中將逐步被攻克。在提高再生效率方面，需就外植體類型、培養(yǎng)基類型和植物生長調(diào)節(jié)劑等因素進(jìn)行綜合優(yōu)化；在促進(jìn)外源基因?qū)敕矫?，需要著重不同侵染方法、篩選合適的農(nóng)桿菌菌株以及侵染條件，以利于轉(zhuǎn)化效率的提高。選擇適合的雙元載體、CPP工具或納米顆粒，對基因轉(zhuǎn)移效率提升也有幫助。外源基因表達(dá)量不足往往是得不到理想轉(zhuǎn)基因植物的重要原因，在載體構(gòu)建過程中，通常需要根據(jù)試驗(yàn)的特定需求對載體進(jìn)行適當(dāng)改造，如更換適合的啟動子、插入增強(qiáng)子、合理使用生長調(diào)節(jié)因子或者插入特定的功能基因，可提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。近年來，隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展及其在園藝作物領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，作物新種質(zhì)相繼問世，如白色豌豆［145］、晚抽薹白菜［146］及高產(chǎn)、直鏈淀粉的小麥［147］等。借助莖尖遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行基因編輯，可以高效、精準(zhǔn)地創(chuàng)制優(yōu)良轉(zhuǎn)基因種質(zhì)，從而培養(yǎng)出更多優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因新品種。

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