摘要

麥田惡性雜草節(jié)節(jié)麥Aegilops"tauschii"Coss.和圓柱山羊草Aegilops"cylindrica"Host.均為我國(guó)檢疫性有害生物，二者形態(tài)極其相似，導(dǎo)致生產(chǎn)中難以采取針對(duì)性的防控措施。為快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行區(qū)分鑒定，本研究利用DNA條形碼技術(shù)，對(duì)采自河北、河南、山東等9省的52份樣品進(jìn)行了鑒定。針對(duì)4個(gè)DNA條形碼序列區(qū)段rbcL、matK、trnHpsbA和ITS2，測(cè)序并計(jì)算種內(nèi)、種間的雙參數(shù)遺傳距離，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，matK擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果不理想;rbcL序列無(wú)差異;ITS2序列種內(nèi)遺傳距離0.000"7，種間遺傳距離0.009"6;trnHpsbA序列存在15個(gè)差異位點(diǎn)，種內(nèi)遺傳距離0，種間平均遺傳距離0.005"1，NJ樹(shù)支持率為96.0%，能明顯區(qū)分二者。特異性檢測(cè)中，節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草均存在特異性堿基，進(jìn)一步證明trnHpsbA為最優(yōu)鑒定序列。本研究為快速、準(zhǔn)確鑒定這2種檢疫性雜草提供了新的分子檢測(cè)技術(shù)。

關(guān)鍵詞

節(jié)節(jié)麥;"圓柱山羊草;"DNA條形碼;"trnHpsbA

中圖分類號(hào)：

S"451.221

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023663

DNA"barcoding"identification"of"Aegilops"tauschii"and"Ae.cylindrica"in"wheat"fields

JIANG"Cuilan1，2，"HUANG"Hongjuan1，"LI"Longlong1，"WU"Kaidie1，"HUANG"Zhaofeng1，CUI"Hailan1*，"WEI"Shouhui1*

（1."Institute"of"Plant"Protection，"Chinese"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Beijing"100193，"China;"

2."Beijing"Wanhe"Technology"Co.，"Ltd.，"Beijing"102204，"China）

Abstract

Aegilops"tauschii"Coss."and"Ae.cylindrica"Host.，"both"malignant"weeds"in"wheat"fields，"are"considered"quarantine"pests"in"China."The"morphological"similarity"between"Ae.cylindrica"and"Ae.tauschii"complicates"targeted"weed"management"in"agricultural"production."To"address"this，"this"study"utilized"DNA"barcoding"technology"to"differentiate"and"identify"these"weeds."A"total"of"52"samples"from"9"provinces，"including"Hebei，"Henan，"and"Shandong，"were"analyzed."Four"DNA"barcode"sequences"（rbcL，"matK，nbsp;trnHpsbA，"and"ITS2）"were"sequenced."Intraspecific"and"interspecific"genetic"distances"were"calculated，"and"a"phylogenetic"tree"was"constructed"using"the"neighborjoining"method."The"results"showed"that"among"the"four"DNA"barcodes，"matK"sequencing"was"unsatisfactory."The"rbcL"sequences"of"the"two"species"were"identical."The"intraspecific"genetic"distance"of"ITS2"was"0.000"7，"while"its"interspecific"genetic"distance"was"0.009"6."The"trnHpsbA"sequence"accurately"identified"Ae.tauschii"and"Ae.cylindrica，"showing"15"different"interspecific"loci"with"a"genetic"distance"of"0.005"1，"and"no"intraspecific"differences."The"neighborjoining"tree"had"a"frequency"of"96.0%."In"specificity"testing，"both"Ae.tauschii"and"Ae.cylindrica"exhibited"specific"bases，"confirming"trnHpsbA"as"the"optimal"identification"sequence."This"study"provides"a"novel"molecular"approach"for"the"rapid"and"accurate"identification"of"these"two"quarantine"weeds.

