摘要

為明確云南省常見馬鈴薯品種對(duì)馬鈴薯金線蟲Globodera"rostochiensis抗性的差異，選擇云南省常見或生產(chǎn)上主要推廣的馬鈴薯品種25個(gè)，參考Koroleva的評(píng)價(jià)方法，結(jié)合抗性分子標(biāo)記N146、N195、57R、TG432、Gro141和抗性基因H1的相對(duì)表達(dá)量，評(píng)價(jià)馬鈴薯品種對(duì)金線蟲的抗性，分析抗性與抗性基因H1表達(dá)量的相關(guān)性。結(jié)果顯示：供試的25個(gè)品種中，有7個(gè)品種根系上馬鈴薯金線蟲的孢囊或雌蟲≤5個(gè)，表現(xiàn)抗性，其他品種根系上的孢囊或雌蟲大于5個(gè)，表現(xiàn)為易感;抗性分子標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)，有10個(gè)品種含有抗馬鈴薯金線蟲基因H1;對(duì)這10個(gè)品種的H1基因相對(duì)表達(dá)量的檢測結(jié)果顯示，接種馬鈴薯金線蟲后‘V7’‘黃金薯’‘會(huì)薯19號(hào)’‘宣薯5號(hào)’‘云薯202’‘云薯304’‘云薯505’"7個(gè)品種的H1基因較未接種時(shí)上調(diào)表達(dá)，而‘P14187’‘會(huì)薯15號(hào)’‘希森3號(hào)’3個(gè)品種的H1基因下調(diào)表達(dá)，攜帶H1基因的馬鈴薯品種是否對(duì)金線蟲有抗性與抗性基因H1表達(dá)量呈正相關(guān)。研究結(jié)果為抗金線蟲馬鈴薯品種選育與應(yīng)用及進(jìn)一步闡明馬鈴薯抗金線蟲的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

馬鈴薯品種;"馬鈴薯金線蟲;"H1基因;"抗性

中圖分類號(hào)：

S"435.32

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2024175

The"correlations"between"the"resistance"of"common"potato"varieties"to"Globodera"rostochiensis"and"the"H1"gene"in"Yunnan"province

DUAN"Jinfeng，"YANG"Yanmei，"LIU"Yuzhu，"LI"Qiankun，"HU"Xianqi*

（State"Key"Laboratory"for"the"Conservation"and"Utilization"of"Biological"Resources"in"Yunnan，"

College"of"Plant"Protection，"Yunnan"Agricultural"University，"Kunming"650201，"China）

Abstract

To"identify"the"differences"in"resistance"among"common"potato"varieties"to"Globodera"rostochiensis"in"Yunnan"province，"25"varieties，"including"both"common"and"widely"cultivated"ones，"were"selected"for"evaluation"using"Koroleva’s"method."In"this"study"the"molecular"markers"N146，"N195，"57R，"TG432，"Gro141，"and"the"H1"resistance"gene"were"employed"to"evaluate"resistance"levels"and"analyze"the"correlation"between"resistance"and"H1"gene"expression."The"results"showed"that"among"the"25"varieties"tested，"seven"varieties"exhibited"resistance，"with"less"than"five"cysts"or"females"of"G.rostochiensis"on"their"root"systems，"while"the"remaining"varieties，"with"more"than"five"cysts"or"females，"were"susceptible."Molecular"marker"analysis"revealed"that"ten"varieties"containing"the"G.rostochiensis"resistance"gene"H1."Further"investigation"into"the"relative"expression"of"the"H1"gene"after"inoculation"with"G.rostochiensis"showed"that"in"seven"varieties，"namely"‘V7’"‘Huangjinshu’"‘Huishu"19’"‘Xuanshu"5’"‘Yunshu"202’"‘Yunshu"304’，"and"‘Yunshu"505’，"the"H1"gene"expression"was"upregulated"compared"to"uninoculated"controls."However，"in"three"varieties"‘P14187’"‘Huishu"15’"and"‘Xisen"3’，"the"H1"gene"expression"was"downregulated."The"study"concluded"that"the"resistance"of"potato"varieties"carrying"the"H1"gene"were"positively"correlated"with"H1"gene"expression."These"findings"provide"foundation"for"selecting"and"applying"potato"varieties"resistant"to"G.rostochiensis"and"for"further"elucidating"the"molecular"mechanisms"underlying"potato"resistance"to"G.rostochiensis.

