摘要

2023年6月發(fā)現(xiàn)，在江西省南昌市江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園種植的鳶尾普遍發(fā)生鏈格孢葉斑病。為明確該病害病原菌種類，對發(fā)病葉片進(jìn)行真菌分離，對分離菌株進(jìn)行致病性測定，共獲得24株鏈格孢，在人工接種試驗(yàn)中均具有致病性;選擇3株代表性菌株JXYW1、JXYW2、JXYW3進(jìn)行培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征觀察及多基因（rDNAITS、EF1、GAPDH、Alt"α"1）序列分析，這3株菌株培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征相同，符合文獻(xiàn)中對鳶尾生鏈格孢Alternaria"iridicola的描述，3株菌株間rDNAITS、EF1、GAPDH、Alt"α"1基因序列也完全相同，與GenBank中鳶尾生鏈格孢對應(yīng)基因序列的相似性為100%，在多基因系統(tǒng)發(fā)育樹上與鳶尾生鏈格孢菌株YZU聚于同一個分支。據(jù)此，將江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園內(nèi)鳶尾鏈格孢葉斑病病原菌鑒定為鳶尾生鏈格孢。

關(guān)鍵詞

鳶尾鏈格孢葉斑病;"病原鑒定;"致病性測定;"鳶尾生鏈格孢

中圖分類號：

S"436.8

文獻(xiàn)標(biāo)識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023661

Identification"of"the"pathogen"of"Alternaria"leaf"spot"on"iris

DU"Lei1，"YUAN"Xinen1，"CHENG"Shuyuan1，"LING"Changyou2，"LIU"Bing1，"LI"Genghua1，JIANG"Junxi1*，"XIONG"Guihong1*

（1."College"of"Agronomy，"Jiangxi"Agricultural"University，"Nanchang"330045，"China;"

2."Jiangxi"Biotechnology"Vocational"College，"Nanchang"330200，"China）

Abstract

In"June"2023，"Alternaria"leaf"spot"occurred"commonly"on"iris"planted"in"botanical"garden"of"Jiangxi"Agricultural"University"located"in"Nanchang"city，"Jiangxi"province."In"order"to"clarify"the"pathogenic"fungus"causing"the"disease，"fungal"isolation"of"thenbsp;diseased"leaves"was"conducted"and"pathogenicity"of"the"isolated"strains"was"tested."A"total"of"24"strains"of"Alternaria"were"obtained，"all"of"which"were"pathogenic"in"artificial"inoculation"experiments."Three"representative"strains，"JXYW1，"JXYW2"and"JXYW3，"were"selected"for"observation"of"cultural"and"morphological"characteristics，"as"well"as"multi"gene"（rDNAITS，"EF1，"GAPDH，"and"Alt"α"1）"sequence"analysis."These"three"strains"have"the"same"cultural"and"morphological"characteristics，"which"are"consistent"with"the"description"of"Alternaria"iridicola"in"the"literature."Sequences"of"rDNAITS，"EF1，"GAPDH"and"Alt"α"1"gene"between"the"three"strains"are"completely"identical"and"share"100%"similarity"with"the"corresponding"gene"sequence"of"A.iridicola"in"GenBank."They"are"grouped"together"in"the"same"branch"with"strain"YZU"of"A.iridicola"in"multigene"phylogenetic"tree."Based"on"the"results，"the"pathogen"causing"Alternaria"leaf"spot"on"iris"in"the"botanical"garden"of"Jiangxi"Agricultural"University"was"identified"as"A.iridicola.

Key"words

Alternaria"leaf"spot"of"iris;"pathogen"identification;"pathogenicity"test;"Alternaria"iridicola

鳶尾Iris"tectorum屬于鳶尾科Iridaceae鳶尾屬Iris多年生草本花卉植物，在北半球的溫帶地區(qū)廣泛分布。在我國主要分布于陜西、甘肅、山西、安徽、江蘇、江西、廣西、貴州、云南等省份［1］。鳶尾花色靚麗，色彩雅致，作為城市良好的地被植物，具有較高的園藝觀賞價值［2］，此外，鳶尾中的化學(xué)成分既有抗癌、抗腫瘤活性，又可選擇性地調(diào)節(jié)雌激素受體，預(yù)防女性骨質(zhì)疏松［3］。鳶尾較易栽培，抗寒且抗旱，在水生、濕生、旱生等環(huán)境中均易種植［4］，開發(fā)價值很大。近年來，隨著鳶尾種植面積不斷擴(kuò)大，加上氣候環(huán)境的影響，鳶尾病害發(fā)生也越來越嚴(yán)重。2023年6月，在江西省南昌市江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園種植的鳶尾普遍發(fā)生葉斑病，對鳶尾的生長及美觀造成嚴(yán)重影響，經(jīng)保濕鏡檢初步確定該病害的病原菌為鏈格孢屬Alternaria真菌。

