摘要

基于反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（reverse"transcription"loopmediated"isothermal"amplification，"RTLAMP）技術(shù)建立了針對(duì)地黃花葉病毒（Rehmannia"mosaic"virus，"ReMV）的快速、特異、靈敏的RTLAMP檢測(cè)方法。根據(jù)ReMV外殼蛋白（coat"protein，CP）基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)了3組LAMP引物，通過引物篩選確定最佳引物組合;利用電泳檢測(cè)及可視化方法（加SYBR"Green"Ⅰ顯色劑）進(jìn)行RTLAMP溫度優(yōu)化、特異性檢測(cè)、靈敏度比較。結(jié)果表明：本研究建立的RTLAMP方法最適檢測(cè)溫度為60℃，優(yōu)化后的LAMP方法能特異性檢測(cè)ReMV，靈敏度是常規(guī)PCR的1"000倍，可檢測(cè)到1.2×10-1拷貝/μL的模板濃度。對(duì)60份地黃樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，RTLAMP方法的陽性檢出率為98.3%，高于常規(guī)RTPCR方法（75%）。本研究建立的RTLAMP檢測(cè)技術(shù)為ReMV的準(zhǔn)確檢測(cè)提供了快速、高效的方法。

關(guān)鍵詞

地黃花葉病毒;"反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RTLAMP）;"快速檢測(cè)

中圖分類號(hào)：

S"435.67

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023627

Establishment"and"application"of"RTLAMP"method"for"rapid"detection"of"Rehmannia"mosaic"virus

QIN"Yanhong#，"LU"Shuhao#，"WEN"Yi，"GAO"Suxia，"LI"Shaojian，"LIU"Yuxia，WANG"fei*，"LU"Chuantao*

（Institute"of"Plant"Protection，"Henan"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Zhengzhou"450002，"China）

Abstract

Based"on"reverse"transcription"loopmediated"isothermal"amplification"（RTLAMP）"technology，"a"rapid，"specific"and"sensitive"RTLAMP"detection"method"for"Rehmannia"mosaic"virus"（ReMV）"was"established."Three"sets"of"LAMP"primers"were"designed"according"to"the"nucleotide"sequence"of"ReMV"coat"protein"（CP），"and"the"optimized"primers"were"determined"by"primer"screening."Temperature"optimization，"specificity"detection"and"sensitivity"comparison"of"RTLAMP"were"carried"out"by"using"electrophoresis"detection"and"visual"（SYBR"Green"I"chromogenic"agent）."The"results"showed"that"the"optimum"detection"temperature"of"RTLAMP"method"was"60℃."ReMV"could"be"specifically"detected"by"the"optimized"LAMP，"and"the"sensitivity"was"1"000"times"higher"than"that"of"conventional"PCR."It"could"be"detected"in"1.2×10-1"copies/μL."The"detection"results"of"60"samples"of"Rehmannia"glutinosa"showed"that"the"positive"detection"rate"of"RTLAMP"was"98.3%，"which"was"higher"than"that"of"conventional"RTPCR"（75%）."The"RTLAMP"detection"technology"established"in"this"study"provides"a"fast"and"efficient"method"for"the"accurate"detection"of"ReMV.

Key"words

Rehmannia"mosaic"virus;"RTLAMP;"fast"detection

地黃Rehmannia"glutinosa為玄參科Scrophulariaceae地黃屬Rehmannia多年生草本植物，屬于我國的“四大懷藥”之一。地黃屬于異花授粉植物，生產(chǎn)中主要以塊根進(jìn)行無性繁殖，易造成病毒病的發(fā)生，導(dǎo)致地黃產(chǎn)量降低和種性退化［1］。目前已報(bào)道侵染地黃的病毒主要有地黃花葉病毒（Rehmannia"mosaic"virus，ReMV）、煙草花葉病毒（tobacco"mosaic"virus，TMV）、蠶豆萎蔫病毒"2號(hào)（broad"been"wilt"virus"2，BBWV2）和油菜花葉病毒（youcai"mosaic"virus，YoMV）等10種［23］。ReMV屬于煙草花葉病毒屬Tobamovirus［4］，目前在中國、日本及韓國等地區(qū)均有報(bào)道［57］。ReMV"粒子形態(tài)為桿狀，在田間由機(jī)械傳播，可侵染4個(gè)科的多種植物，主要包括茄科Solanaceae、"番杏科Aizoaceae、"十字花科Brassicaceae和莧科Amaranthaceae，其典型癥狀主要為明脈、花葉、褪綠、斑駁及壞死斑等［8］。

