摘要

本試驗(yàn)在8種培養(yǎng)基上培養(yǎng)灰葡萄孢Botrytis"cinerea，以灰葡萄孢喂飼松材線蟲Bursaphelenchus"xylophilus，采用3年生黑松Pinus"thunbergii作為接種材料，研究松材線蟲繁殖力和致病力的變化，同時探究了在PDA灰葡萄孢上繼代培養(yǎng)84代的松材線蟲致病力的變化。結(jié)果表明，以玉米、小麥和PDA"3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢喂飼松材線蟲，其繁殖力顯著高于CDA和4種合成培養(yǎng)基，其中PDA灰葡萄孢上的松材線蟲數(shù)量最多，比合成培養(yǎng)基C或D培養(yǎng)的灰葡萄孢上的線蟲數(shù)量提升了4894%;接種PDA灰葡萄孢組松材線蟲的黑松病情指數(shù)最高，較最低的合成培養(yǎng)基D灰葡萄孢組高了4787%。松材線蟲在PDA灰葡萄孢上繼代培養(yǎng)至第14代后，繼代次數(shù)的增加會導(dǎo)致其致病力下降，接種第79代松材線蟲后黑松病情指數(shù)已為0。因此，為保證松材線蟲的致病力不衰退，應(yīng)使用PDA灰葡萄孢培養(yǎng)基喂飼松材線蟲，且松材線蟲繼代培養(yǎng)應(yīng)控制在14代以內(nèi)。研究結(jié)果將為松材線蟲的繁殖技術(shù)與致病相關(guān)機(jī)理分析等提供參考。

關(guān)鍵詞

松材線蟲;"繁殖力;"致病力;"培養(yǎng)基;"繼代培養(yǎng)

中圖分類號：

S"7637

文獻(xiàn)標(biāo)識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2024121

Influence"of"Botrytis"cinerea"culture"mediums"and"subculturing"on"the"virulence"of"Bursaphelenchus"xylophilus

WANG"Daohan1，"QU"Hongye1，"MI"Renjun2，"TAN"Jiajin1*

（1."CoInnovation"Center"for"Sustainable"Forestry"in"Southern"China，College"of"Forestry"and"Grassland，"Nanjing"Forestry"

University，"Nanjing"210037，China;"2."Forestry"Bureau"of"Chenxi"County，"Hunan"Province，"Huaihua"419599，"China）

Abstract

In"this"study，"changes"in"the"fecundity"and"virulence"of"Bursaphelenchus"xylophilus"fed"on"Botrytis"cinerea"growing"on"eight"different"mediums"and"changes"in"the"virulence"of"B.xylophilus"subcultured"on"PDA"for"84"generations"were"examined，"using"3yearold"Pinus"thunbergii"as"the"inoculum"material."The"results"showed"that"the"fecundity"of"B.xylophilus"fed"on"B.cinerea"growing"on"three"mediums，"namely"corn，"wheat，"and"PDA，"was"significantly"higher"than"those"fed"on"B.cinerea"on"CDA"and"four"synthetic"mediums."The"population"size"of"B.xylophilus"was"highest"on"the"combination"of"PDA"and"B.cinerea，"4894%"higher"than"those"the"combination"of"synthetic"medium"C/D"and"B.cinerea."The"disease"index"of"P.thunbergii"inoculated"with"B.xylophilus"fed"on"B.cinerea"on"PDA"was"also"the"highest，"4787%"higher"than"inoculation"with"B.xylophilus"fed"on"B.cinerea"on"the"synthetic"medium"D."However，"after"14"generations"of"subculturing"B.xylophilus"fed"on"B.cinerea"on"PDA，"an"increase"in"successive"generations"led"to"a"decrease"in"virulence."By"the"79th"generation，"the"disease"index"of"P.thunbergii"inoculated"with"B.xylophilus"was"zero."Therefore，"to"maintain"virulence，"B.xylophilus"should"be"cultured"on"B.cinerea"growing"on"PDA"and"subcultured"for"no"more"than"14"generations."These"findings"provide"valuable"insights"into"the"reproduction"technology"and"pathogenic"mechanisms"of"B.xylophilus.

