摘要

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病由黑腐皮殼菌Valsa"mali引起，是蘋(píng)果生產(chǎn)中威脅最大的病害之一。為了篩選蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的生防菌，本研究對(duì)田間分離的473株細(xì)菌進(jìn)行了室內(nèi)拮抗評(píng)價(jià)和田間防控效果評(píng)價(jià)，并對(duì)防控效果較好的菌株進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，通過(guò)室內(nèi)拮抗菌的篩選，獲得了10株對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌V.mali具有拮抗作用的生防細(xì)菌;對(duì)10株菌進(jìn)行田間防治效果評(píng)價(jià)，結(jié)果表明菌株A18589對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病具有顯著的防治效果，且該菌株對(duì)蘋(píng)果其他病害也具有顯著的室內(nèi)抑菌效果。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及多位點(diǎn)序列分析，菌株A18589被鑒定為貝萊斯芽胞桿菌Bacillus"velezensis。綜上所述，本研究篩選獲得的生防菌A18589對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病具有相對(duì)較好的防治效果，具有替代化學(xué)藥劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病;"黑腐皮殼菌;"貝萊斯芽胞桿菌;"生物防治

中圖分類(lèi)號(hào)：

S"436.611.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼："B

DOI："10.16688/j.zwbh.2023609

Screening"of"biocontrol"bacteria"against"apple"Valsa"canker"and"their"control"effect

GUO"Jiachen，"DONG"Yanhong，"SHI"Zhaoyang，"LI"Bo，"DAI"Pengbo，"WANG"Yanan，"HU"Tongle，CAO"Keqiang，"WANG"Shutong*，"MENG"Xianglong*

（College"of"Plant"Protection，"Hebei"Agricultural"University，"Baoding"071001，"China）

Abstract

Apple"Valsa"canker，"caused"by"Valsa"mali，"is"one"of"the"most"serious"diseases"in"apple"production."In"order"to"screen"biocontrol"bacteria"against"apple"Valsa"canker，"473"strains"of"bacteria"isolated"from"the"field"were"evaluated"for"indoor"antagonism"and"field"prevention"and"control"effects，"and"the"strains"with"better"prevention"and"control"effects"were"identified."The"results"showed"that"through"the"screening"of"antagonistic"bacteria"in"the"laboratory，"10"strains"of"biocontrol"bacteria"with"antagonistic"effect"on"V.mali"were"obtained."The"field"control"effect"of"10"strains"was"evaluated."The"results"showed"that"the"strain"A18589"had"significant"control"effect"on"apple"tree"rot"disease，"which"also"had"significant"indoor"inhibitory"effect"on"other"apple"diseases."The"strain"A18589"was"identified"as"Bacillus"velezensis"by"morphological，"physiological"and"biochemical"characteristics"and"multilocus"sequence"analysis"（MLSA）."In"summary，"the"biocontrol"bacterium"A18589"has"a"relatively"good"control"effect"on"apple"tree"canker，"and"has"potential"application"value"as"an"alternative"to"chemical"agents.

Key"words

apple"Valsa"canker;"Valsa"mali;"Bacillus"velezensis;"biological"control

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病是蘋(píng)果生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重威脅我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展［1］。該病害由黑腐皮殼菌Valsa"mali"Miyabe"et"Yamada引發(fā)，孢子通過(guò)傷口侵入并寄生于果樹(shù)主干、側(cè)枝、小枝和某些輔養(yǎng)枝的樹(shù)皮內(nèi)，侵入后可以潛伏侵染達(dá)2年。當(dāng)條件適合時(shí)可引發(fā)樹(shù)皮腐爛，病害嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)趾麑?shí)［23］。蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌的孢子可以在果樹(shù)的各種類(lèi)型的傷口處定殖，其侵染過(guò)程不產(chǎn)生附著胞，因此主要依賴(lài)外泌細(xì)胞壁降解酶輔助病原物侵入植物組織［45］。

