摘要

為明確海南省哈密瓜根結(jié)線蟲病的發(fā)生情況及病原種類，2023年4月在海南哈密瓜主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行隨機(jī)調(diào)查采樣，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原線蟲種類進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，哈密瓜根結(jié)線蟲病在海南4個(gè)市縣的11個(gè)調(diào)查點(diǎn)均有發(fā)生，其中東方好瑞村41采樣點(diǎn)植株發(fā)病最嚴(yán)重，根結(jié)等級(jí)為5級(jí)。通過2齡幼蟲形態(tài)測(cè)量和雌蟲會(huì)陰花紋形態(tài)比對(duì)，結(jié)合線蟲28S"rDNA"D2D3區(qū)段序列和SCAR特異性引物鑒定，最終鑒定出南方根結(jié)線蟲Meloidogyne"incognita、花生根結(jié)線蟲M.arenaria和象耳豆根結(jié)線蟲M.enterolobii，其中南方根結(jié)線蟲在8個(gè)調(diào)查點(diǎn)有檢出，個(gè)別點(diǎn)位出現(xiàn)南方根結(jié)線蟲混合象耳豆根結(jié)線蟲或花生根結(jié)線蟲的情況。南方根結(jié)線蟲為海南省哈密瓜上的主要病原線蟲種類。

關(guān)鍵詞

哈密瓜;"根結(jié)線蟲;"種群鑒定;"海南省

中圖分類號(hào)：

S"432.45

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023605

Species"identification"of"rootknot"nematodes"infecting"Cucumis"melo"var."saccharinus"in"Hainan"province

WANG"Mengping1，2，"ZHAO"Jing1，2*，"XU"Huanru1，2，"DING"Xiaofan1，"LIU"Tong1，2

（1."Key"Laboratory"of"Green"Prevention"and"Control"ofnbsp;Tropical"Diseases"and"Pests，"Ministry"of"Education，"

School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou"570228，"China;"2."Sanya"Institute"

of"Breeding"and"Multiplication，"Hainan"University，"Sanya"572025，"China）

Abstract

In"order"to"explore"the"occurrence"of"the"rootknot"nematode"disease"of"Cucumis"melo"var."saccharinus"and"understand"the"species"of"nematode"in"Hainan"province，"the"disease"occurrence"was"investigated"and"the"pathogens"from"samples"randomly"collected"from"the"main"producing"area"in"Hainan"in"April，"2023"were"identified"using"morphology"and"molecular"biology"methods."The"results"showed"that"the"rootknot"nematode"disease"occurred"in"all"the"11"investigated"places，"and"nematode"disease"was"most"severe"at"sampling"point"41"in"Haorui"village，"Dongfang"city，"with"rootknot"grade"of"five."Meloidogyne"incognita，"M.arenaria"and"M.enterolobii"were"identified"based"on"morphological"characteristics"of"secondstage"juveniles"and"female"perineal"pattern"in"combination"with"28S"rDNA"D2D3"and"SCAR"sequences."M.incognita"was"the"most"widespread"and"was"detected"at"eight"sampling"sites."Mixed"populations"of"M.incognita"and"M.enterolobii"or"M.incognita"and"M.arenaria"were"happened."The"above"results"indicate"that"M.incognita"is"the"dominant"population"of"rootknot"nematode，"which"will"provide"a"theoretical"basis"for"the"effective"control"of"rootknot"nematodes"on"Cucumis"melo"var."saccharinus"in"Hainan"province.

Key"words

Cucumis"melo"var."saccharinus;"rootknot"nematode;"species"identification;"Hainan"province

哈密瓜Cucumis"melo"var."saccharinus（Hami"cantaloupe）是甜瓜的一個(gè)變種，素有“瓜中之王”的美譽(yù)。海南光熱資源豐富，冬春季節(jié)尤為適宜哈密瓜的種植，哈密瓜也成為反季瓜菜中重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。據(jù)海南省農(nóng)業(yè)廳統(tǒng)計(jì)，2017年-2018年海南哈密瓜種植面積達(dá)10"005"hm2，產(chǎn)量不斷增長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)效益日益增加，已經(jīng)成為增加農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入的重要來源［1］。