Key"words

Bursaphelenchus"xylophilus;"fecundity;"virulence;"culture"medium;"subculturing

松材線蟲病是由松材線蟲Bursaphelenchus"xylophilus引起的一種系統(tǒng)性侵染病害，主要危害松屬Pinus植物［1］。松材線蟲取食

導(dǎo)致松樹萎蔫枯死。松材線蟲病蔓延迅速，致死率高，感病松樹種類多，防治難度大，已成為我國最具危險性和毀滅性的植物檢疫性病害。松材線蟲病自1982年在南京市首次報道［2］后，40多年來在我國不斷發(fā)展，目前我國已是松材線蟲病發(fā)生最嚴(yán)重的國家，至2024年全國共有18個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）663個縣級行政區(qū)發(fā)生疫情［3］。在松材線蟲病研究過程中，以人工方法大量培養(yǎng)松材線蟲是十分必要的，目前實(shí)驗(yàn)室常用的方法是在真菌灰葡萄孢Botrytis"cinerea菌落上培養(yǎng)松材線蟲，國內(nèi)外對不同培養(yǎng)材料（培養(yǎng)基/木材）和真菌種類培養(yǎng)松材線蟲的研究已有不少報道［45］，但在培養(yǎng)過程中是否會因真菌培養(yǎng)基種類的不同而使線蟲繁殖力和致病力發(fā)生變化，這一問題并未有深入的研究。此外，在線蟲繼代培養(yǎng)方面，1983年日本學(xué)者提出，人工培養(yǎng)的松材線蟲在5年內(nèi)致病力不會喪失［6］。而高景斌等［7］于2006年指出多次繼代培養(yǎng)的松材線蟲較初代培養(yǎng)的繁殖能力顯著下降，且生命活力更差，繼代培養(yǎng)15代后松材線蟲的致病力會急劇下降。線蟲的繼代次數(shù)與其致病力變化的關(guān)系究竟如何，目前仍不清楚。由于松材線蟲的致病力是影響病害流行的重要因素，且致病力分化一直是松材線蟲病的研究熱點(diǎn)［810］。為明確人工培養(yǎng)松材線蟲過程中影響其致病力的因素，本研究測定不同培養(yǎng)基種類和繼代培養(yǎng)對松材線蟲致病力的影響，為松材線蟲病的病理研究提供參考。

1"材料與方法

1.1"供試材料

松苗為南京林業(yè)大學(xué)北大山苗圃內(nèi)3年生黑松Pinus"thunbergii。

松材線蟲Bursaphelenchus"xylophilus強(qiáng)毒力蟲株FD3，由南京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室提供，已經(jīng)過形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定。該蟲株分離自福建省東山縣西山巖2～（2）區(qū)小班一瀕死馬尾松Pinus"massoniana，為第0代松材線蟲。

灰葡萄孢Botrytis"cinerea由南京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室提供。供試培養(yǎng)基共8種，包括2種天然培養(yǎng)基（玉米和小麥培養(yǎng)基），2種半合成培養(yǎng)基（PDA和CDA培養(yǎng)基）和4種合成培養(yǎng)基（合成培養(yǎng)基A、B、C和"D）。培養(yǎng)基種類參考文獻(xiàn)［1113］，根據(jù)試驗(yàn)需求調(diào)整組分，配方見表1。

1.2"試驗(yàn)方法

1.2.1"灰葡萄孢的培養(yǎng)

所有培養(yǎng)基121℃高溫高壓滅菌20"min后，分裝到直徑90"mm，高16"mm的培養(yǎng)皿中，20"mL/皿。待培養(yǎng)基冷卻后，接種灰葡萄孢，25℃恒溫暗培養(yǎng)7"d，用于喂飼松材線蟲。