當(dāng)前，蘋(píng)果樹(shù)腐爛病發(fā)生后，通常采用將病斑刮除并結(jié)合涂抹化學(xué)藥劑的方式進(jìn)行防控。然而，頻繁和長(zhǎng)時(shí)間使用化學(xué)藥劑可能導(dǎo)致農(nóng)藥殘留，進(jìn)而引發(fā)環(huán)境污染問(wèn)題。此外，長(zhǎng)期單一的使用殺菌劑，存在使病原體產(chǎn)生耐藥性的潛在風(fēng)險(xiǎn)［6］。因此，應(yīng)研究具備高效性、安全性、低毒性、抗藥性低、兼具防治綜合性及促生特性的生物防治策略，為替代傳統(tǒng)化學(xué)防治手段提供理想途徑［7］。

利用菌株對(duì)病原菌的拮抗性篩選生防菌是目前生防菌篩選最常用的方法之一。芽胞桿菌作為地球微生態(tài)環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)種群，具備提高植株抗逆性的功能，在農(nóng)業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中有著較為廣泛的應(yīng)用［8］。研究發(fā)現(xiàn)，芽胞桿菌對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌表現(xiàn)出顯著的拮抗效果［911］。具體而言，比如萎縮芽胞桿菌Bacillus"atrophaeus"XW2在室內(nèi)展現(xiàn)出卓越的拮抗效果，且在離體枝條上能夠有效預(yù)防腐爛病的發(fā)生［12］。薛應(yīng)鈺等［13］通過(guò)對(duì)菌株JPD1的離體枝條試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株表現(xiàn)出對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的良好防護(hù)效果。然而，在實(shí)際田間應(yīng)用時(shí)，生防菌的存活受到多種環(huán)境因素的制約，包括干燥、紫外輻射和降水等［14］。然而，多數(shù)生防菌株的篩選重視菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)病原菌的拮抗能力，卻容易忽視其在田間的防治效果。

為了篩選出對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病具有防控效果的菌株，本研究從發(fā)生蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的蘋(píng)果園采集土壤，并進(jìn)行生防菌的分離和篩選，對(duì)分離的菌株進(jìn)行室內(nèi)拮抗和田間防治效果研究，旨在獲取對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病具有防控效果的生防菌株，為該病的生物防治提供潛在資源。

1"材料與方法

1.1"土壤細(xì)菌的分離、初篩與復(fù)篩

按照易婷等［15］的方法，使用梯度稀釋法從土樣中分離細(xì)菌。初篩：通過(guò)平板對(duì)峙法初步篩選候選生防菌［16］。

將西北農(nóng)林科技大學(xué)黃麗麗老師課題組提供的菌株編號(hào)為038的蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌餅（直徑7"mm）接種于PDA培養(yǎng)基中央，將蘸有不同細(xì)菌菌懸液（菌懸液濃度為1×109"cfu/mL）的濾紙片（直徑為7"mm）置于病原菌菌餅上下左右3"cm處的4個(gè)方位，28℃黑暗培養(yǎng)7"d，每個(gè)處理3次重復(fù)。采用十字交叉法測(cè)量菌株038菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。復(fù)篩：將菌株038的菌餅接種于PDA培養(yǎng)皿（直徑為90"mm）中央，兩側(cè)放置蘸有初篩效果較好的生防菌菌懸液的濾紙片（直徑為7"mm，菌懸液濃度為1×109"cfu/mL），28℃下黑暗培養(yǎng)。以蘸LB液體培養(yǎng)基的濾紙片為對(duì)照，培養(yǎng)7"d，每個(gè)處理重復(fù)3次。測(cè)定菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.2"發(fā)酵過(guò)濾液對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

復(fù)篩得到的待測(cè)生防菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2"d后獲得發(fā)酵液，采用先離心后過(guò)濾的方法獲得發(fā)酵過(guò)濾液［17］。將發(fā)酵濾液配制成10%的含藥PDA平板，并將菌株038接種于含藥平板的中央，以含有10%"LB液體培養(yǎng)基的PDA平板作

