摘要

挖掘抗病基因可為蘋果抗病育種提供基因材料。本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)分析和功能驗(yàn)證，分析了長(zhǎng)春花類受體激酶1類蛋白（Catharanthus"roseus"receptorlike"kinase1like，"CrRLK1L）亞家族成員MdFER1在蘋果腐爛病抗性中的作用。結(jié)果表明，MdFER1與擬南芥FER同源但序列相似性較低，僅為46.4%。在‘煙富6號(hào)’果實(shí)和‘王林’懸浮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)MdFER1，果實(shí)和細(xì)胞對(duì)蘋果腐爛病的抗性顯著降低。MdFER1瞬時(shí)表達(dá)可顯著誘導(dǎo)活性氧（reactive"oxygen"species，"ROS）相關(guān)基因TaNOX和超敏反應(yīng)（hypersensitive"response，"HR）相關(guān)基因HSR203的表達(dá)，但抑制防御相關(guān)基因PR1和EDS1的表達(dá)。綜上所述，MdFER1負(fù)調(diào)控‘煙富6號(hào)’果實(shí)和‘王林’懸浮細(xì)胞對(duì)蘋果腐爛病抗性，ROS和HR信號(hào)被激活和防御相關(guān)基因表達(dá)被抑制是該基因負(fù)調(diào)控蘋果腐爛病抗性的重要原因。

關(guān)鍵詞

蘋果腐爛病;"長(zhǎng)春花類受體激酶1類蛋白;"標(biāo)記基因

中圖分類號(hào)：

S"436.611.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023657

The"malectinlike"kinase"MdFER1"negatively"regulates"resistance"to"Valsa"canker

ZHENG"Yan1，"LU"Yuan1，"SUN"E1，"CAI"Minrui1，"LIU"Zhihong1，"ZUO"Cunwu1*，"NIU"Junqiang2*

（1."College"of"Horticulture，"Gansu"Agricultural"University，"Lanzhou"730070，"China;"2."Institute"of"Fruit"

and"Flower"Research，"Gansu"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Lanzhou"730070，"China）

Abstract

Screening"for"resistance"genes"can"provide"valuable"genetic"materials"for"breeding"apple"varieties"with"enhanced"resistance."We"analyzed"the"role"of"MdFER1，"a"member"of"the"Catharanthus"roseus"receptorlike"kinase1like"（CrRLK1L）"proteins"subfamily，"in"apple"Valsa"canker"resistance"through"bioinformatics"analysis，"expression"analysis，"and"functional"verification"of"the"gene."The"results"showed"that"MdFER1"is"homologous"to"Arabidopsis"FER，"although"the"sequence"similarity"is"only"46.4%."Transient"expression"of"MdFER1"in"either"‘Yanfu"6’"fruits"or"‘Wanglin’"suspension"cells"significantly"reduced"resistance"to"apple"Valsa"canker."Additionally，"MdFER1"transient"expression"significantly"activated"the"expression"of"genes"associated"with"reactive"oxygen"species"（TaNOX）"and"hypersensitive"response"（HSR203），"but"inhibited"the"expression"of"defenserelated"genes"PR1"and"EDS1."In"summary，"MdFER1"negatively"regulates"resistance"to"apple"Valsa"canker"in"‘Yanfu"6’"fruits"or"‘Wanglin’"suspension"cells."The"activation"of"ROS"and"HR"signaling，"along"with"the"inhibition"of"defenserelated"gene"expression，"are"key"factors"contributing"to"the"negative"regulation"of"apple"Valsa"canker"resistance"by"MdFER1.

Key"words

apple"Valsa"canker;"Catharanthus"roseus"receptorlike"kinase1like;"marker"gene

由腐生黑腐皮殼屬Valsa"spp.致病真菌引起的腐爛?。╒alsa"canker）極具破壞性，可導(dǎo)致植株主干或主枝韌皮組織腐爛乃至整棵樹(shù)死亡，是蘋果和梨產(chǎn)業(yè)的重大真菌病害［16］。長(zhǎng)期以來(lái)，科技工作者研發(fā)了多種農(nóng)業(yè)防治、物理防治、生物防治和化學(xué)防治措施，但由于病原菌菌絲可深入至木質(zhì)部，現(xiàn)有的防控措施仍很難實(shí)現(xiàn)對(duì)該病害的根治［7］。抗病分子育種從病原物與寄主互作機(jī)制出發(fā)，深入挖掘抗病基因，從而定向培育抗性植物。蘋果組織再生、遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯技術(shù)體系的不斷成熟為抗病育種提供了可能［89］。因此，深入研究腐爛病抗性機(jī)理并挖掘主效基因?qū)涌煊N進(jìn)程具有重要作用。

