摘要" 目的：探討細胞周期依賴性激酶抑制基因（CDKN2B）單核苷酸多態(tài)性（SNP）與2型糖尿病（T2DM）人群心肌梗死發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系，以早期篩查T2DM病人中的心肌梗死高危人群。方法：選取山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院收治的461例T2DM病人，其中114例合并心肌梗死病人作為觀察組，347例T2DM不合并冠心病及其他心臟病的病人作為對照組，以CDKN2B 基因rs3217992位點為遺傳標記，檢測研究對象的基因型，使用MassARRAY遺傳分析系統(tǒng)進行SNP分型。采用多因素Logistic 回歸分析基因多態(tài)性與心肌梗死的關(guān)系。結(jié)果：觀察組CDKN2B單核苷酸多態(tài)性rs3217992 A等位基因頻率較對照組增高（χ2＝9.36，P＝ 0.002）；多因素Logistic 回歸分析顯示，CDKN2B基因 rs3217992位點AG/AA基因型是T2DM人群心肌梗死發(fā)病的獨立危險因素。結(jié)論：CDKN2B 基因多態(tài)性與糖尿病人群心肌梗死風(fēng)險相關(guān)，rs3217992位點可作為T2DM人群心肌梗死風(fēng)險預(yù)測的有效遺傳因子。

關(guān)鍵詞" 2型糖尿?。恍募」Ｋ?；細胞周期依賴性激酶抑制基因2B；單核苷酸多態(tài)性

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.19.021

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）目前已經(jīng)成為最常見的慢性疾病之一，其特征為胰島素產(chǎn)生不足或胰島素抵抗引起的高血糖，是一種代謝性疾病。國際糖尿病聯(lián)合會（IDF）估計我國糖尿病病人2021年超過1.4億人，2045年將達到1.74億人以上［1］。糖尿病導(dǎo)致死亡的主要原因為糖尿病的大血管并發(fā)癥，包括冠心病、心肌病、心律失常、猝死、腦血管疾病和外周動脈疾?。?］。因此，致力于防治糖尿病病人的心血管并發(fā)癥和降低其死亡率是非常必要的。

傳統(tǒng)的心血管疾病風(fēng)險因素不能完全解釋糖尿病心血管疾病風(fēng)險和心血管疾病死亡率的增加。大量證據(jù)表明，遺傳風(fēng)險因素可以解釋2型糖尿?。═2DM）中無法解釋的心血管風(fēng)險［3］。全基因組關(guān)聯(lián)（genome-wide association study，GWAS）研究發(fā)現(xiàn)，在9p21附近的細胞周期依賴性激酶抑制基因（cyclin-dependent kinase inhibitor 2b，CDKN2B）為糖尿病與心血管疾病的共享基因［4］。鑒于目前國內(nèi)外研究其與糖尿病人群心肌梗死的關(guān)系較少報道，本研究著重探討 CDKN2B基因rs3217992多態(tài)性與T2DM人群心肌梗死風(fēng)險的關(guān)系，為糖尿病人群心血管并發(fā)癥的防治提供參考。

基金項目" 山西省科技廳項目（No.202103021224401）；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（No.2021-158）

作者單位" 1.山西醫(yī)科大學(xué)（太原 030001）；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院（太原 030001）；3.武警山西總隊醫(yī)院

通訊作者" 張彥清，E-mail：lillyblooming@163.com

引用信息" 劉彥宏，張彥偉，岳毅，等.CDKN2B基因多態(tài)性與2型糖尿病人群心肌梗死發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（19）：3569-3572.

1" 資料與方法

1.1" 一般資料

選取山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院收治的461例T2DM病人，入選者均符合1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）提出T2DM診斷標準，其中 114例T2DM合并心肌梗死病人為觀察組，其余347例T2DM病人（不合并冠心病及其他心臟病）為對照組。心肌梗死診斷符合《冠狀動脈粥樣硬化性心臟病診斷標準（WS 319—2010）》。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》。所有研究對象均采用統(tǒng)一的調(diào)查問卷收集臨床資料，包括年齡、性別、身高、體重、高血壓病史、糖尿病史、高脂血癥病史、冠心病史、家族史等。

納入標準：符合T2DM診斷標準；知曉研究內(nèi)容，且自愿簽署知情同意書。排除標準：肝腎功能嚴重異常者；精神異常無法配合檢查者；既往有冠心病之外的其他心臟病史者；住院期間死亡者。