1.2.2"松材線蟲的培養(yǎng)

將表面消毒的松材線蟲FD3接種到長滿灰葡萄孢的培養(yǎng)基上，25℃恒溫暗培養(yǎng)5"d左右。繼代培養(yǎng)線蟲采用長滿灰葡萄孢的PDA培養(yǎng)基，25℃暗環(huán)境下繼代培養(yǎng)4～84代，每代培養(yǎng)5"d。接種前采用貝爾曼漏斗法［14］分離線蟲，用1%的硫酸鏈霉素表面消毒15"min，再用無菌水洗滌3次，最后用無菌水配制濃度為17"500條/mL的線蟲懸浮液［15］。

1.2.3"松材線蟲的繁殖力測定

在8種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢菌落上分別接入200條松材線蟲，每處理5個重復(fù)，25℃恒溫培養(yǎng)5"d后，貝爾曼漏斗法分離線蟲，制備為線蟲懸浮液，在顯微鏡下統(tǒng)計線蟲數(shù)量，按觀測線蟲液體積與懸浮液總體積比例計算線蟲總量。

1.2.4"松材線蟲對松樹苗的致病力測定

接種采用人工皮接法［16］。用滅菌解剖刀在松苗主莖中部偏下的主莖上由下往上割開樹皮，深及木質(zhì)部，但不超過莖直徑的1/3。掀開樹皮塞入大小合適的滅菌棉球，并用封口膜將樹皮和棉球包裹好，用移液槍注入線蟲懸浮液，每株加樣量為200"μL"（約3"500條），對照注入等量無菌水。各處理接種8株黑松苗，每周苗圃內(nèi)所有苗木統(tǒng)一澆水2次。

每天觀察松苗的發(fā)病情況并記錄，5"d統(tǒng)計1次發(fā)病級別，病株分級標(biāo)準(zhǔn)［17］如下：0級，正常;Ⅰ級，褪綠、部分針葉（1/4以下）變黃;Ⅱ級，1/4～3/4針葉變黃、1/4以下針葉變紅;Ⅲ級，3/4左右針葉變紅;Ⅳ級，針葉全部變紅、植株死亡。參考方中達(dá)［18］的方法，按下列公式計算病情指數(shù)，比較各處理病害嚴(yán)重程度。待松樹完全枯死后，將枝干劈至玉米粒大小，采用貝爾曼漏斗法分離線蟲并鑒定。

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×各級代表值）調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值×100。

1.3"數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用SPSS"24.0軟件通過單因素方差分析及LSD多重比較對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Graphpad"Prism"9.0作圖。

2"結(jié)果與分析

2.1"不同灰葡萄孢培養(yǎng)基對松材線蟲繁殖力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，玉米、小麥和PDA"3種培養(yǎng)基較CDA和4種合成培養(yǎng)基繁殖灰葡萄孢效果好，同時，松材線蟲在它們培養(yǎng)的灰葡萄孢菌落上繁殖力也較大（圖1）。培養(yǎng)5"d線蟲數(shù)量分別為4"200、4"000條和3"860條，顯著高于其他培養(yǎng)基，而CDA和4種合成培養(yǎng)基繁殖灰葡萄孢效果較差，松材線蟲在其上繁殖量較小，培養(yǎng)5"d后僅為2"820～3"240條。PDA灰葡萄孢上的線蟲數(shù)量最高，相較于線蟲數(shù)量最低的合成培養(yǎng)基C/D灰葡萄孢提高了48.94%。