在所有植物寄生線蟲中，根結(jié)線蟲Meloidogyne"spp.是對(duì)作物造成經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的一類［2］。首先，它的寄主范圍非常廣，可侵染蔬菜、糧食作物、果樹和經(jīng)濟(jì)作物等3"000多種植物，每年在全球范圍內(nèi)造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億美元［3］。其次，根結(jié)線蟲病原種類豐富，目前已報(bào)道的有100余種，其中南方根結(jié)線蟲M.incognita、爪哇根結(jié)線蟲M.javanica、花生根結(jié)線蟲M.arenaria和北方根結(jié)線蟲M.hapla是最重要的4種根結(jié)線蟲，發(fā)生范圍最為廣泛，對(duì)經(jīng)濟(jì)的影響也最大［4］。北方根結(jié)線蟲主要分布在寒溫帶地區(qū)，在我國北方地區(qū)有報(bào)道發(fā)生［56］。近年來，象耳豆根結(jié)線蟲M.enterolobii病害的發(fā)生逐年攀升，已經(jīng)逐漸成為海南省、廣東省、福建省等華南地區(qū)根結(jié)線蟲的主要類群。2015年龍海波等［7］對(duì)海南省18個(gè)市縣的根結(jié)線蟲進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲已經(jīng)在海南省的蔬菜、番石榴、哈密瓜和棗樹等作物上廣泛發(fā)生。陸秀紅等［6］在廣西賀州的梔子上也分離獲得象耳豆根結(jié)線蟲，楊芳等［8］從遼寧、吉林、黑龍江和寧夏的水稻樣本中均分離獲得象耳豆根結(jié)線蟲，說明象耳豆根結(jié)線蟲的發(fā)生正在北移，發(fā)病面積也在逐漸擴(kuò)大。

海南省哈密瓜每年種植三造，長(zhǎng)期大面積連作導(dǎo)致病蟲害發(fā)生嚴(yán)重，其中根結(jié)線蟲的危害較為突出。沿海地區(qū)的土壤松軟透氣，結(jié)合海南省潮濕溫暖的氣候條件使線蟲的發(fā)生呈現(xiàn)逐年加重的局面。目前還沒有海南省哈密瓜根結(jié)線蟲種群鑒定的相關(guān)研究，因此本研究對(duì)海南省部分哈密瓜種植區(qū)進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查和樣品采集，主要通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段對(duì)其種群進(jìn)行鑒定，以期為哈密瓜根結(jié)線蟲的高效防控提供理論依據(jù)，為哈密瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展保駕護(hù)航。

1"材料與方法

1.1"哈密瓜根結(jié)線蟲病調(diào)查

2023年4月對(duì)海南省東方市、昌江黎族自治縣、樂東黎族自治縣和陵水黎族自治縣幾個(gè)哈密瓜主要種植區(qū)的11個(gè)種植大棚進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查，每個(gè)點(diǎn)調(diào)查10株，觀察植株地上部癥狀，挖開表層土觀察根部是否有根結(jié)，將有發(fā)病癥狀的植株根系拔出，查看根系發(fā)病情況，根據(jù)劉順曉［9］對(duì)根結(jié)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，0級(jí)：所有須根無根結(jié);1級(jí)：少數(shù)須根有根結(jié)，根結(jié)百分率小于11%;2級(jí)：少數(shù)根結(jié)相互連接，根結(jié)百分率11%～30%;3級(jí)：須根有較多根結(jié)，1/2以下根結(jié)相互連接，根結(jié)百分率31%～50%;4級(jí)：1/2以上根結(jié)相互連接，根結(jié)百分率51%～75%;5級(jí)：根結(jié)互相連接成須根團(tuán)，根結(jié)百分率76%～100%。

1.2"樣品采集

挖取發(fā)病植株根部裝入自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用，共帶回樣本45份。

1.3"形態(tài)學(xué)鑒定

挑取根上卵囊置于盛有無菌蒸餾水的培養(yǎng)皿中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化2～3"d，獲得大量2齡幼蟲。每個(gè)采樣點(diǎn)挑取2齡幼蟲20條，置于盛有蒸餾水的載玻片上，用酒精燈外焰加熱，每2～3"s觀察蟲體是否死亡，對(duì)死亡的線蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，分別測(cè)量體長(zhǎng)、口針長(zhǎng)度、尾長(zhǎng)等形態(tài)參數(shù)并拍照。用鑷子從根系中分離成熟雌蟲放置于清水中，會(huì)陰花紋制作參照張紹升［10］的方法進(jìn)行，之后置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.4"分子生物學(xué)鑒定