Key"words

Aegilops"tauschii;"Aegilops"cylindrica;"DNA"barcode;"trnHpsbA

節(jié)節(jié)麥Aegilops"tauschii"Coss.與圓柱山羊草Ae.cylindrica"Host.混生于麥田，嚴(yán)重影響小麥的生長(zhǎng)［1］。我國(guó)已將節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草列入進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄［2］。我國(guó)檢驗(yàn)檢疫部門(mén)在進(jìn)口糧谷檢疫中經(jīng)常截獲節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草［34］，近年來(lái)，節(jié)節(jié)麥在河北、山東、山西、河南等省的危害面積迅速擴(kuò)大［5］，嚴(yán)重影響我國(guó)小麥生產(chǎn)和貿(mào)易，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［67］。節(jié)節(jié)麥已成為俄羅斯、美國(guó)、澳大利亞、中亞和歐洲等國(guó)的惡性雜草，且危害面積仍在不斷擴(kuò)大［8］。圓柱山羊草又名具節(jié)山羊草，起源于地中海、中東，后被引入美國(guó)大平原及太平洋西北部地區(qū)，成為該地區(qū)冬小麥田的突出問(wèn)題［910］。危害美國(guó)冬小麥面積超過(guò)300萬(wàn)hm2，造成的平均產(chǎn)量損失達(dá)25%［11］。

國(guó)內(nèi)圓柱山羊草的分布及危害未見(jiàn)報(bào)道。2016年，我們發(fā)現(xiàn)其在我國(guó)山東省章丘市、北京市房山區(qū)、天津市寶坻區(qū)和武清區(qū)以及河北省保定市等多個(gè)縣區(qū)有零星分布，有單一種群危害，也有與節(jié)節(jié)麥混合危害。圓柱山羊草對(duì)主控除草劑甲基二磺隆的耐藥性較節(jié)節(jié)麥強(qiáng)［12］，因此常規(guī)用藥情況下常常難以有效防控，這就需要對(duì)圓柱山羊草進(jìn)行早期識(shí)別和精準(zhǔn)防控，以避免其大面積擴(kuò)散蔓延。節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草的主要區(qū)別在于穎的形態(tài)。節(jié)節(jié)麥的穎頂端截平，而圓柱山羊草穎的頂端具2齒，外側(cè)延伸成長(zhǎng)5～20"mm的芒（圖1）。二者與小麥親緣關(guān)系近［13］，外部形態(tài)和生長(zhǎng)習(xí)性非常相似，尤其是生長(zhǎng)前期難以識(shí)別（圖2）。目前，尚未發(fā)現(xiàn)有效且準(zhǔn)確鑒別節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草的方法報(bào)道。

物種鑒定是進(jìn)行生物安全監(jiān)管的關(guān)鍵手段和重要前提，可以幫助確定物種的身份［14］。目前SSR、ISSR、RFLP等分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定。DNA條形碼技術(shù)是一種新的物種鑒定技術(shù)，但目前國(guó)際上還沒(méi)有找到一個(gè)通用序列能鑒定所有植物物種［15］。為探索適合于節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草的DNA條形碼序列，擬使用成熟酶K編碼基因（matK）、核酮糖1，5二磷酸化/加氧酶大亞基編碼基因（rbcL）、核基因（ITS2）和葉綠體基因間隔區(qū)序列（trnHpsbA），對(duì)采自我國(guó)河北、河南、山東、陜西和北京等9個(gè)省市的52份節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草樣品進(jìn)行分析及鑒定，以期獲得最優(yōu)鑒定序列，達(dá)到僅使用1對(duì)引物即可區(qū)分節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草樣品的快速、準(zhǔn)確鑒定，為生產(chǎn)中節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草的鑒別和精準(zhǔn)防控提供科學(xué)依據(jù)。

1"材料與方法

1.1"試驗(yàn)材料

種子樣本材料采自河北、河南、山東、陜西和北京等9個(gè)省、自治區(qū)或直轄市，共52份（表1）。樣本均是采集自然成熟的小穗，保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所雜草種子庫(kù)中。經(jīng)詳細(xì)的植株形態(tài)和種子特征比對(duì)，確定節(jié)節(jié)麥41份、圓柱山羊草11份。

為明確節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草的DNA條形碼與其他相近物種的差異，進(jìn)一步檢測(cè)了最優(yōu)鑒定序列的特異性。采集小麥及17種禾本科雜草作為特異性驗(yàn)證材料，均為自然成熟的種子，保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所雜草種子庫(kù)中（表2）。