前人研究表明，鳶尾鏈格孢葉斑病可由多種真菌引起。早在20世紀(jì)，美國、日本、韓國報道了鳶尾生鏈格孢Alternaria"iridicola引起鳶尾葉斑?。?7］，近年來，我國學(xué)者也陸續(xù)開展了鳶尾鏈格孢葉斑病病原鑒定研究。2015年翟鳳艷等［8］報道了河南新鄉(xiāng)發(fā)生鳶尾生鏈格孢A.iridicola引起的鳶尾葉斑病。2016年Luo等［9］首次報道了江蘇南京發(fā)生澳大利亞鳶尾鏈格孢A.iridiaustralis引起的鳶尾葉斑病。2020年Li等［10］首次報道了安徽安慶發(fā)生細(xì)極鏈格孢A.tenuissima引起的鳶尾葉斑病，其發(fā)病率高于30%。2022年Gou等［11］發(fā)現(xiàn)山毛櫸鏈格孢A.setosae和鳶尾花鏈格孢A.tectorum等2個新種也可引起鳶尾葉斑病。本研究將對江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園發(fā)生的鳶尾鏈格孢葉斑病進(jìn)行病原菌分離鑒定，以明確其病原菌種類，為該病害的研究和防控提供理論基礎(chǔ)和參考。

1"材料與方法

1.1"樣品采集及病原菌分離

2023年6月在江西省南昌市江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園內(nèi)隨機(jī)采集26份鳶尾鏈格孢葉斑病病葉，每份病葉單獨(dú)裝入自封塑料袋中，樣品采回后立即采用常規(guī)組織分離法對病葉進(jìn)行真菌分離。取病葉的病健交界處，將其剪成邊長3"mm×3"mm的小塊。先用75%的乙醇對其進(jìn)行浸泡消毒10"s，再轉(zhuǎn)移至0.1%升汞溶液中消毒20"s，之后用無菌水漂洗3次，最后，將漂洗后的小塊組織用無菌吸水紙吸干，移入PDA平板。將平板在培養(yǎng)箱中28℃恒溫黑暗倒置培養(yǎng)，待菌落長出后，將菌落邊緣菌絲體轉(zhuǎn)移到新的PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接，獲得純培養(yǎng)菌株［12］。

1.2"菌株致病性測定

對分離獲得的菌株進(jìn)行致病性測定。將各菌株接種PDA平板，于28℃黑暗培養(yǎng)14"d至大量產(chǎn)孢，用無菌水洗脫菌落上的分生孢子，經(jīng)滅菌紗布過濾得到孢子懸浮液，再用無菌水調(diào)節(jié)孢子濃度至106個/mL。取生長旺盛的健康盆栽鳶尾，先用75%乙醇對葉片進(jìn)行表面消毒，再用無菌針頭對待接種葉片進(jìn)行刺傷，每葉刺傷兩處，一處接種10"μL孢子懸浮液，另一處接種10"μL無菌水作為對照，每菌株接種6片葉片，試驗(yàn)重復(fù)3次。將接種后的盆栽鳶尾置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中光暗交替（L∥D=12"h∥12"h）保濕培養(yǎng)，逐日觀察發(fā)病情況，發(fā)病后對接種病斑進(jìn)行病菌再分離，以完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.3"病菌培養(yǎng)性狀與形態(tài)學(xué)觀察

挑取代表性菌株進(jìn)行培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)觀察。將供試菌株接種于PDA平板中央，28℃恒溫黑暗培養(yǎng)14"d（L∥D=0"h∥24"h），逐日觀察菌絲生長及產(chǎn)孢情況，采用十字交叉法［13］測量菌落直徑，計算菌落平均生長速率。在產(chǎn)孢旺盛期，觀察分生孢子梗和分生孢子形態(tài)，同時，對保濕后病組織上的分生孢子也進(jìn)行鏡檢觀察。從PDA上與病組織上分別隨機(jī)選取50個分生孢子測量其大小。按文獻(xiàn)［14］中的方法，將PDA平板上生長的外緣菌絲刮下，涂抹至中間開有1"cm×1"cm的方孔且被無菌水濕潤的無菌濾紙片上（濾紙片緊貼無菌載玻片），28℃恒溫保濕培養(yǎng)2～3"d，在光學(xué)顯微鏡下觀察方孔內(nèi)的分生孢子鏈形態(tài)。