植物對(duì)病原體的免疫反應(yīng)包括基礎(chǔ)免疫和寄主特異性免疫，其中基礎(chǔ)免疫在植物抵抗腐生菌中起重要作用，其主要由植物模式識(shí)別受體（pattern"recognition"receptor，"PRRs）響應(yīng)病原菌分子模式（pathogen"associate"molecular"patterns，"PAMPs）后啟動(dòng)［10］。類受體激酶（receptorlike"kinase，"RLK）家族擁有龐大的家族成員，其多個(gè)成員響應(yīng)PAMPs信號(hào)并激活免疫反應(yīng)［11］。長(zhǎng)春花類受體激酶1類蛋白（Catharanthus"roseus"receptorlike"kinase1like，CrRLK1L）亦被稱為Malectin樣受體激酶，其亞家族成員FERONIA（FER）參與多種生物學(xué)過(guò)程，如感知細(xì)胞壁完整性、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)及免疫反應(yīng)等［12］。fer純合突變體增強(qiáng)了擬南芥對(duì)高氏白粉病菌Golovinomyces"orontii的抗性［13］。FER也負(fù)調(diào)控寄主對(duì)尖孢鐮刀菌Fusarium"oxysporum的免疫反應(yīng)［14］。蘋果FER類受體激酶"MdMRLK2過(guò)表達(dá)抑制植物抗病防御體系和超敏反應(yīng)，負(fù)調(diào)控蘋果腐爛病的抗性［12］。此外，F(xiàn)ER可與PRRs形成復(fù)合物正向調(diào)節(jié)植物基礎(chǔ)免疫反應(yīng)［1516］。因此，F(xiàn)ER功能的多樣性引起了研究者的廣泛研究。

本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析、表達(dá)分析和功能驗(yàn)證，分析MdFER1在蘋果腐爛病抗性中的作用，并對(duì)免疫反應(yīng)中重要信號(hào)通路的標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行分析。初步解析蘋果類受體激酶MdFER1的功能，為抗病基因的鑒定提供參考。

1"材料與方法

1.1"材料

1.1.1"病原菌及植物材料

蘋果腐爛病菌Valsa"mali（Vm）菌株VmA019分離自甘肅靜寧發(fā)病‘富士’蘋果樹(shù)韌皮組織?！趿帧仓旰汀疅煾?號(hào)’果實(shí)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，

‘王林’愈傷組織由‘王林’植株的幼嫩葉片誘導(dǎo)獲得，‘王林’懸浮細(xì)胞由‘王林’愈傷組織在MS液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)獲得。

1.1.2"試劑及載體材料

大腸桿菌TreliefTM"5α購(gòu)買自北京擎科生物科技股份有限公司;SteadyPure質(zhì)粒DNA提取試劑盒、Evo"MMLV"RTPCR試劑盒、Evo"MMLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒、SYBR"Green"Pro"Taq"HS預(yù)混型qPCR試劑盒和DNA連接試劑盒購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司;AscⅠ和AvrⅡ酶購(gòu)買自賽默飛世爾科技公司;GV3101感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司;柱式RNA提取試劑盒和載體pFGC5941購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司。頭孢霉素、MES"［2（N嗎啡啉）乙磺酸］、AS（乙酰丁香酮）、6BA（6芐氨基喋呤）、2，4滴、瓊脂粉和蔗糖購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。M519購(gòu)自PhytoTech"Labs。

1.1.3"培養(yǎng)基

MS液體培養(yǎng)基：每1"000"mL培養(yǎng)基中含4.43"g"M519、2"mL"6BA（1"mg/mL）、0.5"mL"2，4滴（1"mg/mL）和30"g蔗糖。MS液體培養(yǎng)基中加入0.8%瓊脂粉為MS固體培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基高溫滅菌（121℃，20"min）后使用。