1.4.1"線蟲DNA提取

每個(gè)采樣點(diǎn)選取10條2齡幼蟲進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。參照萬新龍等［11］的方法略作修改，挑取新孵化的單條2齡幼蟲至無菌水中清洗2～3次。離心沉淀后置于液氮中速凍30"s，立刻轉(zhuǎn)入37℃水浴加熱30"s，整套操作重復(fù)3次。繼續(xù)加入8"μL"10×PCR"buffer（TaKaRa，Mg2+"free）和2"μL"蛋白酶K"（20"mg/mL），輕彈混勻后在PCR儀中65℃溫育90"min，95℃保溫10"min，得到DNA粗提液用于PCR擴(kuò)增或置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2"目的片段PCR擴(kuò)增

先用28S"rDNA"D2D3區(qū)段通用引物D2A：5′ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG3′;D3B：5′TCGGAAGGAACCAGCTAC3′（退火溫度55℃）［12］擴(kuò)增。之后再利用根結(jié)線蟲特征序列擴(kuò)增區(qū)域（SCAR）標(biāo)記進(jìn)行鑒定。南方根結(jié)線蟲MiF：5′GTGAGGATTCAGCTCCCCAG3′和MiR：5′ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC3′（退火溫度62℃）［13］;象耳豆根結(jié)線蟲MK7F：5′GATCAGAGGCGGGCG

CATTGCGA3′和MK7R：5′CGAACTCGCTCG

AACTCGAC3′（退火溫度62℃）［14］;花生根結(jié)線蟲Far：5′TCGGCGATAGAGGTAAATGAC3′和Rar：5′TCGGCGATAGACACTACAACT3′（退火溫度52℃）［15］;以及爪哇根結(jié)線蟲Fjav：5′GGTGCGCG

ATTGAACTGAGC3′和Rjav：5′CAGGCCCTTC

AGTGGAACTATAC3′（退火溫度60℃）［15］。反應(yīng)體系：線蟲基因組DNA模板2"μL，上、下游引物（10"μmol/L）各1"μL，2×Taq"Master"Mix"12.5"μL，雙蒸水8.5"μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4"min;95℃變性30"s，退火溫度退火30"s，72℃延伸30"s，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5"min。以無菌水替換DNA的模板為陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)之后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，所獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中根結(jié)線蟲的序列進(jìn)行比對(duì)。

2"結(jié)果與分析

2.1"哈密瓜根結(jié)線蟲病發(fā)生情況

哈密瓜被根結(jié)線蟲侵染后，地上部分表現(xiàn)為明顯的黃化、萎蔫，類似肥水不足，發(fā)病嚴(yán)重的甚至整株枯死（圖1a，b）。受害根系生長(zhǎng)受抑制，根部有明顯結(jié)節(jié)（圖1c，d），根結(jié)形狀大小不一，嚴(yán)重的形成念珠狀，整個(gè)根系腫大（圖1c），后期變?yōu)楹稚?，?yán)重時(shí)出現(xiàn)腐爛。從棚中找到地上部具有明顯黃化、萎蔫癥狀的植株，再拔出根系檢查根結(jié)等級(jí)，其中東方板橋鎮(zhèn)好瑞村的24號(hào)調(diào)查地發(fā)病最為嚴(yán)重，根結(jié)等級(jí)最高為5級(jí)，其次為東方板橋鎮(zhèn)好瑞村的23號(hào)調(diào)查地，根結(jié)等級(jí)最高為4級(jí)（表1）。

2.2"線蟲的形態(tài)學(xué)特征

對(duì)各取樣點(diǎn)孵化的2齡幼蟲和雌蟲會(huì)陰花紋進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。來自東方21和22的2齡幼蟲為蠕蟲形，頭冠較平，口針基球圓形、縊縮，口針中等寬（圖2a）。體長(zhǎng)（396.06±5.81）"μm（331.26～438.26"μm），口針長(zhǎng)（11.11±0.28）"μm（8.71～14.46"μm），尾長(zhǎng)（50.42±1.31）"μm（41.49～60.41"μm）。會(huì)陰花紋背弓較高，線紋清楚，由粗到細(xì)，與南方根結(jié)線蟲會(huì)陰花紋相似（圖2d）。從昌江海尾鎮(zhèn)五大村采樣點(diǎn)12分離得到的2齡幼蟲頭冠明顯，前端平，口針基球圓形、縊縮，口針纖細(xì)（圖2b）。體長(zhǎng)（404.89±4.34）"μm（356.61～426.14"μm），口針長(zhǎng)（11.35±0.27）"μm（9.23～13.47"μm），尾長(zhǎng)（53.33±1.01）"μm（47.83～62.00"μm）。會(huì)陰花紋橢圓形，背弓較高，線紋緊密，為細(xì)密的波浪形，未見側(cè)線，與象耳豆根結(jié)線蟲較為相似（圖2e）。來自陵水42和44采樣點(diǎn)的2齡幼蟲蠕蟲形，頭冠平，體長(zhǎng)明顯大于南方根結(jié)線蟲，口針錐部和桿部較寬（圖2c）。體長(zhǎng)（418.30±4.64）"μm（378.38～476.01"μm），口針長(zhǎng)（11.3±0.26）"μm（9.54～14.13"μm），尾長(zhǎng)（55.29±1.24）"μm（45.99～66.44"μm）。會(huì)陰花紋背弓中等高度，無側(cè)線，有短、不規(guī)則線紋構(gòu)成的刻痕，無明顯紋渦，與花生根結(jié)線蟲形態(tài)特征相似（圖2f）。