關(guān)于ReMV檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)道，張振臣等［9］利用血清學(xué)、RTPCR結(jié)合核苷酸序列測(cè)定等方法對(duì)ReMV進(jìn)行了初步鑒定;張西梅［10］利用生物學(xué)檢測(cè)（汁液摩擦接種法）、dsRNA提取、非序列依賴性PCR擴(kuò)增（sequenceindependent"amplification，"SIA）和RTPCR檢測(cè)等手段在表現(xiàn)典型癥狀的地黃病樣中檢測(cè)出了地黃花葉病毒;郭梟等［11］使用RTPCR及酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)（enzymelinked"immunosorbent"assay，ELISA）檢測(cè)了地黃上潛在的地黃花葉病毒;Chen等［12］利用PAbCPReMV建立了ReMV的蛋白質(zhì)免疫印跡（western"blotting，WB）、免疫斑點(diǎn)印跡（immunodot"blotting）和ELISA檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)具有成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但是靈敏度低且特異性不高［13］。RTPCR是實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測(cè)病毒方法，但耗時(shí)長、儀器昂貴和操作復(fù)雜，不適用于大田生產(chǎn)實(shí)際中。2000年，Notomi等［14］建立的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增"（loopmediated"isothermal"amplification，LAMP）"技術(shù)可在恒溫（60～65℃）"條件下利用"DNA"鏈置換聚合酶快速對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增的分子檢測(cè)技術(shù)，目前已被應(yīng)用于多種植物病毒的檢測(cè)［1517］，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速及檢測(cè)結(jié)果可視化，適用于基層及田間病毒檢測(cè)的需求。

本團(tuán)隊(duì)前期利用高通量測(cè)序（highthroughput"sequencing，"HTS）和RTPCR的方法從河南省地黃上檢測(cè)到ReMV的侵染，在地黃上的檢出率高達(dá)93.3%，ReMV已成為河南省地黃上的優(yōu)勢(shì)病毒之一［2］，因此亟須建立一種高速、高效且靈敏度高的檢測(cè)方法。本研究擬通過建立針對(duì)ReMV的快速、特異、靈敏的RTLAMP檢測(cè)技術(shù)，為ReMV田間快速檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1"材料與方法

1.1"材料

從河南省溫縣、武陟、禹州等地采集地黃疑似病毒病葉片樣品60份，癥狀表現(xiàn)為花葉、褪綠和畸形，置于-80℃保存?zhèn)溆?，采樣信息見?。

1.2"方法

1.2.1"引物設(shè)計(jì)

選取ReMV外殼蛋白（coat"protein，CP）基因核苷酸序列保守區(qū)域，利用Primer"Explorer"V5軟件（http：∥primerexplorer.jp/）在線設(shè)計(jì)ReMV的3組RTLAMP檢測(cè)引物，同時(shí)設(shè)計(jì)RTPCR檢測(cè)引物（表2），所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2"RNA提取和cDNA合成

使用柱式植物總RNA提取試劑盒（B518661）［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取地黃所有樣品的總RNA，以總RNA為模板，使用PrimeScriptTMⅡ"1st"Strand"cDNA"Synthesis"Kit"［寶生物工程（大連）有限公司］合成cDNA，將cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3"RTLAMP檢測(cè)體系與引物篩選

以ReMV"cDNA為模板進(jìn)行3組RTLAMP檢測(cè)，反應(yīng)體系為：1×ThermoPol"Buffer"2.5"μL、MgSO4"1.5"μL、dNTPs"3.5"μL、ReMVFIB/BIP"4"μL、ReMVF3/B3"0.5"μL、ReMVLB"1"μL、Bst"DNA"Polymerase"1"μL、cDNA"1"μL、超純水補(bǔ)足25"μL。將溶液輕輕混勻后，加入30"μL石蠟油，在PCR管蓋內(nèi)加入0.5"μL"SYBR"Green"I顯色指示劑。反應(yīng)時(shí)間為60"min，反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心甩下蓋內(nèi)核酸染料，觀察反應(yīng)管內(nèi)的顏色變化，陽性樣品呈現(xiàn)綠色，陰性樣品呈現(xiàn)橙色。取5"μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽性樣品出現(xiàn)瀑布狀條帶，陰性樣品無條帶。根據(jù)電泳結(jié)果及SYBR"Green"Ⅰ染色結(jié)果篩選出最優(yōu)的一組引物。