1.2"方法

1.2.1"表達(dá)載體構(gòu)建及結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)蘋果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得到差異基因MD17G1063000，該基因經(jīng)注釋具有長(zhǎng)春花類受體激酶1類蛋白的功能。利用薔薇科基因組在線數(shù)據(jù)庫(kù)GDR（genome"database"for"Rosaceae，"https："∥www.rosaceae.org/species/malus/all）獲得MD17G1063000的CDS序列和蛋白序列。將MD17G1063000的蛋白序列提交至擬南芥在線數(shù)據(jù)資源庫(kù)TAIR（Arabidopsis"information"resource，"http：∥www.arabidopsis.org）比對(duì)相似性，并根據(jù)擬南芥同源基因名稱將MD17G1063000命名為MdFER1。利用在線軟件SMART（http："∥smart.emblheidelberg.de/）預(yù)測(cè)MdFER1蛋白序列是否包含Malectin結(jié)構(gòu)域。使用Primer"Premier"5.0設(shè)計(jì)MdFER1特異性引物pFGC5941MdFER1（表1）。

使用柱式RNA提取試劑盒提取培養(yǎng)3"d的‘王林’懸浮細(xì)胞的RNA，利用Evo"MMLV"RTPCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用特異性引物pFGC5941MdFER1，以cDNA為模板擴(kuò)增MdFER1全長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。產(chǎn)物與克隆載體pMDTM19T連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TreliefTM"5α。挑選陽(yáng)性單克隆送擎科生物科技股份有限公司測(cè)序。挑選測(cè)序正確的菌液擴(kuò)繁，并用SteadyPure質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)AscⅠ和AvrⅡ酶切后，使用DNA連接酶連接至表達(dá)載體pFGC5941中，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，與50%甘油混合后保存至-80℃冰箱備用。

1.2.2"MdFER1組織特異性分析

收集健康野生‘王林’植株的不同組織（葉片、新根、果實(shí)、莖及花），樣品經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃?zhèn)溆?使用柱式RNA提取試劑盒提取不同組織的RNA。使用Evo"MMLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該cDNA為模板使用MdFER1引物（表1）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative"realtime"PCR，qPCR）分析。qPCR反應(yīng)體系（20"μL）：cDNA"1"μL，上、下游引物（10"μmol/L）各1"μL，超純水7"μL，SYBR"Green"Master"Mix"10"μL。反應(yīng)條件為：95℃"2"min;95℃"10"s，58℃"20"s;40個(gè)循環(huán)。以Actin為內(nèi)參基因，以全部組織中目標(biāo)基因的平均表達(dá)量為對(duì)照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)基因的表達(dá)量，其中ΔΔCt=ΔCt試驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組;ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。采用"IBM"SPSS"Statistics"22進(jìn)行單因素方差分析，鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)置為0.05。

1.2.3"MdFER1響應(yīng)腐爛病菌信號(hào)的表達(dá)分析

1.2.3.1"蘋果腐爛病菌代謝物制備

參照Sun等［17］的方法收集蘋果腐爛病VmA019菌株的代謝物。具體如下：將VmA019菌株接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato"dextrose"agar，"PDA）活化72"h;而后在菌落邊緣均勻取10個(gè)菌餅接種至馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（potato"dextrose"broth，"PDB）中，于25℃培養(yǎng)箱中黑暗、靜置培養(yǎng)72"h（每隔12"h振蕩1次），經(jīng)離心和過(guò)濾除菌，獲得菌株VmA019的代謝物原液，保存于4℃冰箱，用于處理‘王林’懸浮細(xì)胞。

1.2.3.2"‘王林’一年生枝條中MdFER1對(duì)腐爛病菌的響應(yīng)

使用一次性打孔器在‘王林’一年生枝條均勻打3個(gè)孔，在活化72"h的VmA019在菌落邊緣均勻取3個(gè)菌餅接種至‘王林’一年生枝條，并在接種后24、36"h和48"h在接種部位取樣，樣品經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃?zhèn)溆?，RNA提取及熒光定量分析同1.2.2。以未處理（0"h）的‘王林’一年生枝條為對(duì)照，Actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算24、36"h和48"h時(shí)MdFER1的表達(dá)量。

1.2.3.3"‘王林’懸浮細(xì)胞中MdFER1對(duì)蘋果腐爛病菌代謝物的響應(yīng)