1.4"病菌分子鑒定

1.4.1"病菌基因組DNA提取

取上述代表性菌株的適量菌絲于2"mL離心管中，加入無菌鋼珠后，先經(jīng)液氮冷凍，后使用打樣機(jī)將其研磨成粉末。采用Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒提取其基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。

1.4.2"病菌rDNAITS、EF1、GAPDH和Alt"α"1基因序列分析

以提取病菌的DNA為模板，用引物對ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）/ITS4"（5′TCCTC

CGCTTATTGATATGC3′）、"EF1728F"（5′CATCGA

GAAGTTCGAGAAGG3′）/EF1986R（5′TACTTGAAGGAACCCTTACC3′）、GBD1（5′CAACGGCTTCGGTCGCATTG3′）/GBD2（5′GCCAAGCAGTTGGTTGTGC3′）和AltF（5′ATGCAGTTCACCACCATCGC3′）/AltR（5′ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC3′）［1518］分別對rDNAITS、EF1、GAPDH和Alt"α"1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)總體系25"μL，包含"ddH2O"8.5"μL、2×Taq"PCR"Master"Mix"12.5"μL、正反向引物各（10"μmol/L）"1"μL"和模板DNA"2"μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4"min;94℃變性30"s，60℃退火30"s，72℃延伸"1"min，35個循環(huán);72℃延伸10"min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.4.3"序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測得的原始序列用DNA"Star（Madison"Wisconsin，USA）軟件進(jìn)行拼接，準(zhǔn)確序列提交至GenBank獲取基因登錄號，在NCBI中使用BLAST進(jìn)行序列相似性搜索，利用MEGA"7.0軟件中的鄰接法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2"結(jié)果與分析

2.1"病害危害及癥狀

2023年6月，在江西省南昌市江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園多處種植的鳶尾普遍發(fā)生鏈鉻孢葉斑病，病株率高達(dá)100%，病葉率達(dá)65%，并出現(xiàn)大量葉片枯死現(xiàn)象（圖1a），對鳶尾的生長造成嚴(yán)重影響。發(fā)病初期葉尖和葉緣產(chǎn)生黃褐色小點(diǎn)，逐步擴(kuò)展為圓形至長橢圓形、中央灰褐色、邊緣深褐色、并伴有黃色暈圈的壞死病斑（圖1b），在潮濕環(huán)境下，病部出現(xiàn)深褐色霉層（圖1c），發(fā)病嚴(yán)重時，病斑連成一片，整個葉片枯死。

2.2"病原菌分離及致病性測定

從采集的病葉樣品中共分離到24株菌落形態(tài)特征一致的鏈格孢。用孢子懸浮液接種刺傷的鳶尾健康葉片，接種后2"d開始發(fā)病，病斑圓形或橢圓形，水漬狀，黃褐色，伴有輕微淺黃色暈圈（圖1d），發(fā)病率100%;7"d后黃褐色病斑明顯擴(kuò)大，黃色暈圈明顯，與自然發(fā)病癥狀相同（圖1e）。12"d后，病斑進(jìn)一步擴(kuò)大，中央枯死，對照組未發(fā)病（圖1f）。對發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌再分離，獲得的菌株在培養(yǎng)特性、形態(tài)特征和基因序列等方面與原接種菌株完全一致。