1.2"儀器

TissueLyserⅡ樣品破碎儀，北京天根生化科技有限公司;Nanodrop"One超微量分光光度計(jì)，基因有限公司;T100TM"PCR擴(kuò)增儀，BioRad公司;ML204電子天平，MettleToledo公司;Eppendorf"Centrifuge"5430R離心機(jī)，Eppendorf公司;JY600C電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;Tanon3500凝膠圖像分析系統(tǒng)，北京原平皓生物技術(shù)有限公司。

新型植物基因組DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司;瓊脂糖，北京艾普利幫科技有限公司;Gel"Red核酸染色劑，Biotium公司;2×TSINGKE"Master"Mix、DL"2000"Marker，北京擎科生物技術(shù)有限公司。

1.3"DNA提取及檢測(cè)

試驗(yàn)材料在溫室中培養(yǎng)至2～3葉期取樣，稱取頂端幼嫩葉片30"mg，放入2"mL離心管中，同時(shí)加入2枚直徑3"mm鋯珠，裝入適配器中，液氮冷凍2"min，使用組織破碎儀30"Hz破碎40"s，樣品破碎至粉狀，采用新型植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，將原液稀釋至工作濃度30"ng/μL。

1.4"PCR擴(kuò)增及測(cè)序

參考rbcL、matK、trnHpsbA基因和ITS2序列的國(guó)際DNA條形碼通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序及分析［16］。PCR反應(yīng)采用30"μL體系，其中基因組DNA"1"μL，2×TSINGKE"Master"Mix"15"μL，上、下游引物各1"μL（引物信息見(jiàn)表3）［17］，ddH2O"12"μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5"min;94℃變性30"s，退火溫度（表3）退火30"s，72℃延伸相應(yīng)時(shí)間，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10"min;4℃保存。

使用1%瓊脂糖凝膠電泳分離、檢測(cè)PCR產(chǎn)物，條帶清晰、單一的PCR產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。為保證序列的可靠性，所有片段都進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5"數(shù)據(jù)處理及分析

利用Vector"NTI軟件觀察序列峰圖質(zhì)量，檢查、校對(duì)堿基，對(duì)序列進(jìn)行剪切拼接。通過(guò)MEGA"6.0軟件，計(jì)算樣本種內(nèi)和種間的Kimura"2parameter"（K2P），采用鄰接法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，基于K2P距離模型及自舉檢驗(yàn)法（bootstrap"method）檢驗(yàn)各分支的置信值，測(cè)定1"000次循環(huán)。

2"結(jié)果與分析

2.1"序列信息及差異分析

52個(gè)樣品經(jīng)4種條形碼序列區(qū)段雙向測(cè)序發(fā)現(xiàn)，節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草的rbcL序列一致，片段長(zhǎng)度為542"bp，無(wú)核苷酸差異;matK片段長(zhǎng)度827～898"bp，比對(duì)后長(zhǎng)度920"bp，PCR測(cè)序結(jié)果不理想，反向引物測(cè)序結(jié)果為Poly結(jié)構(gòu)，同一PCR結(jié)果雙向測(cè)序結(jié)果有差異;ITS2片段長(zhǎng)度788"bp，存在8個(gè)核苷酸差異位點(diǎn)，種內(nèi)平均遺傳距離0.000"7，種間平均遺傳距離0.009"6;trnHpsbA序列片段比對(duì)后長(zhǎng)度600"bp，存在6個(gè)信息位點(diǎn)，有15個(gè)核苷酸差異，種內(nèi)遺傳距離0，種間平均遺傳距離0.005"1。由此可見(jiàn)，rbcL和matK區(qū)段不適用于鑒定節(jié)節(jié)麥與圓柱山羊草。ITS2因存在種內(nèi)差異，在鑒定過(guò)程中較為復(fù)雜，故不是最佳選擇。trnHpsbA區(qū)段種內(nèi)無(wú)差異，種間有差異，可能為節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草的最優(yōu)鑒定序列。