2.3"分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

通過提取單條2齡幼蟲DNA，采用通用引物及特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，從所采樣品中鑒定得到南方根結(jié)線蟲、象耳豆根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲3種根結(jié)線蟲。經(jīng)過通用引物D2A/D3B擴(kuò)增出長(zhǎng)度為762"bp的單一條帶后再進(jìn)行特異性引物擴(kuò)增。用南方根結(jié)線蟲特異引物擴(kuò)增，從昌江11，東方21、22、23、24，樂東31，陵水41、43中擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為950"bp的單一條帶（圖3a）;用花生根結(jié)線蟲特異性引物從昌江11，陵水42、44擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為420"bp的單一條帶（圖3a）;用象耳豆根結(jié)線蟲的特異性引物擴(kuò)增，從昌江12，東方23、24中擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為520"bp的單一條帶（圖3b）。用爪哇根結(jié)線蟲特異性引物擴(kuò)增，所有種群均無條帶出現(xiàn)。結(jié)果表明，東方21、22、樂東31、陵水41和43為南方根結(jié)線蟲;昌江12為象耳豆根結(jié)線蟲;陵水42和44為花生根結(jié)線蟲;昌江11為南方根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲混合種群;東方23和24為南方根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲混合種群（表1）。共檢測(cè)線蟲樣本110份，其中南方根結(jié)線蟲的檢出率為59.1%，花生根結(jié)線蟲檢出率為20.9%，象耳豆根結(jié)線蟲檢出率為20.0%。

3"結(jié)論與討論

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法對(duì)海南省4個(gè)市縣11個(gè)采樣點(diǎn)的哈密瓜根結(jié)線蟲進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)南方根結(jié)線蟲檢出的頻率最高，為哈密瓜上主要種群。此外還檢測(cè)出象耳豆根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲，尚未檢測(cè)出爪哇根結(jié)線蟲。

海南省適宜的氣候條件和特殊的栽培制度造成根結(jié)線蟲病害的發(fā)生越來越嚴(yán)重。2012年賈本凱等［16］對(duì)海南島茄果類根結(jié)線蟲種群進(jìn)行鑒定，從茄子、辣椒、番茄等茄果檢測(cè)到南方根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲的頻率相當(dāng)。2020年李周容等［4］對(duì)海南省蔬菜根結(jié)線蟲種群分布進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)18個(gè)市縣的蔬菜種植區(qū)都有根結(jié)線蟲的發(fā)生，其中檢測(cè)頻率最高的為象耳豆根結(jié)線蟲，其次為南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲。這些研究說明象耳豆根結(jié)線蟲的種群數(shù)量正在慢慢增加，將逐漸代替南方根結(jié)線蟲成為海南主要根結(jié)線蟲類群。在哈密瓜和甜瓜上也都曾經(jīng)檢測(cè)到象耳豆根結(jié)線蟲［7，"17］，為了明確目前哈密瓜根結(jié)線蟲的主要類群，我們對(duì)海南省4個(gè)市縣11個(gè)哈密瓜瓜棚中根結(jié)線蟲進(jìn)行鑒定，結(jié)合雌蟲會(huì)陰花紋特征和特異性引物擴(kuò)增情況，最終檢測(cè)出南方根結(jié)線蟲、象耳豆根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲，其中南方根結(jié)線蟲占據(jù)主要類群。與南方根結(jié)線蟲相比，象耳豆根結(jié)線蟲可以突破植株的抗病性，所以風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)更高［18］，針對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲侵染面積逐漸擴(kuò)大的問題需要引起更多的關(guān)注。

