摘要

內(nèi)蒙古是我國重要的馬鈴薯種植區(qū)，明確馬鈴薯線蟲病的病原，對種植區(qū)內(nèi)的線蟲檢疫和防治具有重大意義。本研究從興和縣采集出現(xiàn)空心、干腐等癥狀的馬鈴薯，分離線蟲后進行形態(tài)學鑒定、分子生物學鑒定。結(jié)果表明，興和縣線蟲群體的形態(tài)特征與腐爛莖線蟲Ditylenchus"destructor相似，形態(tài)測量值雖存在差異但范圍值基本一致;其rDNAITS序列與腐爛莖線蟲序列相似性為100%;系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，供試群體與腐爛莖線蟲C型、D型群體聚為一支，其序列和腐爛莖線蟲C型的序列最大相似性達9987%，和D型序列的相似性為9926%。綜上，將興和縣線蟲群體鑒定為腐爛莖線蟲C型群體。致病性測定表明，分離線蟲接種馬鈴薯后引起的癥狀與自然發(fā)病癥狀一致。該研究結(jié)果為興和縣制定馬鈴薯腐爛莖線蟲防治策略提供了理論依據(jù)。

關鍵詞

馬鈴薯;"腐爛莖線蟲;"形態(tài)特征;"單倍型

中圖分類號：

S"43245

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2024157

Isolation"and"identification"of"Ditylenchus"destructor"from"Xinghe"county，"Inner"Mongolia

LI"Zhi1，2，"LI"Jingjing2，"XI"Xianmei3，"TIAN"Xiaowei1*，"LIU"Qian2*

（1."College"of"Horticulture"and"Landscape，"Tianjin"Agricultural"University，"Tianjin"300392，"China;"2."College"of"

Plant"Protection，"China"Agricultural"University，"Beijing"100193，"China;3."Plant"Protection"Institute，"

Inner"Mongolia"Academy"of"Agricultural"amp;"Animal"Husbandry"Sciences，"Hohhot"010018，"China）

Abstract

Inner"Mongolia"is"one"of"the"most"important"potato"planting"area"in"China."Identifying"the"pathogen"responsible"for"potato"nematode"diseases"is"crucial"for"quarantine"and"control"in"this"region."Potatoes"with"symptoms"of"hollow"and"dry"rot"from"Xinghe"county"were"collected，"the"nematodes"were"separated"from"these"potatoes，and"a"comprehensive"analysis，"including"morphological"identification，"molecular"biological"identification"were"performed."The"results"showed"that"the"nematodes"share"similar"morphological"characteristics"with"Ditylenchus"destructor."Although"there"were"some"differences"in"morphological"measurements，"the"range"values"were"generally"consistent."The"rDNAITS"sequences"of"these"nematodes"showed"100%"similarity"to"D.destructor."Phylogenetic"analysis"showed"that"the"tested"population"clustered"into"the"same"branch"with"the"Ctype"and"Dtype，"with"sequence"similarities"of"9987%"and"9926%，"respectively.

The"symptoms"caused"by"nematode"isolates"are"consistent"with"those"in"the"field."In"summary，"the"nematode"population"in"Xinghe"county"was"identified"as"the"Ctype"of"D."destructor."The"results"providing"a"theoretical"basis"for"developing"control"strategies"for"D.destructor"in"Xinghe"county.

Key"words

potato;"Ditylenchus"destructor;"morphological"character;"haplotype

馬鈴薯Solanum"tuberosum"L.，別名土豆、洋芋、山藥蛋，原產(chǎn)美洲，屬茄科Solanaceae一年生草本植物，塊莖可食用，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維，被譽為“地下蘋果”［1］。馬鈴薯因其適應性強，廣泛種植于世界各地，現(xiàn)階段已超過玉米，成為繼水稻、小麥后的世界第三大糧食作物，是全球數(shù)十億人的日常消費主食［2］。馬鈴薯是我國重要糧食作物，2022年全國馬鈴薯播種總面積為45348萬hm2，產(chǎn)量達1"78826萬t（數(shù)據(jù)未包括港澳臺地區(qū);國家統(tǒng)計局農(nóng)業(yè)統(tǒng)計標準：薯類糧食產(chǎn)量以鮮薯重量的20%折算為產(chǎn)量;下同。）［3］。我國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)可分為北方一作區(qū)、西南混作區(qū)、中原二作區(qū)和南方冬作區(qū)四大區(qū)域［4］。內(nèi)蒙古自治區(qū)是我國北方馬鈴薯重要產(chǎn)區(qū)。2022年，內(nèi)蒙古自治區(qū)的馬鈴薯播種面積為224"萬"hm2，全國各省市排名第八，馬鈴薯產(chǎn)量為110萬"t，全國第六［3］。