1.2" 方法

采集所有受試者5 mL清晨空腹靜脈血，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩悠啡〕霾⒃谑覝叵陆鈨?。采用標準流程，使用血液基因組blood genomic DNA mini kit試劑盒（太原萊博里生物技術(shù)有限公司）檢測。DNA制備過程：將200 μL血液樣本與20 pL蛋白酶K、200 pL緩沖GL在離心管沖充分混勻。細胞置于56 ℃孵育10 min，再加入200 μL無水乙醇進行短暫離心，將上述溶液全部加入備有收集管的吸附柱中，以1 200 r/min離心1 min，倒出廢液，將吸附柱放回收集管中。再加入500 μL緩沖液GW1，1 200 r/min離心1 min，重復(fù)上述步驟。室溫下放置數(shù)分鐘干燥后放入－80 ℃冰箱保存。

通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增目標序列，檢測出SNP位點信息。SNP基因分型使用MassARRAY遺傳分析系統(tǒng)（Sequenom，San Diego，CA，USA）進行。引物由軟件AssayDesigner 3.1設(shè)計，引物使用ABI Assayby-Design服務(wù)在線設(shè)計。

1.3" 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 27.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗進行 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測。定性資料用例數(shù)、百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，采用非參數(shù)檢驗。應(yīng)用多因素 Logistic 回歸分析 CDKN2B基因rs3217992多態(tài)性與北方T2DM人群心肌梗死風(fēng)險的關(guān)系，并計算風(fēng)險比值比（OR）及其95%置信區(qū)間（95% CI）值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2" 結(jié)" 果

2.1" 兩組一般資料比較

觀察組年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、代謝綜合征占比、高血壓占比高于對照組，糖尿病病程較對照組延長，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組在性別、空腹血糖、高密度脂蛋白及低高密度脂蛋白血癥占比方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.2" 兩組 rs3217992 基因型及等位基因分布

兩組各基因型及等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡。觀察組rs3217992 A等位基因頻率高于對照組（χ2＝9.36，P＝0.002）。詳見表2。

2.3" T2DM病人發(fā)生心肌梗死的多因素 Logistic 回歸分析

以是否合并心肌梗死為因變量，以基因多態(tài)性、年齡、BMI、代謝綜合征、高血壓、糖尿病病程為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，CDKN2B基因rs3217992位點 AG基因型、AA 基因型、代謝綜合征、年齡以及糖尿病病程與心肌梗死發(fā)病有關(guān)，是糖尿病病人發(fā)生心肌梗死的獨立危險因素。即AA基因型糖尿病病人發(fā)生心肌梗死的風(fēng)險為GG基因型病人的5.175倍（OR＝5.175，P＜0.001），AG基因型為GG基因型的3.859倍（OR＝3.859，P＝0.002）。協(xié)變量分析顯示，病人確診糖尿病時間每增加1個月，相應(yīng)風(fēng)險提高0.018倍（OR＝1.018，P＜0.001）；病人年齡每增加1歲，相應(yīng)風(fēng)險提高0.082倍（OR＝1.082，P＜0.001）。詳見表3。

3" 討" 論

近年來，全基因組關(guān)聯(lián)研究已成為快速識別影響常見疾病易感性的遺傳變異的有力方法。在這方面，一些相關(guān)基因組顯示出高風(fēng)險或具有保護作用。大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)研究和臨床隊列研究調(diào)查了遺傳決定因素、低血糖和胰島素抵抗等因素對心血管疾病風(fēng)險的影響，并解釋了T2DM 中的心血管疾病風(fēng)險［3］。

rs3217992為9號染色體CDKN2B 和ANRLT（反義非編碼RNA）附近的單核苷酸變異。9p21位點附近存在INK4基因座。CDKN2A和CDKN2B是位于INK4位點的兩個相鄰位置，分別編碼細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑INK4家族的兩個成員p16INK4A和p15INK4B。CDKN2A和CDKN2B參與了在人類癌癥中失活的主要腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)，并影響關(guān)鍵生理過程［5］。這兩種蛋白質(zhì)在細胞周期調(diào)節(jié)中都發(fā)揮著重要作用，通過在轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）誘導(dǎo)的生長抑制中的作用，都與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制有關(guān)［6-7］。Hannou等［8］綜述了通過功能基因組研究識別到CDKN附近基因產(chǎn)物（CDKN2A/B和ANRIL）在糖尿病與心血管疾病病理生理學(xué)中的功能。Rivera等［4］報道9p21.3位點與心血管疾病嚴重程度相關(guān)，并且9p21.3變異與心血管疾病嚴重程度的關(guān)聯(lián)數(shù)量因T2DM的存在與否而異。