哈密瓜是海南省重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，產(chǎn)值較高，甜瓜根系較發(fā)達(dá)，主根與大量側(cè)根向土壤周圍蔓延，但根系的再生能力較差，因此一旦根系受損會(huì)顯著影響植株的生長(zhǎng)甚至死亡，根結(jié)線蟲主要危害植株根部，造成地上部分生長(zhǎng)緩慢，果實(shí)小質(zhì)量差，對(duì)經(jīng)濟(jì)收入的影響較大。在線蟲的防治方面，針對(duì)南方根結(jié)線蟲的研究較為深入，對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲的研究相對(duì)較少。目前，化學(xué)防治依然是田間生產(chǎn)中最為普遍的防治手段，使用較多的藥劑為氟吡菌酰胺、阿維菌素和噻唑膦等。張伯虎等［19］對(duì)西瓜上的南方根結(jié)線蟲進(jìn)行殺線蟲藥劑篩選，發(fā)現(xiàn)阿維菌素b2的防效優(yōu)于噻唑膦。楊雪婷等［20］測(cè)定了3種常用藥劑對(duì)海南省象耳豆根結(jié)線蟲2齡幼蟲和卵的抑殺活性，結(jié)果表明，3%阿維菌素微乳劑對(duì)2齡幼蟲觸殺作用最強(qiáng)，對(duì)卵孵化的抑制率也最高;其次為41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑以及20%噻唑膦水乳劑。李周容等［17］發(fā)現(xiàn)對(duì)海南省香瓜上的象耳豆根結(jié)線蟲觸殺活性最高的是95%阿維菌素原藥，而95%氟吡菌酰胺原藥活性最低。黃垂雄［21］的藥劑篩選結(jié)果表明，20%噻唑膦水乳劑和10%阿維菌素懸浮劑對(duì)海南省哈密瓜根結(jié)線蟲的防效最高，其次為41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑。無論針對(duì)南方根結(jié)線蟲還是象耳豆根結(jié)線蟲，阿維菌素的防效在化學(xué)藥劑中均位居前列，說明海南省根結(jié)線蟲對(duì)阿維菌素較為敏感，尚未產(chǎn)生抗藥性，因此防治甜瓜根結(jié)線蟲病害可選用阿維菌素。

瓜農(nóng)通常在播種前對(duì)土壤進(jìn)行藥劑處理，在種植過程中一旦發(fā)現(xiàn)有根結(jié)出現(xiàn)就會(huì)立刻混合施用多種藥劑［22］，由于部分瓜農(nóng)對(duì)線蟲相關(guān)知識(shí)了解匱乏，認(rèn)為只要根上有根結(jié)就是線蟲沒有防治成功，會(huì)選擇繼續(xù)加大藥量。因此，化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期、不合理使用造成環(huán)境污染嚴(yán)重，果實(shí)藥劑殘留問題增加，土壤環(huán)境健康受損，線蟲抗藥性增強(qiáng)，防治越發(fā)困難。將生防菌劑和化學(xué)藥劑復(fù)合使用，可以在保證防效的前提下減少化學(xué)藥劑的使用。黑雅婭等［23］將婁徹氏鏈霉菌Streptomyces"rochei"ZZ9發(fā)酵液與阿維菌素復(fù)配，當(dāng)二者體積比為3∶1時(shí)對(duì)南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲殺線蟲活性最佳，將阿維菌素藥量減少75%，且活性與單一使用阿維菌素相比提高了23.84%。將3%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）微乳劑與線蟲寄生真菌淡紫紫孢菌Purpureocillium"lilacinum（PLHN）復(fù)配使用，其中0.6"mg/L甲維鹽（減量25%）+50%PLHN復(fù)配組合對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲盆栽防效最佳，防治效果與全量甲維鹽相當(dāng)，還能促進(jìn)番茄植株的生長(zhǎng)［24］。因此未來可繼續(xù)篩選與阿維菌素具有良好復(fù)配效果的生防菌劑，從而達(dá)到減藥不減效的良好效果。

因此，針對(duì)海南省哈密瓜根結(jié)線蟲發(fā)生嚴(yán)重的問題，除了繼續(xù)挖掘高效、環(huán)保的生防藥劑與阿維菌素進(jìn)行復(fù)合混配之外，還需要對(duì)瓜農(nóng)進(jìn)行農(nóng)技培訓(xùn)，規(guī)范藥劑使用，在減少化學(xué)農(nóng)藥使用的同時(shí)還可以減輕病害發(fā)生。

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