Key"words

potato"varieties;"Globodera"rostochiensis;"H1"gene;"resistance

馬鈴薯Solanum"tuberosum是重要的糧食作物之一，在云南省種植面積僅次于玉米和水稻，云南省馬鈴薯在全國面積和總產(chǎn)量均居前4名，是中國馬鈴薯的主要生產(chǎn)地之一［12］。

馬鈴薯孢囊線蟲（potato"cyst"nematode，PCN）是為害馬鈴薯等茄科植物的病原線蟲［3］，主要包括馬鈴薯金線蟲Globodera"rostochiensis和馬鈴薯白線蟲G.pallida，分別在全世界79個(gè)和55個(gè)國家有發(fā)生和分布，100多個(gè)國家將其列為重要的對(duì)外檢疫性有害生物，也是我國重要的進(jìn)境檢疫性有害生物［47］，它們的為害可以造成馬鈴薯產(chǎn)量損失19%～80%［8］。2018年-2020年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在中國貴州省、四川省和云南省7縣（區(qū)）的局部馬鈴薯產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)了馬鈴薯金線蟲［913］。

PCN的卵可以在孢囊內(nèi)休眠存活很多年，且它們的天敵很少見，這意味著一旦傳入、定殖就很難根除。面對(duì)PCN的為害，當(dāng)前的防控方法主要是植物檢疫、非寄主植物輪作、種植抗性品種、生物防治、化學(xué)防治等，種植抗性品種被認(rèn)為是保護(hù)馬鈴薯等茄科作物免受PCN侵害最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保和有效的方法［14］。

研究表明，對(duì)于馬鈴薯金線蟲致病型Ro1～Ro5，最常見的是引入單一顯性基因H1控制［1516］，H1基因座位于馬鈴薯Ⅴ號(hào)染色體長臂末端，通過激活馬鈴薯的過敏反應(yīng)使其對(duì)馬鈴薯金線蟲致病型Ro1和Ro4表現(xiàn)出抗性［1718］。Solanum"spegazzinii"Ⅶ號(hào)染色體上的Gro1基因?qū).rostochiensis有廣譜抗性［19］，從S.spegazzinii的Ⅹ、Ⅺ和Ⅲ號(hào)染色體上鑒定到3個(gè)數(shù)量性狀基因座（quantitative"trait"loci，"QTL）Gro1.2、Gro1.3和Gro1.4也參與了對(duì)馬鈴薯金線蟲的抗性［20］，位于Ⅴ號(hào)染色體的短臂上QTL"Grp1對(duì)馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲均具有抗性［21］。

本研究選用云南省生產(chǎn)上主要推廣的馬鈴薯品種25個(gè)，在溫室接種進(jìn)行抗馬鈴薯金線蟲病評(píng)價(jià)，開展相關(guān)抗性基因分子檢測，并以篩選出的具有H1抗性基因的馬鈴薯品種為研究材料，采用qPCR技術(shù)，檢測受到馬鈴薯金線蟲侵染后，馬鈴薯品種中H1基因的表達(dá)情況及其對(duì)金線蟲的抗性與抗性基因H1表達(dá)量的相關(guān)性。旨在為抗金線蟲馬鈴薯品種選育、進(jìn)一步解析馬鈴薯抗金線蟲的分子機(jī)制、應(yīng)用抗病品種防治馬鈴薯金線蟲病提供科學(xué)依據(jù)。