為對(duì)照，28℃培養(yǎng)7"d。測(cè)定抑菌率，每處理重復(fù)3次。

制備038菌株孢子懸浮液（1×105～1×106"cfu/mL），并將孢子懸浮液、生防菌發(fā)酵濾液及2%蔗糖溶液等體積混合，以孢子懸浮液、LB液體培養(yǎng)基及2%蔗糖溶液等體積混合作為對(duì)照。25℃黑暗培養(yǎng)24"h，利用光學(xué)顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)不同處理菌株038孢子萌發(fā)情況，每組進(jìn)行3次重復(fù)。按照以下公式計(jì)算孢子萌發(fā)率和孢子萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)率=萌發(fā)的孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100%；

孢子萌發(fā)抑制率=（對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100%。

1.3"生防菌的離體枝條防治效果評(píng)價(jià)

使用離體枝條法［18］，評(píng)價(jià)生防菌發(fā)酵液對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的保護(hù)效果和治療效果。

保護(hù)效果測(cè)定：從河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)果園采集粗細(xì)一致的兩年生‘富士’蘋(píng)果枝條，剪取30"cm長(zhǎng)的枝段，75%乙醇浸泡30"s，2%次氯酸鈉浸泡1"min，無(wú)菌水沖洗后涂抹液體石蠟和凡士林。使用滅菌后的打孔器在枝條中間及距離中間10"cm處的表面刮出3處圓形傷口，傷口直徑為0.7"cm，露出木質(zhì)部。向傷口中滴加100"μL生防菌株發(fā)酵液（1×109"cfu/mL），用保鮮膜包裹，以3%甲基硫菌靈糊劑（威海韓孚生化藥業(yè)有限公司，125"g/m2）作為對(duì)照藥劑，以L(fǎng)B培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。每種生防菌發(fā)酵液接種5根枝條。生防菌接種3"d后，接種菌株038菌餅（直徑7"mm），保鮮膜包裹接種后枝條，并于25℃黑暗培養(yǎng)。接種病原物7"d后，測(cè)量病斑長(zhǎng)度并計(jì)算防治效果。

治療效果測(cè)定：使用相同的方法對(duì)兩年生蘋(píng)果離體枝條制造傷口，并按照上述方法先接種菌株038的菌餅（直徑7"mm），并用保鮮膜包裹后，25℃黑暗培養(yǎng)72"h。然后將病變組織刮除干凈后，向刮除的部位涂抹50"μL生防菌株發(fā)酵液（1×109"cfu/mL），以3%甲基硫菌靈糊劑（威海韓孚生化藥業(yè)有限公司，125"g/m2）作為對(duì)照藥劑，以L(fǎng)B培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，每種生防菌發(fā)酵液接種5根枝條。接種生防菌14"d后，測(cè)量病斑長(zhǎng)度并計(jì)算防治效果。

1.4"生防菌株的田間防治效果評(píng)價(jià)

通過(guò)田間試驗(yàn)，評(píng)價(jià)生防菌發(fā)酵液在田間活體枝條上對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的保護(hù)效果和治療效果［18］。

保護(hù)效果測(cè)定：從河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)果園選取粗細(xì)一致的兩年生健康枝條（直徑約1.5"cm），按照前述方法，在枝條表面刮出直徑為7"mm的傷口，向傷口中滴加100"μL生防菌株發(fā)酵液（1×109"cfu/mL），用保鮮膜包裹。以3%甲基硫菌靈糊劑（125"g/m2）作為對(duì)照藥劑，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照。每種生防菌發(fā)酵液接種5根枝條，每根枝條3個(gè)接種點(diǎn)。生防菌接種3"d后接種菌株038菌餅（直徑為7"mm），覆膜包裹。接種病原菌14"d后，測(cè)量病斑長(zhǎng)度并計(jì)算防治效果。