2.2"不同灰葡萄孢培養(yǎng)基對松材線蟲致病力的影響

接種松材線蟲后15"d，用PDA灰葡萄孢培養(yǎng)的線蟲接種的黑松苗頂部梢頭開始萎蔫下垂，接種點(diǎn)附近針葉的基部變成褐色，而針葉其余部分正常（圖2a）。接種后25"d這種癥狀向遠(yuǎn)離接種點(diǎn)擴(kuò)展，針葉變色的長度逐漸增加（圖2b），接種后40"d大部分針葉失綠變成褐色，僅有少數(shù)針葉維持在淺綠色或黃色（圖2c）。接種后60"d所有的針葉全部失綠變成褐色，莖部干枯，全株枯萎死亡（圖2d）。在死亡的松苗中均分離到松材線蟲，而對照一直生長良好，沒有分離到松材線蟲。

培養(yǎng)基種類對松材線蟲致病力有明顯影響。松材線蟲取食PDA、玉米和小麥培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢其致病力大于取食CDA和4種合成培養(yǎng)基上的灰葡萄孢。表現(xiàn)為：接種后黑松的病情指數(shù)明顯偏高。接種線蟲后37"d，"PDA、玉米、小麥培養(yǎng)基處理組黑松的病情指數(shù)達(dá)64.25～69.50，而其他處理的黑松的病情指數(shù)僅為47.00～56.25（圖3）。PDA組的黑松病情指數(shù)最高，較最低的合成培養(yǎng)基D組高了47.87%。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，松材線蟲蟲株FD3的繁殖力與其致病力有關(guān)，繁殖力大，則致病力強(qiáng)。取食PDA、玉米和小麥培養(yǎng)基上的灰葡萄孢的線蟲其繁殖力較取食CDA和4種合成培養(yǎng)基上的灰葡萄孢高，致病力強(qiáng)，接種后黑松的病情指數(shù)高。

2.3"繼代次數(shù)對松材線蟲致病力的影響

繼代培養(yǎng)4代的松材線蟲接種后14"d，松苗開始出現(xiàn)癥狀，頂部梢頭略萎蔫下垂，失去光澤，接種點(diǎn)附近針葉的基部變成褐色，而針葉其余部分正常。隨后這種癥狀向遠(yuǎn)離接種點(diǎn)擴(kuò)展，針葉變色的長度逐漸增加，大部分針葉失綠變成褐色，褐變沿針葉基部向葉尖蔓延，"同時伴隨失水，僅有少數(shù)針葉維持在淺綠色或黃色。接種后55"d，針葉全部失綠變成褐色，莖部干枯，全株枯萎死亡。從死亡松苗中均分離到松材線蟲，而對照松苗一直生長良好，沒有分離到松材線蟲。

繼代次數(shù)增加會導(dǎo)致其致病力下降。繼代培養(yǎng)4、9、14代，線蟲致病力沒有變化，接種松苗后17"d，黑松的病情指數(shù)均達(dá)到了22;繼代培養(yǎng)19～39代，線蟲致病力開始下降，接種后黑松的病情指數(shù)為13～16;培養(yǎng)44～64代后，線蟲致病力再次衰退，接種后黑松的病情指數(shù)為4～7;而培養(yǎng)69～84代后，線蟲致病力已經(jīng)很微弱，接種后黑松的病情指數(shù)最低，僅為0～1（圖4）。

3"結(jié)論與討論

無菌松材線蟲接種松樹致使寄主萎蔫，確定了松材線蟲是松材線蟲病的病原［19］。該病原線蟲的致病力是影響松材線蟲病的關(guān)鍵因子，而松材線蟲致病力的分化受地理位置、寄主來源和種類、氣候和自身特性等多種因素的影響，因此，把握住病原致病力的分化對全面監(jiān)測松材線蟲病和控制其繼續(xù)擴(kuò)散蔓延具有重要的意義。室內(nèi)培養(yǎng)階段中灰葡萄孢培養(yǎng)基種類和繼代培養(yǎng)次數(shù)對松材線蟲致病力影響的相關(guān)研究較少，本研究針對以上2個影響因素，測定了松材線蟲FD3蟲株對3年生黑松的致病力變化。結(jié)果表明，在人工培養(yǎng)松材線蟲的過程中，線蟲取食玉米、小麥和PDA培養(yǎng)基上的灰葡萄孢后，其繁殖力和致病力顯著高于CDA和4種合成培養(yǎng)基，而在PDA灰葡萄孢上繼代培養(yǎng)大于14代，松材線蟲的致病力會下降。