2.2"節(jié)節(jié)麥與圓柱山羊草的trnHpsbA鑒定

節(jié)節(jié)麥片段長(zhǎng)度597"bp，GC含量36.35%，圓柱山羊草片段長(zhǎng)度591"bp，GC含量36.04%。二者之間有15個(gè)差異位點(diǎn)，分別是551位圓柱山羊草有9個(gè)堿基（GTCTTTTCT）的缺失;490位有1個(gè)堿基（A）的插入，157位有2個(gè)堿基（AA）的插入;63（G/T）、501（A/G）和506（C/A）位各有1個(gè)堿基差異（圖3）。

為確定trnHpsbA序列在節(jié)節(jié)麥與圓柱山羊草之間的鑒定能力，本研究采用鄰接法構(gòu)建了NJ樹(shù)（圖4）。分析顯示，節(jié)節(jié)麥與圓柱山羊草親緣關(guān)系極為相近，NJ樹(shù)支持率為96.0%，二者種內(nèi)樣本分別聚為一支，表現(xiàn)出單系統(tǒng)性，彼此能夠明顯區(qū)分。

2.3"特異性驗(yàn)證

選取小麥及17種禾本科雜草對(duì)trnHpsbA條形碼區(qū)段進(jìn)行特異性驗(yàn)證。結(jié)果表明，trnHpsbA序列片段長(zhǎng)度在563～593"bp之間，其中無(wú)芒雀麥最短（563"bp），小麥和節(jié)節(jié)麥最長(zhǎng)（593"bp），比對(duì)后序列總長(zhǎng)度為599"bp。序列GC含量在34.43%～37.70%之間，其中早熟禾最低（34.43%），虎尾草、狼尾草和馬唐均為37.70%。節(jié)節(jié)麥第48位存在特異性堿基G，其他17份材料堿基相同（T）;圓柱山羊草第475位存在特異性堿基A插入，其他物種缺失（-）;圓柱山羊草第486位特異性堿基為G，無(wú)芒雀麥缺失（-），其他16份材料堿基（T）相同，證明trnHpsbA區(qū)段在供試材料中存在特異性，可用于鑒別節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草。

通過(guò)MEGA"6.0軟件計(jì)算遺傳距離，節(jié)節(jié)麥與其他17份材料的遺傳距離為0.003"6～0.056"2，圓柱山羊草與其他17份材料的遺傳距離為0.002"5～0.052"4。應(yīng)用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草與其他16份材料均存在差異（圖5）。其中節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草聚為同一類群，與小麥和無(wú)芒雀麥類群親緣關(guān)系較近，但也較易區(qū)分;野燕麥、看麥娘、日本看麥娘、大穗看麥娘、早熟禾、菵草、鬼蠟燭和硬草均聚于同一類群，與節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草類群親緣關(guān)系較遠(yuǎn);牛筋草、虎尾草、馬唐、糠稷、狗尾草、狼尾草所在的類群與節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草類群的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。上述結(jié)果表明，trnHpsbA區(qū)段能將節(jié)節(jié)麥與圓柱山羊草分開(kāi)，并且與其他禾本科雜草也存在顯著差異，具有很強(qiáng)的特異性。

3"討論

近年來(lái)，SSR、ISSR和RFLP等分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于對(duì)節(jié)節(jié)麥的鑒定及遺傳背景分析。蘇亞蕊等［18］選用32對(duì)SSR引物，對(duì)不同來(lái)源的147份節(jié)節(jié)麥進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示中東地區(qū)的節(jié)節(jié)麥遺傳多樣性高于中國(guó)黃河流域的節(jié)節(jié)麥。李玉閣等［19］利用9個(gè)ISSR引物對(duì)75份節(jié)節(jié)麥的遺傳多樣性進(jìn)行分析，認(rèn)為中國(guó)的節(jié)節(jié)麥具有較高的遺傳變異，并篩選到5個(gè)具有獨(dú)特遺傳變異的黃河流域節(jié)節(jié)麥種群。郜曉峰等［20］以762份中國(guó)節(jié)節(jié)麥資源作為試驗(yàn)材料，利用28對(duì)SSR引物共檢測(cè)出62個(gè)等位變異，結(jié)果顯示節(jié)節(jié)麥的遺傳變異較小，許多材料DNA片段的多態(tài)性表現(xiàn)一致，新疆節(jié)節(jié)麥有較為豐富的遺傳多樣性。此外，伏建國(guó)等［21］研究了一種PCRRFLP分子鑒定方法，能夠快速、準(zhǔn)確地將檢疫性山羊草屬雜草與非檢疫性種類區(qū)分開(kāi)來(lái)，可以從分子水平上快速、準(zhǔn)確地鑒定出山羊草屬檢疫性雜草。分子標(biāo)記能夠直接反映基因組DNA間的差異，但物種間通用性不如DNA條形碼。