治療效果測(cè)定：按照前述方法對(duì)果園中兩年生蘋(píng)果活體枝條制造傷口，并按照上述方法在傷口處接種菌株038菌餅（直徑為7"mm）并用保鮮膜保濕，約7"d后接種部位出現(xiàn)癥狀，刮凈全部變色組織，涂抹50"μL生防菌株發(fā)酵液（1×109"cfu/mL），以3%甲基硫菌靈糊劑（125"g/m2）作為藥劑對(duì)照，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照，用保鮮膜包裹保濕。試驗(yàn)處理與保護(hù)效果測(cè)定，待對(duì)照組癥狀再次全部出現(xiàn)后，接種3個(gè)月后測(cè)量病斑長(zhǎng)度并統(tǒng)計(jì)防治效果。

1.5"生防菌膏劑的田間防治效果測(cè)定

微生物膏劑制備：混合200"g羧甲基纖維素鈉（縮寫(xiě)為CMC，河南萬(wàn)邦）與1"000"mL蒸餾水，沸水浴加熱攪拌至CMC完全溶解，制得糊狀膠液備用。將菌株A18589發(fā)酵液（1×109"cfu/mL）按1∶1的比例加入CMC中攪拌備用。

保護(hù)作用測(cè)定：在田間選取粗細(xì)一致的2～3年生蘋(píng)果枝條，按照前述方法刮出傷口。在傷口以及傷口外圍2"cm處涂抹生防菌膏劑，直至膏劑完全覆蓋傷口為止，以3%甲基硫菌靈糊劑（125"g/m2）作為對(duì)照藥劑，以不含有生防菌的膏劑作為對(duì)照，每種膏劑接種5根枝條。涂抹膏劑后，使用保鮮膜包裹傷口，3"d后在傷口處接種038菌餅（直徑為7"mm），并再次用保鮮膜包裹后保濕處理。接種14"d后，記錄腐爛病的發(fā)病情況，測(cè)量病斑長(zhǎng)度并計(jì)算防治效果。

治療作用測(cè)定：按照前述方法對(duì)田間選取的蘋(píng)果兩年生枝條刮出傷口。先在傷口處接種菌株038的菌餅（直徑為7"mm），并使用保鮮膜包裹后保濕處理。接種7"d后，刮除病變組織，并按照上述方法涂抹生防菌的膏劑，以3%甲基硫菌靈糊劑（125"g/m2）作為對(duì)照藥劑，以不含有生防菌的膏劑作為對(duì)照，每種膏劑接種5根枝條。接種生防菌膏劑接種3個(gè)月后進(jìn)行調(diào)查，測(cè)量病斑長(zhǎng)度并計(jì)算防治效果。

1.6"生防菌株的抑菌譜分析

將供試的蘋(píng)果輪紋病菌Botryosphaeria"dothidea（A1653）、蘋(píng)果炭疽病菌Colletotrichum"fructicola（A22）、蘋(píng)果黑斑病菌Alternaria"alternata（P18484）、棉花絲核病菌Thanatephorus"cucumeris（C0613）、小麥赤霉病菌Fusarium"graminearum（B20903）和梨黑斑病菌Alternaria"tenuissima（BD15）"6種病原菌分別接入新鮮PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3"d后，在菌落邊緣取新鮮菌餅（7"mm），并將菌餅接種于PDA培養(yǎng)皿左側(cè)距離邊緣30"mm處。將蘸有生防菌菌懸液的濾紙片（直徑為7"mm，菌懸液濃度為1×109"cfu/mL）置于相同PDA平板的中軸線(xiàn)右側(cè)距離邊緣30"mm處，28℃下黑暗培養(yǎng)。以L(fǎng)B液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，培養(yǎng)7"d，每個(gè)處理重復(fù)3次。測(cè)定菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。