取繼代培養(yǎng)3"d的‘王林’懸浮細(xì)胞，利用40目細(xì)胞過(guò)濾篩去除較大細(xì)胞團(tuán)，再用200目細(xì)胞過(guò)濾收集小的‘王林’細(xì)胞團(tuán)，將500"μL‘王林’細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)入36"mL"MS液體培養(yǎng)基中，25℃、130"r/min黑暗培養(yǎng)48"h后加入4"mL蘋果腐爛病菌的代謝物（Valsa"mali"metabolite，VmM），分別于處理后1、3"和6"h收集懸浮細(xì)胞，液氮速凍后保存于-80℃，以未處理（0"h）的‘王林’懸浮細(xì)胞為對(duì)照，Actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算1、3"h和6"h時(shí)MdFER1的表達(dá)量;RNA提取及熒光定量分析同1.2.2。

1.2.4"‘煙富6號(hào)’果實(shí)上瞬時(shí)過(guò)表達(dá)MdFER1及功能驗(yàn)證

將攜帶pFGC5941（空載體，對(duì)照）和pFGC5941MdFER1的農(nóng)桿菌菌株在28℃，220"r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600為0.4～0.6時(shí)收集菌液，使用農(nóng)桿菌重懸緩沖液（含10"mmol/L"MES，200"μmol/L"AS）重懸活化的農(nóng)桿菌，于4℃冰箱靜置4"h。使用一次性無(wú)菌注射器吸取0.2"mL重懸液注射進(jìn)‘煙富6號(hào)’果實(shí)中，放置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3"d，3"d后分別在注射部位取樣測(cè)定MdFER1是否成功過(guò)表達(dá)，以攜帶pFGC5941的農(nóng)桿菌處理為對(duì)照，Actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算暗培養(yǎng)3"d時(shí)MdFER1的表達(dá)量，樣品保存、RNA提取及熒光定量分析見(jiàn)1.2.2。同時(shí)，暗培養(yǎng)3"d后在注射部位接種蘋果腐爛病菌，并在接種后24、48、72"h和96"h使用十字交叉法測(cè)量發(fā)病部位直徑。數(shù)據(jù)采用Microsoft"Excel"2007統(tǒng)計(jì)，使用t測(cè)驗(yàn)（α=0.05）分析瞬時(shí)表達(dá)pFGC5941和pFGC5941MdFER1的果實(shí)上病斑直徑的差異顯著性。

1.2.5"在‘王林’懸浮細(xì)胞中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)MdFER1及功能驗(yàn)證

將攜帶pFGC5941和pFGC5941MdFER1的農(nóng)桿菌菌株在28℃，220"r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600為0.4～0.6時(shí)收集菌液用MS液體培養(yǎng)基重懸，而后與‘王林’懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)48"h，獲得的懸浮細(xì)胞用含有200"μg/mL的頭孢霉素的滅菌水清洗3次，參照1.2.2的方法測(cè)定共培養(yǎng)細(xì)胞中MdFER1的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)將上述懸浮細(xì)胞平鋪于大小為35"mm×10"mm的MS固體培養(yǎng)基上，接種直徑5"mm的蘋果腐爛病菌菌餅，于接種后24、36"h和48"h使用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。數(shù)據(jù)分析同1.2.4。

1.2.6"瞬時(shí)表達(dá)MdFER1的‘王林’懸浮細(xì)胞中不同信號(hào)通路標(biāo)記基因表達(dá)模式分析

按1.2.5的方法制備MdFER1瞬時(shí)過(guò)表達(dá)細(xì)胞。使用蘋果腐爛病菌的代謝物處理瞬時(shí)表達(dá)pFGC5941（對(duì)照）及pFGC5941MdFER1的細(xì)胞，處理方法同1.2.3.3;分別在處理后1、3"h和6"h后取樣測(cè)定EDS1、HSR203、PR1以及TaNOX的表達(dá)量;樣品RNA保存、提取及熒光定量分析見(jiàn)1.2.2。數(shù)據(jù)采用Microsoft"Excel"2007統(tǒng)計(jì)，使用t測(cè)驗(yàn)（α=0.05）分析同時(shí)期瞬時(shí)表達(dá)pFGC5941和pFGC5941MdFER1細(xì)胞中不同信號(hào)通路標(biāo)記基因相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性。