ANRIL又稱CDKN2B-AS1，也存在于INK4基因組區(qū)間，以反義方向編碼一長鏈非編碼RNA，通過調(diào)控機制參與影響附近的CDKN2A和CDKN2B基因［9-11］。在基因調(diào)控、染色質(zhì)組織、翻譯調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。一項研究鑒定了248個與冠心病基因組共定位位點，強調(diào)了 mRNA 剪接的遺傳調(diào)控作為冠心病遺傳風(fēng)險分子機制的重要性［12］。常見疾病的基因組相關(guān)性研究，以上基因已被確定為與T2DM相關(guān)的遺傳易感性位點［13-14］。有實驗研究表明，CDKN2B-AS1上調(diào)促進了血管平滑肌細胞（VSMC）細胞增殖和遷移，從而加重T2DM血管損傷后的內(nèi)膜增生［15］。通過全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)ANRI也與動脈粥樣硬化性心血管疾病相關(guān)［16-18］。另外，ANRIL不同亞型也顯示出不同的風(fēng)險性。一項關(guān)于高血壓病人的病例對照研究顯示，線性ANRIL有動脈粥樣硬化進展作用，觀察組圓形/線性比率也明顯降低［19］。ANRIL亞型的表達可能有助于預(yù)測冠心病結(jié)果，有研究表明，線性亞型與高危冠狀動脈旁路移植手術(shù) CABG的全因死亡率有關(guān)，而 ANRIL 環(huán)狀亞型表達與氧化應(yīng)激的減少相關(guān)［20］。聯(lián)合ANRIL預(yù)測支架內(nèi)再狹窄（ISR）更有效，再狹窄病人lncRNA ANRIL上調(diào)［21］。相反，環(huán)狀A(yù)NRIL亞型已被證明具有動脈粥樣硬化保護作用［22］。

早期研究顯示，CDKN2B 基因中的rs3217992和 rs1063192 與男性受試者的心肌梗死相關(guān)。對于rs7027989 、rs3217992，與具有 GG 基因型的男性受試者相比，具有 AA 或 AG 基因型的男性受試者心肌梗死的風(fēng)險分別增加了 1.26倍和 1.24倍［23］。這與本研究結(jié)果一致，攜帶A基因更容易并發(fā)心肌梗死。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2B-AS1基因的多態(tài)性與我國人群早發(fā)三支血管病變（PTVD）及我國漢族群體散發(fā)性顱內(nèi)動脈瘤（IA）發(fā)病率有關(guān)［24］，但rs3217992位點與不良事件無明顯相關(guān)［25］，可能存在人群異質(zhì)性。

本研究結(jié)果表明，T2DM人群的基因型及等位基因頻率間比較，觀察組CDKN2B基因 rs3217992位點A等位基因頻率高于對照組，提示 CDKN2B基因與心肌梗死的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，A 等位基因可能是T2DM人群心肌梗死的易感等位基因（χ2＝9.36，P＝0.002）。經(jīng) Logistic回歸分析顯示，CDKN2B基因rs3217992位點AA/AG 基因型與心肌梗死發(fā)病有關(guān)，代謝綜合征、年齡以及糖尿病病程也與心肌梗死發(fā)病有關(guān)，是糖尿病病人發(fā)生心肌梗死的獨立危險因素。因此，更多地關(guān)注病人遺傳標記、年齡、糖尿病病程、是否合并各種代謝綜合征等可以更有效地預(yù)測糖尿病病人患心肌梗死的風(fēng)險。

4" 小" 結(jié)

本研究初步證實了CDKN2B多態(tài)性與T2DM人群心肌梗死患病相關(guān)。但本研究存在以下不足：首先，僅進行單一位點檢測，對于該基因與心肌梗死關(guān)聯(lián)需要更多證據(jù)；其次，納入的人群樣本均來自我國北方漢族人群，未來的研究應(yīng)包括多種族、多地域人口；另外還需要進一步的功能驗證，以確定以上基因位點突變對心肌梗死發(fā)病風(fēng)險的作用機制。

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（收稿日期：2024-03-21）

（本文編輯郭懷印）