1"材料與方法

1.1"供試材料

供試馬鈴薯金線蟲的孢囊分離自云南省昭通市昭陽區(qū)靖安鎮(zhèn)（27.59°N，103.69°E）采集的病土。

供試25個(gè)馬鈴薯品種收集于相關(guān)種薯生產(chǎn)基地，分別為：‘C米’‘P14187’‘V7’‘合作88’‘荷蘭15號(hào)’‘黃金薯’‘會(huì)薯2號(hào)’‘會(huì)薯15號(hào)’‘會(huì)薯16號(hào)’‘會(huì)薯19號(hào)’‘麗薯6號(hào)’‘青薯9號(hào)’‘希森3號(hào)’‘宣薯4號(hào)’‘宣薯5號(hào)’‘宣薯6號(hào)’‘宣薯8號(hào)’‘云薯108’‘云薯202’‘云薯304’‘云薯505’‘云薯901’‘云薯902’‘昭薯6號(hào)’‘專心烏’。

1.2"試驗(yàn)方法

1.2.1"馬鈴薯對(duì)馬鈴薯金線蟲病的抗性鑒定

從云南省昭通市靖安鎮(zhèn)松杉村西魁坪子采集病土，采用漂浮法［22］分離馬鈴薯金線蟲孢囊，在體視顯微鏡下將豐滿的孢囊挑出，用0.5%"NaClO表面消毒3～5"min，再用無菌水沖洗3～4次，放入4℃冰箱里保濕放置8～10周。

將馬鈴薯種植在體積為1"L的塑料盆中，每盆接種馬鈴薯金線蟲孢囊約100個(gè)，合計(jì)每100"mL土壤接種2齡幼蟲（the"second"stage"juvenile，J2）和卵3"000～3"500個(gè)。接種量測算方法：隨機(jī)挑選50個(gè)孢囊，切開計(jì)數(shù)孢囊中有效卵和J2的數(shù)量，得出每個(gè)孢囊有效卵和J2的平均值為304.4。待接種馬鈴薯金線蟲孢囊后75"d（馬鈴薯出苗后約2個(gè)半月），拔出馬鈴薯并輕輕抖落根上的土壤，觀察附著在根上馬鈴薯金線蟲孢囊或雌蟲的數(shù)量，參考Koroleva［23］的評(píng)價(jià)方法調(diào)查發(fā)病情況：根上有0～5個(gè)孢囊或雌蟲為抗性;根上有6個(gè)及更多孢囊或雌蟲為易感。

1.2.2"抗病基因的分子檢測

馬鈴薯出苗后15"d，采集馬鈴薯葉片，使用廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒（購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司）提取各品種葉片基因組DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。抗病基因H1、Gro1、Grp1等相關(guān)引物［24］（表1）由昆明擎科生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（15"μL）：2×Taq"PCR"Master"Mix"7.5"μL，10"μmol/L上、下游引物各0.25"μL，模板DNA"1"μL，超純水補(bǔ)足至15"μL。PCR擴(kuò)增程序見表2。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測"PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.2.3"實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測H1基因的相對(duì)表達(dá)量

在"NCBI"數(shù)據(jù)庫下載馬鈴薯的actin基因（內(nèi)參基因）和H1基因標(biāo)記57R的等位基因57R887［26］的序列，根據(jù)抗病基因CDS序列，使用Primer"3"Plus設(shè)計(jì)特異性引物（表3），引物序列通過昆明擎科生物有限公司合成。