1.2.4"RTLAMP特異性篩選

前期研究在地黃上檢測(cè)到ReMV、BBWV2、YoMV、金魚花潛隱類病毒（Columnea"latent"viroid，"CLVd）、煙草輕型綠花葉病毒（tobacco"mild"green"mosaic"virus，TMGMV）和瓜類褪綠黃化病毒（cucurbit"chlorotic"yellows"virus，"CCYV）"6種病毒，以本實(shí)驗(yàn)室保存的6種病毒質(zhì)粒為模板，RTLAMP參照1.2.3反應(yīng)體系，常規(guī)PCR總體系（20"μL）：2×Trio"Taq"Mix"10"μL、上、下游引物（10"μmol/L）各0.5"μL、質(zhì)粒DNA"1"μL，超純水補(bǔ)足至20"μL;PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5"min;94℃變性30"s，55℃退火30"s，72℃延伸90"s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10"min，16℃保溫。根據(jù)電泳結(jié)果及SYBR"Green"Ⅰ染色結(jié)果確定LAMP檢測(cè)方法的特異性。

1.2.5"RTLAMP溫度優(yōu)化

以ReMV"cDNA為模板進(jìn)行RTLAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化，將反應(yīng)溫度設(shè)置為50、55、60、65℃和70℃等梯度，RTLAMP體系參照1.2.3，反應(yīng)結(jié)束后，甩下蓋內(nèi)核酸染料，觀察反應(yīng)管顏色變化，取5"μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳結(jié)果及SYBR"Green"Ⅰ染色結(jié)果篩選出最佳反應(yīng)溫度。

1.2.6"RTLAMP與RTPCR靈敏度比較

以本實(shí)驗(yàn)室保存的ReMV質(zhì)粒為模板，將質(zhì)粒濃度換算成拷貝數(shù)后稀釋至103～10-3拷貝/μL，以梯度稀釋的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR和LAMP方法的靈敏度檢測(cè)。常規(guī)PCR反應(yīng)后通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，同時(shí)與RTLAMP可視化結(jié)果對(duì)比，比較2種檢測(cè)方法的靈敏度。

1.2.7"RTLAMP技術(shù)對(duì)地黃樣品的檢測(cè)驗(yàn)證

利用本研究建立的RTLAMP和RTPCR的方法對(duì)采集的60份地黃疑似病毒病樣品葉片進(jìn)行檢測(cè)，比較RTLAMP和RTPCR"2種檢測(cè)方法結(jié)果的一致性。

2"結(jié)果與分析

2.1"RTLAMP引物篩選

以ReMVnbsp;cDNA為模板分別對(duì)3組引物進(jìn)行RTLAMP檢測(cè)（圖1），篩選最優(yōu)引物組合。結(jié)果表明第1組引物檢測(cè)不到ReMV，第2組和第3組引物能特異性檢測(cè)到ReMV，因此同時(shí)選擇第2組和第3組引物進(jìn)行下一步LAMP特異性檢測(cè)。

2.2"RTLAMP特異性篩選

以ReMV、CLVd、TMGMV、YoMV、BBWV2和CCYV的質(zhì)粒為模板，首先利用常規(guī)PCR驗(yàn)證了質(zhì)粒的正確性（圖2），然后利用第2組和第3組引物同時(shí)進(jìn)行LAMP的特異性檢測(cè)，當(dāng)利用第2組引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，ReMV和YoMV模板都表現(xiàn)出瀑布狀條帶且LAMP反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色（圖3），表明此組引物的特異性較差;當(dāng)利用第3組引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，只有以ReMV為模板時(shí)才能擴(kuò)增出瀑布狀條帶且LAMP反應(yīng)液顯綠色，而其他模板均未見有擴(kuò)增條帶（圖3），說明第3組引物所建立的RTLAMP檢測(cè)體系特異性好，后續(xù)選擇第3組引物作為RTLAMP擴(kuò)增引物。

2.3"RTLAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化

利用建立的RTLAMP檢測(cè)體系擴(kuò)增ReMV，設(shè)置50、55、60、65℃和70℃等溫度梯度進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化，結(jié)果表明：當(dāng)擴(kuò)增溫度為60℃和65℃時(shí)，RTLAMP反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色且1.5%瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)瀑布狀條帶，其中60℃條帶最亮，因此本試驗(yàn)建立的RTLAMP最適反應(yīng)溫度為60℃（圖4）。

在瀑布狀條帶中切下100"bp左右的條帶進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLASTn比對(duì)分析，結(jié)果表明RTLAMP擴(kuò)增產(chǎn)物與ReMV（GenBank："WEX25028.1）的CP同源性為100%。表明建立的RTLAMP檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確檢出ReMV。