培養(yǎng)灰葡萄孢的培養(yǎng)基種類影響松材線蟲的繁殖力，松材線蟲在取食PDA、玉米和小麥3種培養(yǎng)基繁殖的灰葡萄孢后，其繁殖力顯著高于CDA和4種合成培養(yǎng)基，其致病力也均高于后者。前人針對繁殖松材線蟲的灰葡萄孢培養(yǎng)基種類的研究較少，但早在1992年白興月等［20］便嘗試用三角瓶裝的玉米粒培養(yǎng)基取代PDA平板，這一培養(yǎng)方式使松材線蟲的繁殖量提高了20～30倍，且在4℃下，松材線蟲在玉米粒上可以存活10個月以上，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于其在PDA平板上的存活時間。王守先［13］在探究松材線蟲的人工培養(yǎng)方式時，發(fā)現(xiàn)玉米粒培養(yǎng)基雖得到的松材線蟲繁殖倍數(shù)遠(yuǎn)高于PDA平板培養(yǎng)基，但其分離出來的線蟲溶液較混濁，在反復(fù)清洗的過程中容易丟失線蟲，且操作繁瑣。本研究中的松材線蟲取食兩種天然培養(yǎng)基灰葡萄孢的繁殖力與PDA灰葡萄孢相當(dāng)，并未出現(xiàn)玉米?；移咸焰叩臉O高繁殖倍數(shù)，這可能是由于采用的培養(yǎng)基容器（平板/三角瓶）、培養(yǎng)基體積以及天然材料的預(yù)處理方式不同等原因造成的。

有關(guān)松材線蟲繁殖力與致病力之間的關(guān)系一直是研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)表明，松材線蟲取食PDA、玉米和小麥3種培養(yǎng)基繁殖的灰葡萄孢，其繁殖力和致病力均高于取食CDA和4種合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢的松材線蟲，且取食PDA灰葡萄孢的松材線蟲繁殖力和致病力均最高，因此松材線蟲蟲株FD3的繁殖力與其致病力存在正相關(guān)性，這與Kiyohara等［21］的結(jié)果相一致，該結(jié)果同樣與前人研究的主流結(jié)論相似［2223］，但這種正相關(guān)性在不同蟲株間表現(xiàn)是否穩(wěn)定還有待于進(jìn)一步研究。有研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲的大量繁殖及其在樹體內(nèi)的遷移與寄主早期癥狀的發(fā)展相一致，認(rèn)為松材線蟲的繁殖力是影響致病力和該病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因［24］。另有研究報道，致病力較弱的松材線蟲蟲株在黑松幼苗樹體內(nèi)的繁殖量顯著低于致病力較強(qiáng)的蟲株［25］，而強(qiáng)致病力蟲株較弱致病力蟲株擁有更短的代時、更高的繁殖力和更快的種群增長率［26］。朱麗華等［2728］發(fā)現(xiàn)松材線蟲不同致病力蟲株雜交的后代在馬尾松P.massoniana幼苗體內(nèi)的繁殖力與致病力之間存在一定程度的正相關(guān)，但不顯著，而在灰葡萄孢上的繁殖力與致病力相關(guān)性較弱。還有研究［29］對比了中美兩國不同株系松材線蟲繁殖力和致病力的差異，發(fā)現(xiàn)入侵中國的外來種繁殖力和致病力有明顯增強(qiáng)的現(xiàn)象，這與其sod3基因的異常存在一定聯(lián)系。但也有研究認(rèn)為松材線蟲的繁殖力與致病力之間并無關(guān)系，甚至認(rèn)為松材線蟲的致病力與繁殖力呈負(fù)相關(guān)［30］，松材線蟲在侵染松樹的過程中的強(qiáng)致病力以犧牲部分繁殖力為代價。