根據(jù)1.2.2的結(jié)果，選擇攜帶H1基因的馬鈴薯品種為供試材料，

待馬鈴薯出苗后65"d，采集各品種馬鈴薯的根系，DEPC處理后用于提取馬鈴薯根系總RNA。

采用AG"RNAex"Pro"RNA提取試劑（湖南艾克瑞生物工程有限公司）提取馬鈴薯根系總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，核酸質(zhì)量分析儀對(duì)RNA的A260/A280、A260/A230以及濃度進(jìn)行測定。按照Evo"MMLV"RT"Mix"Kit"with"gDNA"Clean"for"qPCR"Ver.2"（湖南艾克瑞生物工程有限公司）的兩步法，先去除gDNA，再將ＲNA反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用SYBR"Green"Supermix"Pro"Taq"HS"qPCR"Kit（湖南艾克瑞生物工程有限公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系為10"μL：2×SYBR"Green"Pro"Taq"HS"Supermix"5"μL，ROX"reference"Dye"0.2"μL，10"μmol/L"正、反向引物各0.4"μL，cDNA模板0.5"μL，RNase"free"water"3.5"μL，混勻離心后進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2"min;95℃變性45"s，60℃退火30"s，72℃延伸1"min，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)各樣品的熔解曲線驗(yàn)證引物擴(kuò)增的特異性，每個(gè)樣品重復(fù)3次，以未接種金線蟲的品種中H1基因的表達(dá)量為對(duì)照。

采用2-ΔΔCT法［25］計(jì)算H1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4"馬鈴薯金線蟲的抗性水平與H1的相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析

在IBM"SPSS"26中使用點(diǎn)二列相關(guān)系數(shù)，對(duì)馬鈴薯金線蟲的抗性水平與抗性基因H1的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。共30個(gè)樣本（10個(gè)馬鈴薯品種3個(gè)重復(fù)）參與了相關(guān)性分析，其中一列變量為H1基因的相對(duì)表達(dá)量，另一列變量為馬鈴薯金線蟲的抗性水平（對(duì)馬鈴薯金線蟲有無抗性），對(duì)馬鈴薯金線蟲有抗性賦值1，沒有抗性賦值0;相關(guān)系數(shù)的顯著性采用t檢驗(yàn)，當(dāng)Plt;0.05，相關(guān)性顯著。

1.3"數(shù)據(jù)分析

使用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)，Graphpad"Prism"8.0.2進(jìn)行圖表繪制。

2"結(jié)果與分析

2.1"馬鈴薯品種的抗病性鑒定

接種馬鈴薯金線蟲后75"d，取樣觀察馬鈴薯根上的線蟲孢囊量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，‘V7’‘黃金薯’‘宣薯5號(hào)’‘云薯202’‘云薯304’‘云薯505’‘會(huì)薯19號(hào)’等7個(gè)馬鈴薯品種在溫室盆栽試驗(yàn)中，根系上的孢囊或雌蟲≤5個(gè)，表現(xiàn)出對(duì)馬鈴薯金線蟲有抗性;‘希森3號(hào)’‘P14187’‘會(huì)薯15號(hào)’‘C米’‘合作88’‘荷蘭15號(hào)’‘會(huì)薯2號(hào)’‘會(huì)薯16號(hào)’‘麗薯6號(hào)’‘青薯9號(hào)’‘宣薯4號(hào)’‘宣薯6號(hào)’‘宣薯8號(hào)’‘云薯108’‘云薯901’‘云薯902’‘昭薯6號(hào)’‘專心烏’等18個(gè)馬鈴薯品種在溫室盆栽試驗(yàn)中，根系上的孢囊或雌蟲gt;5個(gè)及更多，對(duì)馬鈴薯金線蟲表現(xiàn)為易感（表4）。