DNA條形碼是一段短的、標(biāo)準(zhǔn)化的DNA序列，DNA條形碼技術(shù)通過(guò)對(duì)DNA條形碼序列分析實(shí)現(xiàn)物種的有效鑒定，是近年來(lái)生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，也是生物學(xué)發(fā)展最迅速的方向之一［22］。DNA條形碼技術(shù)鑒定準(zhǔn)確率高、重復(fù)性好，且不受環(huán)境、物種等因素限制，方法通用性強(qiáng)，為物種鑒定和新種發(fā)現(xiàn)提供了方便快捷的手段和分子依據(jù)［23］。國(guó)際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組（CBOL"Plant"Working"Group）推薦matK和rbcL組合作為陸地植物的核心DNA條形碼［24］。在第三屆國(guó)際生命條形碼大會(huì)上，ITS2和trnHpsbA又被推薦作為植物條形碼的輔助條形碼。

用于DNA條形碼研究的材料，最好采自不同地域和居群，應(yīng)盡可能地覆蓋物種的整個(gè)分布區(qū)［25］。本研究所用的節(jié)節(jié)麥材料來(lái)源于河北、山東、山西、河南、重慶、陜西、新疆、內(nèi)蒙古和江蘇等省，是節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草的大面積典型發(fā)生區(qū)，可以最大限度地覆蓋二者的遺傳變異范圍，具有較好的代表性。

選取的DNA條形碼序列不同，鑒定效率也有很大差別。作為DNA條形碼鑒定的目標(biāo)基因區(qū)段，應(yīng)具備較高的物種間多態(tài)性和物種內(nèi)穩(wěn)定性，從而在序列比對(duì)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的物種區(qū)分能力。蘇杰天等［16］利用4個(gè)DNA條形碼候選序列（rbcL、matK、trnHpsbA和ITS2）對(duì)13份大穗看麥娘和10份日本看麥娘葉片材料進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)ITS2序列無(wú)種內(nèi)差異，種間平均遺傳距離大于rbcL，顯示較高的種間多態(tài)性和特異性，適宜用于大穗看麥娘和日本看麥娘的準(zhǔn)確鑒定。張毅笑等［26］利用rbcL、matK、ITS2序列對(duì)采自我國(guó)向日葵主產(chǎn)區(qū)的58份彎管列當(dāng)樣品進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)3個(gè)DNA條形碼序列中僅ITS2片段鑒定結(jié)果理想，將供試樣品聚為3類，分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。因此，選擇最為有效的DNA條形碼序列進(jìn)行物種鑒定尤為關(guān)鍵。本研究中節(jié)節(jié)麥與圓柱山羊草的rbcL序列完全一致，不具備物種間多態(tài)性，無(wú)法區(qū)分這兩種檢疫性雜草;而trnHpsbA序列具有較高的種間多態(tài)性和種內(nèi)穩(wěn)定性，在序列比對(duì)中表現(xiàn)出極強(qiáng)的物種區(qū)分能力，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性高和特異性強(qiáng)。

4"結(jié)論

通過(guò)對(duì)節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草DNA條形碼區(qū)段的序列信息、差異位點(diǎn)和NJ樹(shù)分析，確定trnHpsbA為最優(yōu)鑒定區(qū)段，可用來(lái)準(zhǔn)確鑒定節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草，特異性檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)trnHpsbA區(qū)段鑒定具有準(zhǔn)確性和特異性。本研究為準(zhǔn)確鑒定節(jié)節(jié)麥和圓柱山羊草提供了新的分子檢測(cè)技術(shù)，可用于相關(guān)種子、苗期樣本或破碎組織的快速、準(zhǔn)確鑒定。

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