2.4"RTLAMP與RTPCR靈敏度比較

ReMV質(zhì)粒初始濃度為151.4"ng/μL，通過拷貝數(shù)換算為1.2×1011拷貝，對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，換算濃度為1.2×103～1.2×10-3拷貝/μL，以梯度稀釋的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR和LAMP方法的靈敏度檢測(cè)（圖5）。結(jié)果顯示常規(guī)PCR可以檢測(cè)到1.2×102拷貝/μL，LAMP可以檢測(cè)到1.2×10-1拷貝/μL，表明LAMP的靈敏度比常規(guī)PCR的靈敏度高1"000倍。

2.5"RTLAMP檢測(cè)方法在地黃上的應(yīng)用

分別利用常規(guī)RTPCR及本研究建立的RTLAMP對(duì)60份地黃樣品進(jìn)行檢測(cè)（圖6），結(jié)果表明：RTPCR檢測(cè)出45份樣品為陽性，陽性率為75%;而RTLAMP檢測(cè)出59份樣品為陽性，陽性率為98.3%，RTLAMP的檢測(cè)結(jié)果陽性率高于RTPCR。

3"結(jié)論與討論

ReMV是河南省地黃上的優(yōu)勢(shì)病毒之一，在田間發(fā)生比較嚴(yán)重，本研究根據(jù)ReMV"CP保守區(qū)域設(shè)計(jì)了3組RTLAMP檢測(cè)引物，通過引物篩選和特異性檢測(cè)選出了最優(yōu)的引物組合，對(duì)RTLAMP的反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，比較了RTLAMP與RTPCR方法的靈敏度，建立了針對(duì)ReMV快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的RTLAMP檢測(cè)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)地黃田間樣品的準(zhǔn)確檢測(cè)。

與常規(guī)RTPCR檢測(cè)方法相比，LAMP檢測(cè)具有高特異性和高靈敏度，LAMP能從微量的拷貝中擴(kuò)增出目的基因，比常規(guī)PCR至少高出一個(gè)數(shù)量級(jí)［18］。袁英哲等［19］發(fā)現(xiàn)黃瓜花葉病毒的LAMP"檢測(cè)方法的靈敏度相較于常規(guī)PCR高10倍;Salit等［20］驗(yàn)證了煙草花葉病毒的LAMP靈敏度比常規(guī)PCR高1"000倍。本研究結(jié)果顯示常規(guī)PCR可以檢測(cè)到1.2×102拷貝/μL，而LAMP可以檢測(cè)到1.2×10-1拷貝/μL，RTLAMP靈敏度相比RTPCR高1"000倍。對(duì)60份地黃樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，本研究建立的RTLAMP檢測(cè)結(jié)果陽性率高于RTPCR，推測(cè)由于RTLAMP的檢測(cè)靈敏度高，對(duì)含量較低的樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，RTLAMP能檢測(cè)出來，而常規(guī)PCR檢測(cè)為陰性。該結(jié)果與其他報(bào)道類似，趙雪君等［21］發(fā)現(xiàn)蔬菜樣品中CMV的RTLAMP的檢出率（71.42%）高于"RTPCR（64.28%）。另外，由于LAMP的4條引物主要是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，而RTPCR方法只針對(duì)靶序列上2個(gè)特異性區(qū)域，因此RTLAMP具有更高的特異性［22］。

由于LAMP檢測(cè)技術(shù)的靈敏度較高，在試驗(yàn)過程中易出現(xiàn)氣溶膠引起的假陽性問題，為了避免該問題的出現(xiàn)，本研究在RTLAMP反應(yīng)體系中加入石蠟油進(jìn)行封存，并在反應(yīng)前將SYBR"Green"I染料加入到反應(yīng)管蓋中，反應(yīng)結(jié)束后短暫離心甩下蓋內(nèi)的核酸染料，通過觀察反應(yīng)管內(nèi)的顏色變化即可快速判定結(jié)果，避免開蓋造成的氣溶膠污染。

由于LAMP擴(kuò)增效率與LAMP反應(yīng)條件密切相關(guān)［23］，本研究對(duì)LAMP檢測(cè)溫度進(jìn)行優(yōu)化，最適溫度為60℃，在60～65℃時(shí)均能實(shí)現(xiàn)對(duì)ReMV的準(zhǔn)確檢測(cè)，對(duì)儀器設(shè)備的要求低，操作簡(jiǎn)單，可肉眼直接判定檢測(cè)結(jié)果，本方法適用于基層科研單位或試驗(yàn)條件相對(duì)落后的地區(qū)使用，可用于生產(chǎn)上對(duì)ReMV的早期檢測(cè)、病毒測(cè)報(bào)、脫毒苗的檢測(cè)等。

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（責(zé)任編輯：田"喆）