2"結(jié)果分析

2.1"MdFER1生物信息學(xué)分析

對(duì)MdFER1蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析表明，該蛋白包含典型的Malectin結(jié)構(gòu)域（圖1b），是典型的長(zhǎng)春花類受體激酶1類蛋白亞家族成員。以‘王林’懸浮細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，采用MdFER1特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增和克隆，結(jié)果顯示，目標(biāo)條帶與MdFER1基因片段大小一致（圖1a），全長(zhǎng)2"505"bp。

2.2"MdFER1組織特異性分析

為研究MdFER1在‘王林’植株的不同組織中的表達(dá)模式，通過(guò)RTqPCR對(duì)MdFER1在葉片、新生根部、果實(shí)等組織中的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，MdFER1在‘王林’果實(shí)中的表達(dá)量最高，其次為花和葉片;在莖中的表達(dá)量最低（圖2）。

2.3"MdFER1對(duì)蘋果腐爛病菌及其代謝物的響應(yīng)

利用RTqPCR分析了蘋果腐爛病菌和蘋果腐爛病菌代謝物處理下MdFER1的表達(dá)模式。與沒(méi)有接種蘋果腐爛病菌的‘王林’一年生枝條相比，接種蘋果腐爛病菌24、36"h和48"h后，MdFER1的相對(duì)表達(dá)量分別下調(diào)18.6%、68.7%和37.9%（圖3a）。與未用蘋果腐爛病菌代謝物處理的‘王林’懸浮細(xì)胞相比，10%蘋果腐爛病菌代謝物處理‘王林’懸浮細(xì)胞后1、3"h和6"h，MdFER1的表達(dá)量分別下調(diào)了30.2%、78.95%和55.6%（圖3b）。表明MdFER1的表達(dá)受蘋果腐爛病菌信號(hào)誘導(dǎo)。

2.4"MdFER1在果實(shí)中瞬時(shí)表達(dá)及其對(duì)腐爛病菌的調(diào)控

利用農(nóng)桿菌滲透法在‘煙富6號(hào)’蘋果果實(shí)中瞬時(shí)表達(dá)pFGC5941MdFER1，并在接種蘋果腐爛病菌后24、48、72"h和96"h檢測(cè)果實(shí)發(fā)病情況，以評(píng)價(jià)MdFER1瞬時(shí)表達(dá)對(duì)蘋果腐爛病抗性的影響。接種后96"h，瞬時(shí)表達(dá)pFGC5941MdFER1的果實(shí)病斑直徑明顯大于表達(dá)空載體pFGC5941的對(duì)照（圖4a，"b），且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4d）。RTqPCR結(jié)果顯示，MdFER1在蘋果果實(shí)中成功瞬時(shí)過(guò)表達(dá)（圖4c）。結(jié)果表明，MdFER1負(fù)調(diào)控蘋果果實(shí)對(duì)蘋果腐爛病的抗性。

2.5"MdFER1在‘王林’懸浮細(xì)胞中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)及其對(duì)腐爛病菌的調(diào)控

為了進(jìn)一步研究MdFER1對(duì)蘋果腐爛病菌的調(diào)控作用，將MdFER1在‘王林’懸浮細(xì)胞中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)。RTqPCR結(jié)果顯示，pFGC5941MdFER1表達(dá)上調(diào)至對(duì)照的36.5倍，已成功過(guò)表達(dá)（圖5c）。對(duì)pFGC5941處理的對(duì)照細(xì)胞和過(guò)表達(dá)pFGC5941MdFER1的細(xì)胞分別接種蘋果腐爛病菌，并在接種后24、36"h和48"h測(cè)定菌絲生長(zhǎng)直徑，結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)pFGC5941MdFER1的細(xì)胞上腐爛病菌生長(zhǎng)迅速，但在對(duì)照細(xì)胞上生長(zhǎng)緩慢（圖5a，b，d）。以上結(jié)果表明，MdFER1負(fù)調(diào)控‘王林’懸浮細(xì)胞對(duì)蘋果腐爛病菌的抗性。