2.3"病原菌形態(tài)學(xué)觀察

PDA上菌落圓形，絨狀，正面灰綠色并伴有白色菌絲團(tuán);菌落背面深綠色，邊緣白色（圖2a）。菌落平均生長速率為5.3"mm/d。菌落培養(yǎng)10"d后開始產(chǎn)孢，分生孢子倒棒狀，淺褐色或黃綠色，具縱橫隔膜5～9個，分隔處有明顯的縊縮，孢身長29.6～76.1"μm，寬15.7～19.8"μm，喙長20.1～68.5"μm（圖2b）。分生孢子梗多叢生，直立或彎曲，淺褐色，具隔膜，大小（30.3～267.0）μm×（3.5～6.2）μm（圖2c）。病葉上產(chǎn)生的分生孢子與PDA上產(chǎn)生的分生孢子相比，形態(tài)特征相似，但更大，其孢身長32.3～81.4"μm，寬17.3～35.7"μm（圖2d），尤其是喙很長，最長可達(dá)到408.5"μm，且喙部常呈節(jié)狀膨大并發(fā)生厚垣化。分生孢子單生或以短鏈著生在分生孢子梗上，一般有2～5個孢子（圖2e），鏈無分枝。查閱《鏈格孢屬真菌現(xiàn)代分類方法研究》［19］、《中國真菌志—鏈格孢屬》［20］等文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)此菌的形態(tài)特征與鳶尾生鏈格孢Alternaria"iridicola形態(tài)特征一致，初步鑒定為鳶尾生鏈格孢。

2.4"分子生物學(xué)鑒定

以3株供試菌株JXYW1、JXYW2、JXYW3的基因組為模板，分別對其rDNAITS、EF1、GAPDH、Alt"α"1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序表明，3個菌株具有完全相同的rDNAITS、EF1、GAPDH、Alt"α"1基因序列，序列長度分別為531、249、557、472"bp，GenBank登錄號見表1。經(jīng)BLAST比對，此4個基因序列與GenBank中鳶尾生鏈格孢對應(yīng)序列均具有100%的相似性。以rDNAITS、EF1、GAPDH、Alt"α"1順序拼接成串聯(lián)序列，與從GenBank中下載拼接的相關(guān)鏈格孢對應(yīng)串聯(lián)序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3株供試菌株JXYW1、JXYW2、JXYW3與A.iridicola菌株聚在一個分支，而其他種類的鏈格孢菌株各構(gòu)成獨(dú)立分支（圖2）。根據(jù)序列相似性大小和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，將JXYW1、JXYW2、JXYW3鑒定為鳶尾生鏈格孢A.iridicola。

3"結(jié)論與討論

本文基于病害癥狀、病菌的培養(yǎng)和形態(tài)特征、孢子鏈長短、多基因序列分析和致病性測定結(jié)果，將發(fā)生于南昌市江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園內(nèi)的鳶尾鏈格孢葉斑病病原菌鑒定為鳶尾生鏈格孢A.iridicola。此病原的明確為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物園內(nèi)鳶尾鏈格孢葉斑病防治和進(jìn)一步研究提供了依據(jù)和參考。下一步我們將對該病菌的生物學(xué)特性、病害發(fā)生規(guī)律及防治方法開展進(jìn)一步研究，以便迅速有效地控制該病害的發(fā)生。

國內(nèi)外學(xué)者報道了對多地鳶尾鏈格孢葉斑病病原的鑒定結(jié)果，其中美國愛達(dá)荷州、蒙大拿州、俄勒岡州、威斯康星州等地、日本和韓國的病原為A.iridicola［67，2124］，澳大利亞和新西蘭的病原為A.iridiaustralis［2526］，我國陜西西安、河南新鄉(xiāng)、甘肅天水的病原為A.iridicola，山東青島、安徽安慶的病原為A.tenuissima，江蘇南京的病原為A.iridiaustralis，山西陽泉的病原為A.alternata，福建福州的病原有A.setosae和A.tectorum，湖北荊州和江西廬山的病原既有A.iridicola也有A.alternata［511］。結(jié)合本研究結(jié)果，表明國內(nèi)外鳶尾鏈格孢葉斑病的病原有多種真菌，但主要病原為A.iridicola。

前人報道A.iridicola在人工培養(yǎng)條件下與在自然條件下產(chǎn)生的分生孢子其喙部形態(tài)差異很大，主要表現(xiàn)為在自然條件下，其分生孢子喙部顯著延長并發(fā)生厚垣化［18］，這在本研究中也觀察到類似的結(jié)果。在多次對鳶尾鏈格孢葉斑病病部自然產(chǎn)生的分生孢子鏡檢中，發(fā)現(xiàn)其喙部延伸和厚垣化非常普遍，有的喙部長度超過400"μm，其厚垣化通常表現(xiàn)為喙部顏色加深并呈節(jié)狀膨大，猶如孢子鏈著生態(tài)，這在孢子形態(tài)鑒定時值得注意。A.iridicola的這種形態(tài)變化在鏈格孢屬種類中具有特異性，這為我們開展A.iridicola鑒定提供了有價值的參考。

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