相對(duì)抑菌率=（對(duì)照菌落擴(kuò)展直徑-處理菌落擴(kuò)展直徑）/對(duì)照菌落擴(kuò)展直徑100%。

1.7"蘋(píng)果腐爛病菌生防菌株A18589的鑒定

篩選的生防菌株，將其劃線(xiàn)接種于LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24"h。記錄菌落顏色和形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色。參考鄭雪晴等［18］和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［19］的方法，對(duì)菌株進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定，以實(shí)驗(yàn)室前期分離和鑒定的菌株X2作為參考菌株［18］。

采用天根生化科技有限公司的細(xì)菌DNA提取試劑盒提取生防菌株A18589的DNA。通過(guò)16S"rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，利用MEGA"5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行單基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析。參照Xuan等［20］的方法，基于6個(gè)持家基因（rpoD、glpF、ilvD、ptA、tpiA、purH）的串聯(lián)序列，利用MEGA"5.0軟件使用最大似然法、TamuraNei模型進(jìn)行多位點(diǎn)序列分析（MLSA）。

1.8"數(shù)據(jù)處理

經(jīng)Microsoft"Excel"2012整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SPSS"24.0軟件分析，Oneway"ANOVA方差分析，顯著性水平α=0.05。

2"結(jié)果與分析

2.1"生防菌株的分離及初篩

通過(guò)平板涂布法從土壤中分離純化獲得473株細(xì)菌菌株。平板對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果顯示，80株細(xì)菌表現(xiàn)出對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌的拮抗作用，占分離細(xì)菌菌株的16.91%。其中，菌株A18589展現(xiàn)出對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌最強(qiáng)的拮抗作用，培養(yǎng)3"d后即表現(xiàn)拮抗效果，培養(yǎng)至5"d時(shí)，蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌與A18589菌餅無(wú)接觸，培養(yǎng)至7"d時(shí)，對(duì)照組的蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌在培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)良好，而受拮抗的蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌則呈現(xiàn)近十字形生長(zhǎng)形態(tài)（圖1）。

2.2"生防菌株的復(fù)篩效果

對(duì)初篩得到的80個(gè)菌株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果表明A18589、C0526等10株菌對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌的菌絲生長(zhǎng)具有顯著的抑制效果，其中菌株A18589和菌株C0526對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌的抑制作用顯著高于其他8個(gè)菌株，抑制率達(dá)86.85%和86.59%（表1）。

2.3"生防菌株發(fā)酵濾液對(duì)腐爛病菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的影響

生防菌發(fā)酵濾液對(duì)腐爛病菌038菌絲生長(zhǎng)

的抑制作用存在顯著差異，抑制率范圍為57.78%

～92.30%。其中對(duì)病原菌生長(zhǎng)有較強(qiáng)抑制作用的拮抗細(xì)菌為A18589、Y27和Y30，抑制率達(dá)91.11%～92.30%。生防菌發(fā)酵過(guò)濾液對(duì)腐爛病菌038的孢子萌發(fā)具有顯著抑制作用，其中A18589菌株的抑制效果最為顯著，抑制率達(dá)72.81%，其次為菌株Y27，抑制率為59.01%，其他菌株的抑制率均低于59%（表2）。

2.4"生防菌株發(fā)酵液對(duì)離體枝條的防治效果

采用先注射發(fā)酵液后接種病原菌的方式評(píng)價(jià)10株拮抗細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的保護(hù)效果，采用先接種病原菌后涂抹發(fā)酵液的方式評(píng)價(jià)10株拮抗細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的治療效果。結(jié)果表明，除了Y18之外，無(wú)論是保護(hù)效果試驗(yàn)還是治療效果試驗(yàn)中，生防菌處理后的病斑長(zhǎng)度均顯著低于清水對(duì)照（Plt;0.05），但是均顯著大于對(duì)照藥劑處理后的病斑長(zhǎng)度（表3）。在所有的10株細(xì)菌中，菌株A18589、APH25、Y30與Y27的發(fā)酵液的治療效果和保護(hù)效果均在50%以上。