2.2"在馬鈴薯品種中抗性基因的檢測結(jié)果

利用6個(gè)分子標(biāo)記對(duì)供試的25個(gè)馬鈴薯品種進(jìn)行馬鈴薯金線蟲抗性基因檢測，檢測結(jié)果見表4和圖1。其中GBSS基因的分子標(biāo)記GBSS13為陽性對(duì)照。H1基因的3個(gè)分子標(biāo)記N146、N195和57R在‘V7’‘黃金薯’‘希森3號(hào)’‘宣薯5號(hào)’‘云薯202’‘云薯304’‘云薯505’‘P14187’‘會(huì)薯15號(hào)’‘會(huì)薯19號(hào)’等10個(gè)馬鈴薯品種中被檢測出來。Grp1基因的分子標(biāo)記TG432在25個(gè)馬鈴薯品種中均被檢測到，即在所有供試馬鈴薯品種全部含有Grp1基因，但是TG432的產(chǎn)物片段比文獻(xiàn)中所描述的大，超過了2"000"bp，重復(fù)試驗(yàn)得到了相同的結(jié)果。Gro1基因的分子標(biāo)記Gro141在25個(gè)馬鈴薯品種中都沒有檢測到，即所有供試馬鈴薯品種均不含Gro1基因的分子標(biāo)記。表明Grp1、Gro1的分子標(biāo)記不適合用于馬鈴薯金線蟲病抗性篩選。

2.3"攜帶抗性基因H1的馬鈴薯品種H1基因相對(duì)表達(dá)量

10個(gè)攜帶H1基因的馬鈴薯品種‘宣薯5號(hào)’‘云薯202’‘云薯304’‘會(huì)薯19號(hào)’‘黃金薯’‘V7’‘云薯505’‘希森3號(hào)’‘會(huì)薯15號(hào)’‘P14187’接種馬鈴薯金線蟲后H1基因相對(duì)表達(dá)量分別是未接種馬鈴薯金線蟲的34.47、3.11、2.25、5.50、3.55、2.61、8.16、0.31、0.22、0.93倍，其中‘希森3號(hào)’‘會(huì)薯15號(hào)’‘P14187’3個(gè)品種的H1基因相對(duì)表達(dá)量在接種馬鈴薯金線蟲后下調(diào)表達(dá)，另外7個(gè)品種上調(diào)表達(dá)（圖2）。結(jié)合前述接種試驗(yàn)抗性實(shí)際表現(xiàn)，H1基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào)的品種表現(xiàn)抗性，而下調(diào)的品種表現(xiàn)易感。

2.4"馬鈴薯品種對(duì)金線蟲的抗性水平與抗性基因H1相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性

在IBM"SPSS"26中，采用點(diǎn)二列相關(guān)系數(shù)表示抗性基因H1相對(duì)表達(dá)量與馬鈴薯品種對(duì)金線蟲抗性的相關(guān)性，分析表明，攜帶H1基因的馬鈴薯品種是否對(duì)金線蟲表現(xiàn)抗性與抗性基因H1表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為0.378，呈正相關(guān)，相關(guān)性顯著（Plt;0.05）。

3"結(jié)論與討論

本研究參考Koroleva的評(píng)價(jià)方法［23］評(píng)價(jià)云南常見馬鈴薯品種對(duì)馬鈴薯金線蟲的抗性，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯品種是否含有抗性基因相關(guān)分子標(biāo)記與對(duì)馬鈴薯金線蟲是否有抗性存在一定的關(guān)系，但是對(duì)馬鈴薯金線蟲表現(xiàn)出抗性的原因是復(fù)雜的，分子標(biāo)記檢測結(jié)果表明，遺傳和表型數(shù)據(jù)并不總是一致的。本研究中供試的25個(gè)品種有10個(gè)攜帶抗性基因H1，其中‘V7’‘黃金薯’‘會(huì)薯19號(hào)’‘宣薯5號(hào)’‘云薯202’‘云薯304’‘云薯505’7個(gè)品種在試驗(yàn)中對(duì)馬鈴薯金線蟲表現(xiàn)出抗性，而‘P14187’‘會(huì)薯15號(hào)’‘希森3號(hào)’3個(gè)品種含有H1基因的分子標(biāo)記，卻在試驗(yàn)中對(duì)馬鈴薯金線蟲易感。Koroleva等［23］研究結(jié)果顯示，在供試的50個(gè)馬鈴薯品種中有46個(gè)品種含有抗性基因的分子標(biāo)記且對(duì)馬鈴薯金線蟲表現(xiàn)出抗性，4個(gè)品種在含有抗性基因分子標(biāo)記的情況下表現(xiàn)出易感，本研究結(jié)果與此類似。明會(huì)等［24］利用馬鈴薯孢囊線蟲抗性分子標(biāo)記對(duì)馬鈴薯種質(zhì)資源進(jìn)行馬鈴薯金線蟲的抗性基因檢測，篩選到含有馬鈴薯金線蟲抗性基因H1的馬鈴薯品種（種質(zhì)資源），本研究篩選到的含有抗性基因H1的馬鈴薯品種結(jié)果與其一致。李艷等［27］通過溫室和田間試驗(yàn)，采用根球計(jì)數(shù)法、平均增殖率法和相對(duì)敏感性評(píng)價(jià)法及酸性品紅染色計(jì)數(shù)法，綜合評(píng)價(jià)馬鈴薯品種對(duì)金線蟲的抗性，評(píng)價(jià)出抗性表現(xiàn)穩(wěn)定的馬鈴薯品種‘宣薯5號(hào)’和‘云薯505’，本研究也得到類似結(jié)果。上述結(jié)果表明，僅僅依靠抗性基因分子標(biāo)記來判定馬鈴薯品種對(duì)金線蟲的抗性，存在一定局限，結(jié)合接種金線蟲的抗性鑒定試驗(yàn)結(jié)果，有利于獲得更為真實(shí)的抗性信息。