2.6"過(guò)表達(dá)MdFER1的‘王林’懸浮細(xì)胞中相關(guān)通路標(biāo)記基因表達(dá)量

為進(jìn)一步探究MdFER1調(diào)節(jié)蘋果腐爛病的免疫機(jī)制，使用10%的蘋果腐爛病菌的代謝物處理瞬時(shí)表達(dá)pFGC5941（對(duì)照）和pFGC5941MdFER1的細(xì)胞，處理后1、3"h和6"h采用RTqPCR檢測(cè)了植物防御相關(guān)基因的表達(dá)水平。由圖6可知，與對(duì)照細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)MdFER1誘導(dǎo)了活性氧通路基因TaNOX和超敏反應(yīng)通路基因HSR203的表達(dá)，且在處理1"h時(shí)TaNOX表達(dá)量達(dá)到最高值。而HSR203的表達(dá)在處理后隨著時(shí)間的變化持續(xù)上升，在6"h時(shí)最高，為對(duì)照的12.23倍。此外，過(guò)表達(dá)MdFER1后，系統(tǒng)性獲得抗性相關(guān)基因PR1和抗性R基因相關(guān)基因EDS1的表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照細(xì)胞的水平。綜上，MdFER1瞬時(shí)表達(dá)后可激活ROS和HR相關(guān)的信號(hào)通路，但降低了抗性R基因及系統(tǒng)性獲得抗性基因的表達(dá)。

3"結(jié)論與討論

長(zhǎng)春花類受體激酶1類蛋白基因作為重要的受體激酶亞家族，已在擬南芥、水稻等一些模式植物中廣泛研究。在擬南芥中，fer突變體增強(qiáng)了擬南芥對(duì)真菌尖孢鐮刀菌Fusarium"oxysporum的抗性［14］。水稻FERONIA樣受體基因OsFLR2和OsFLR11通過(guò)抑制防御相關(guān)基因表達(dá)減弱了水稻幼苗對(duì)稻瘟病的抗性［18］。本研究中，MdFER1的表達(dá)受蘋果腐爛病菌信號(hào)抑制，且瞬時(shí)表達(dá)MdFER1顯著降低‘煙富6號(hào)’果實(shí)和‘王林’懸浮細(xì)胞對(duì)蘋果腐爛病菌的抗性。因此，盡管MdFER1和擬南芥等物種中FER的序列相似性較低，但其在調(diào)控真菌抗性方面的功能相對(duì)保守，負(fù)調(diào)控植物對(duì)多種真菌的抗性［14，18］。

活性氧是一種重要的信號(hào)分子，在植物免疫反應(yīng)過(guò)程中起重要的調(diào)控作用［18］。ROS通路相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)可激活植物細(xì)胞的超敏反應(yīng)（HR），進(jìn)而有效限制寄生菌的進(jìn)一步侵染。然而，ROS爆發(fā)對(duì)腐生菌抗性的調(diào)控存在時(shí)空特異性，其激活的HR有利于腐生病原菌進(jìn)一步繁殖［1921］。禾谷鐮孢Fusarium"graminearum分泌的高濃度毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，"DON）可以刺激ROS積累進(jìn)而促進(jìn)其在寄主植物上的生長(zhǎng)及侵染［22］。燕麥葉枯病菌Cochliobolus"victoriae可以通過(guò)分泌毒素victorin誘導(dǎo)HR反應(yīng)及細(xì)胞死亡，最終促進(jìn)病原菌的繁殖［23］。蘋果腐爛病菌的代謝物處理后，與表達(dá)pFGC5941的對(duì)照細(xì)胞相比，MdFER1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中HR相關(guān)基因HSR203和ROS相關(guān)基因TaNOX的表達(dá)量都顯著上調(diào)，而防御相關(guān)基因PR1及R蛋白EDS1的表達(dá)量都被大幅度抑制。推測(cè)ROS和HR信號(hào)的激活和防御基因表達(dá)的抑制可能是MdFER1負(fù)調(diào)控腐爛病抗性的重要原因。

綜上所述，MdFER1和擬南芥FER同源，但序列相似性較低，為46.4%，其響應(yīng)蘋果腐爛病菌信號(hào)且負(fù)調(diào)控蘋果腐爛病抗性;ROS和HR信號(hào)的激活和防御相關(guān)基因表達(dá)的抑制是MdFER1負(fù)調(diào)控腐爛病抗性的重要原因。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）