2.5"生防菌發(fā)酵液和膏劑對(duì)蘋(píng)果腐爛病的田間防治效果

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)生防菌發(fā)酵液對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的防治效果，我們?cè)谔镩g使用蘋(píng)果活體枝條評(píng)價(jià)了10株生防菌發(fā)酵液對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的保護(hù)效果和治療效果。結(jié)果表明，在保護(hù)作用試驗(yàn)中，所有的生防菌處理都顯著降低了病斑的長(zhǎng)度，其中菌株A18589、APH25和C0526發(fā)酵液的保護(hù)效果均大于60%，在所有的生防菌中保護(hù)效果最好。在治療效果試驗(yàn)中，10株生防細(xì)菌對(duì)病斑的擴(kuò)展均有一定抑制效果，其中A18589和A18587發(fā)酵液的治療效果大于60%。但是，無(wú)論是治療實(shí)驗(yàn)還是保護(hù)實(shí)驗(yàn)，所有的生防菌發(fā)酵液處理后的病斑長(zhǎng)度都顯著大于對(duì)照藥劑處理后的病斑長(zhǎng)度（圖2，表4）。

為了檢測(cè)膏劑是否會(huì)影響生防菌的防治效果，我們將前期離體和田間試驗(yàn)中表現(xiàn)最好的菌株A18589制備成膏劑，并在田間蘋(píng)果活體枝條上評(píng)價(jià)了菌株A18589膏劑的保護(hù)效果和防治效果。結(jié)果表明，在保護(hù)作用試驗(yàn)中，菌株A18589膏劑可以顯著抑制病斑在蘋(píng)果活體枝條上的擴(kuò)展，并且與對(duì)照藥劑相比無(wú)顯著性差異（Plt;0.05），生防菌膏劑的田間保護(hù)效果可達(dá)68.27%。而在治療效果試驗(yàn)中，生防菌A18589膏劑雖然也可以顯著抑制病斑在蘋(píng)果活體枝條上的擴(kuò)展，但是造成的病斑長(zhǎng)度顯著高于對(duì)照藥劑處理后的病斑長(zhǎng)度（Plt;0.05）（表5）。

2.6"生防菌株的抑菌譜

利用平板對(duì)峙法測(cè)定10株細(xì)菌菌株對(duì)6種常見(jiàn)病原菌的抑菌效果，結(jié)果顯示，菌株A18589、A18587、APH24、APH25、Y18和Y30具有廣泛的抑菌譜，對(duì)供試的6種病原菌均具有一定的拮抗效果，但對(duì)不同植物病原菌其拮抗程度不等。其中菌株A18589對(duì)蘋(píng)果黑斑病菌的抑菌效果最好，抑菌率為66.67%（表6，圖3）。

2.7"生防菌株A18589的鑒定

2.7.1"形態(tài)學(xué)鑒定

菌株A18589在LB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24"h后，形成中等大小、乳白色不透明、扁平、邊緣不規(guī)則、皺褶狀凸起的圓形菌落。菌落表面呈粗糙、不透明、無(wú)光澤、干燥的特征，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌落逐漸呈現(xiàn)淺黃色（圖4a）。革蘭氏染色后鏡檢呈藍(lán)紫色，桿狀，表明該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌（圖4b）。

2.7.2"生理生化鑒定

由表7可知，菌株A18589表現(xiàn)出對(duì)明膠的液化能力，不產(chǎn)生H2S，可利用蔗糖、果糖和甘露醇，葡萄糖發(fā)酵、麥芽糖發(fā)酵呈現(xiàn)陽(yáng)性，而半乳糖發(fā)酵呈現(xiàn)陰性。此外，菌株A18589對(duì)丙二酸鹽、七葉苷和甲基紅檢測(cè)呈現(xiàn)陰性，而VP反應(yīng)呈陽(yáng)性，該結(jié)果與貝萊斯芽胞桿菌參考菌株X2的生理生化結(jié)果一致。

2.7.3"分子生物學(xué)鑒定

分別使用16S"rDNA基因序列和多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)菌株A18589進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。16S序列分析表明，菌株A18589與Bacillus屬的菌株劃分在同一分支，表明菌株A18589為Bacillus屬，但是無(wú)法將其鑒定到種水平（圖5）。為