本研究測定攜帶H1基因的馬鈴薯品種的H1基因相對(duì)表達(dá)量，分析抗性基因H1相對(duì)表達(dá)量與對(duì)金線蟲抗性的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)‘V7’‘黃金薯’‘會(huì)薯19號(hào)’‘宣薯5號(hào)’‘云薯202’‘云薯304’‘云薯505’7個(gè)品種在接種了金線蟲后較未接種H1基因上調(diào)表達(dá)，對(duì)馬鈴薯金線蟲表現(xiàn)出抗性，而‘P14187’‘會(huì)薯15號(hào)’‘希森3號(hào)’3個(gè)品種在接種了金線蟲后較未接種H1基因下調(diào)表達(dá)，對(duì)馬鈴薯金線蟲易感;馬鈴薯品種對(duì)金線蟲的抗性與抗性基因H1相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性顯著，呈正相關(guān)。王賢等［28］研究表明抗病基因表達(dá)量越高的番茄品種，抗病能力也越強(qiáng)，并表現(xiàn)出正相關(guān)性，陳斌等［29］通過比較不同玉米品種接種紋枯病菌前后抗病相關(guān)基因表達(dá)量的變化，來鑒定抗病性，結(jié)果表明，抗病基因ZmPR1a的表達(dá)量變化與田間抗性結(jié)果相關(guān)，抗病品種的ZmPR1a基因相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照，而感病品種的ZmPR1a基因相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照，本研究所得結(jié)果與其相似。這表明，攜帶抗性基因的品種其抗性是否表現(xiàn)，與受到病原物侵害時(shí)抗性基因的表達(dá)量密切相關(guān)，相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照可能就表現(xiàn)抗性，相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照則表現(xiàn)為易感，抗性基因相對(duì)表達(dá)量與品種的實(shí)際抗性表現(xiàn)呈正相關(guān)。

本研究將人工接種馬鈴薯金線蟲進(jìn)行抗性鑒定與分子標(biāo)記以及抗性基因的表達(dá)水平相結(jié)合，并分析馬鈴薯品種對(duì)金線蟲抗性與抗性基因H1的相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性，是一個(gè)新的抗性評(píng)價(jià)思路，下一步將擴(kuò)大供試品種的數(shù)量、構(gòu)建完善的評(píng)價(jià)體系。本研究結(jié)果對(duì)抗金線蟲馬鈴薯品種選育、深入揭示馬鈴薯抗金線蟲的分子機(jī)制、利用抗病品種防治馬鈴薯金線蟲病有一定指導(dǎo)作用。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）