本研究中，通過對不同繼代次數(shù)松材線蟲蟲株FD3致病力的測定，發(fā)現(xiàn)松材線蟲繼代次數(shù)的增加會導(dǎo)致其致病力下降，至接種第79代線蟲的黑松病情指數(shù)已為0。目前已知繼代培養(yǎng)可能會引起微生物變異和生物學(xué)特性的改變，但有關(guān)病原微生物致病力變化的研究多是真菌類病原。白僵菌Beauveria"bassiana［31］"和金龜子綠僵菌Metarhizium"anisopliae［32］在繼代培養(yǎng)后都出現(xiàn)退化現(xiàn)象，其內(nèi)的破壞毒素含量明顯降低。玉米大斑病菌Setosphaeria"turcica繼代培養(yǎng)14～22代時，其產(chǎn)孢能力、生長速度、孢子大小、發(fā)病率和病斑面積均呈明顯退化現(xiàn)象［33］。鏈格孢Alternaria"alternata［34］在PDA"培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)5代后，也出現(xiàn)菌株退化現(xiàn)象，并且會影響菌株產(chǎn)生"AOH、AME、ALT"和"TeA"毒素的能力。但也有研究發(fā)現(xiàn)繼代次數(shù)和病原致病力之間并非簡單的正相關(guān)性，繼代培養(yǎng)30代的青枯雷爾氏菌Ralstonia"solanacearum致病力低于繼代培養(yǎng)0代的菌株，但繼代培養(yǎng)60代的菌株卻高于前兩者［35］。有關(guān)線蟲繼代培養(yǎng)的研究較為空缺，早期有學(xué)者提出連續(xù)5年以上通過取食灰葡萄孢繼代培養(yǎng)的松材線蟲種群，對松樹的致病力顯著降低［6］。高景斌等［7］也通過試驗(yàn)證實(shí)多次繼代培養(yǎng)的松材線蟲難以侵入松樹體內(nèi)，且在寄主體內(nèi)難以大量繁殖。本次試驗(yàn)中，松材線蟲蟲株FD3在繼代培養(yǎng)19代后致病力開始下降，這與高景斌等報道的松材線蟲繼代培養(yǎng)15代后致病力急劇下降的結(jié)果有些差異，可能是因?yàn)椴煌x株本身致病力大小不同所造成的，或者是在繼代培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)條件不同而引起的。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了繼代培養(yǎng)會導(dǎo)致松材線蟲致病力的下降。"目前，蟲株FD3出現(xiàn)該現(xiàn)象的具體影響因素仍不清楚，還需進(jìn)行遺傳方面的分析，"探究各代蟲株之間是否發(fā)生了關(guān)鍵致病基因及轉(zhuǎn)錄表達(dá)方面的改變。

綜上所述，在FD3蟲株實(shí)際應(yīng)用過程中，為保證蟲株的致病力不衰退，應(yīng)使用PDA灰葡萄孢培養(yǎng)基培養(yǎng)線蟲，且線蟲繼代次數(shù)應(yīng)盡量控制在14代以內(nèi)。本研究結(jié)果為松材線蟲的繁殖技術(shù)與致病機(jī)理分析等提供了參考。但目前對于各處理松材線蟲的繁殖力和致病力出現(xiàn)變化是否是因?yàn)樗刹木€蟲在取食不同培養(yǎng)基上的灰葡萄孢后或繼代培養(yǎng)不同代后，線蟲的壽命或發(fā)育過程產(chǎn)生了變化，還是存在其他影響因素尚未明確，因此，擬進(jìn)一步開展對于灰葡萄孢培養(yǎng)基種類和繼代培養(yǎng)次數(shù)在生理及分子層面對松材線蟲繁殖力和致病力影響的研究。

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