了進(jìn)一步鑒定到種水平，利用glpF、ilvD、ptA、purH、rpoD、tpiA等基因進(jìn)行了多位點(diǎn)序列分析（MLSA）。結(jié)果表明，菌株A18589與B.velezensis的標(biāo)準(zhǔn)菌株DR08聚在同一分支（圖6）。綜合形態(tài)特征、生理生化特性以及16S"rDNA基因序列分析結(jié)果，A18589菌株被鑒定為貝萊斯芽胞桿菌，并已保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為CGMCC1.18865。

3"結(jié)論與討論

蘋(píng)果樹(shù)腐爛病一直依賴(lài)化學(xué)殺菌劑進(jìn)行控制，但其潛在危害促使科研人員尋找生物替代方案。通過(guò)分離和純化發(fā)病蘋(píng)果園土壤中的473株細(xì)菌，成功獲得1株高效的貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis（A18589），對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病表現(xiàn)出顯著防治效果。與化學(xué)藥劑相比，生防菌表現(xiàn)出易降解、無(wú)污染、無(wú)抗藥性、無(wú)殘留等環(huán)保特性，提供了可行性生物防治方案。

菌株A18589在室內(nèi)拮抗試驗(yàn)中對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌Valsa"mali表現(xiàn)出顯著的抑制效果，抑制率為86.85%。其發(fā)酵過(guò)濾液對(duì)V.mali的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有顯著的抑制活性，抑制率分別為91.11%和72.81%，驗(yàn)證了其產(chǎn)生具有抑制作用的活性物質(zhì)。貝萊斯芽胞桿菌作為產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的細(xì)菌，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有生物防治調(diào)節(jié)劑的潛在價(jià)值［21］。其在培養(yǎng)基和蘋(píng)果樹(shù)枝條上對(duì)腐爛病菌的抑制效果顯著，并對(duì)其他多種植物病原真菌也表現(xiàn)出顯著的抑制效果。

貝萊斯芽胞桿菌用于防治蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的報(bào)道較少見(jiàn)。劉欣等［22］從草原土樣中分離得到貝萊斯芽胞桿菌DM529，在蘋(píng)果樹(shù)腐爛病離體枝條上的防治效果在64%以上。鄭雪晴等［18］在田間試驗(yàn)測(cè)定了貝萊斯芽胞桿菌BV2007+ND7對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的防治效果，結(jié)果表明該菌株的防治效果達(dá)到了58.56%。而本研究篩選出的貝萊斯芽胞桿菌菌株A18589在室內(nèi)的離體枝條試驗(yàn)和田間試驗(yàn)中均展現(xiàn)出顯著的防治效果，其中田間防效高達(dá)63.59%。這表明菌株A18589在樹(shù)體中展現(xiàn)良好的防治活性。生防菌株的定殖是生防菌發(fā)揮生防作用的基礎(chǔ)，有研究表明，可通過(guò)制備相應(yīng)劑型提高生防菌在寄主植物上的定殖能力［23］。前期研究表明微生物膏劑防效優(yōu)于發(fā)酵液［2425］。針對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病，本研究將生防菌制備成膏劑通過(guò)涂干法施用于樹(shù)干或刮除傷口以提高在施藥位置的定殖能力，發(fā)現(xiàn)菌株A18589膏劑較發(fā)酵液對(duì)活體枝條腐爛病表現(xiàn)出更好地防治效果，保護(hù)作用方面，膏劑防效達(dá)到68.27%，治療作用方面，膏劑防效達(dá)到55.32%。

鑒于菌株A18589對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌Valsa"mali的較好抑制效果，未來(lái)將深入探究其抑制機(jī)制，全面評(píng)估其促進(jìn)生長(zhǎng)和誘導(dǎo)植物抗性等附加作用，為其產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供理論支持。

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（責(zé)任編輯：田"喆）