腐爛莖線蟲Ditylenchus"destructor"Thorne，1945，又名馬鈴薯腐爛莖線蟲、甘薯莖線蟲，隸屬側(cè)尾腺綱Secernentea、墊刃目Tylenchida、?？艫nguinidae、莖線蟲屬Ditylenchus［5］。腐爛莖線蟲是遷移性植物內(nèi)寄生線蟲，主要分布于溫帶地區(qū)，在為害植物地下部分的同時常會引起真菌、細菌的侵染，最終導致植物腐爛壞死［6］。該線蟲寄主范圍廣泛，可危害的植物超過120種，包括馬鈴薯、甘薯等糧食作物，當歸、黨參等中藥材，山藥、胡蘿卜、大蒜等蔬菜以及鳶尾、郁金香等花卉，其還能夠在40個屬超過70種真菌上繁殖。腐爛莖線蟲已被列為全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物之一［79］。自1937年我國發(fā)現(xiàn)腐爛莖線蟲危害甘薯以來，腐爛莖線蟲已遍布全國，作為其模式寄主的馬鈴薯深受其害［10］。腐爛莖線蟲為害馬鈴薯地下部分時，薯塊表皮首先出現(xiàn)白色斑點，隨后逐漸擴大發(fā)展為黑色或褐色，內(nèi)部組織呈現(xiàn)出干腐或濕腐癥狀;為害地上部分時會導致葉片皺縮、褪色，植株矮化、分枝增多和加粗;其能夠?qū)е埋R鈴薯減產(chǎn)20%～30%，嚴重時可達40%～50%，甚至絕收［11］。此外，腐爛莖線蟲也可在馬鈴薯貯藏期危害，潮濕環(huán)境下還會引起薯塊腐爛，造成經(jīng)濟損失［12］。

近年來，腐爛莖線蟲已在內(nèi)蒙古多地報道發(fā)生，隨著馬鈴薯種植面積的不斷增加，其危害風險也隨之增高，一旦在主產(chǎn)區(qū)發(fā)生蔓延和擴散，將對馬鈴薯產(chǎn)業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失［13］。本研究病樣采集自內(nèi)蒙古烏蘭察布市興和縣，烏蘭察布市有著“中國馬鈴薯之都”的美譽，其獨特的地理位置是馬鈴薯的種植黃金帶，每年馬鈴薯總產(chǎn)量占內(nèi)蒙古自治區(qū)的50%左右［14］。本研究擬對興和縣馬鈴薯線蟲群體采用形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定的方法，以明確其線蟲種類;并基于rDNAITS區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其群體差異;以期為該地區(qū)對腐爛莖線蟲的檢疫和防治提供一定理論基礎。

1"材料與方法

1.1"材料

供試線蟲分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市興和縣臺基廟村（113°44′E，"41°00′N）馬鈴薯病樣。

1.2"方法

1.2.1"線蟲分離

洗凈馬鈴薯病樣表面泥土，自然晾干后，對樣品整體和病部剖面進行拍照觀察。采用淺盤法分離線蟲［15］：在小盆中放入相應大小的塑料網(wǎng)篩，網(wǎng)篩里鋪上一層廚房用紙，再將切成小塊的馬鈴薯病樣放入網(wǎng)篩中，加入清水沒過馬鈴薯塊，靜置24"h。24"h后將浸泡液過80～500目不銹鋼網(wǎng)篩，最后收集500目網(wǎng)篩上的線蟲。

在顯微鏡（Olympus"SZ61，日本）下挑出疑似腐爛莖線蟲的線蟲，一部分接種于甜度更高的甘薯上進行線蟲擴繁，一部分提取DNA。

1.2.2"線蟲擴繁

采用薯塊打孔接種培養(yǎng)法擴繁線蟲，參照宮衛(wèi)波等［16］的方法略有改動：在顯微鏡下挑選出雌蟲、雄蟲各30條，線蟲先置于05%"NaClO溶液中消毒8"min，再用無菌水清洗3次，用于擴繁。將洗凈的薯塊用05%"NaClO溶液浸泡30"min，再用清水洗去NaClO，置于超凈臺中晾干。用打孔器在薯塊上打出2～3"cm的孔洞，把消毒好的線蟲放入孔中，再把打孔器打下來的薯條在末端切去一部分后放回孔中，最后用石蠟將薯條與薯塊連接處密封好，25℃培養(yǎng)30"d。30"d后，通過淺盤法收集線蟲。

1.2.3"形態(tài)學鑒定

采用熱殺死法制作線蟲臨時玻片［17］：挑取擴繁好的線蟲至載玻片水滴中，手持載玻片在酒精燈火焰上方加熱3～4"s，隨時觀察線蟲狀況，當線蟲蟲體突然伸直時停止加熱。利用顯微鏡（olympus"BX51，日本）觀察形態(tài)特征和測量特征值。采用de"Man公式，對線蟲體長（L）、最大體寬（W）、口針長（stylet）、尾長（tail）、體長與最大體寬之比（a）、體長與食道長之比（b）、體長與尾長之比（c）、頭至陰門的長度×100與體長之比（V）等數(shù)據(jù)進行分析，并參照已描述的腐爛莖線蟲形態(tài)特征進行種類鑒定。

1.2.4"分子生物學鑒定

參照王江嶺等［18］的方法略有改動，提取單條線蟲DNA。挑取單條線蟲放入含有8"μL"ddH2O的PCR管中，再加入1"μL"10×PCR"buffer（Mg2+free），混勻。PCR管置于液氮中1"min，再85℃水浴2"min，反復7～8次，使線蟲充分裂解;向PCR管中加入1"μL"1"mg/mL的蛋白酶K溶液，56℃水浴15"min，用于降解蛋白;再95℃水浴10"min，滅活蛋白酶K，最后將提取好的單條線蟲DNA放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用腐爛莖線蟲特異性引物D1（5′ACTGCTCTGCGTTTGGCTTCA3′）、D2（5′TGCATCACTCGCCGGCTCCTAGA3′）［19］和線蟲ITS區(qū)通用引物TW81（5′GTTTCCGTAGGTGAACCT

GC3′）、AB28（5′ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT

3′），對原始線蟲和擴繁線蟲的DNA進行PCR擴增。50"μL"PCR反應體系：25"μL"2×Super"Taq"PCR"StarMix（Dye），2"μL"DNA模板，上、下游引物各2"μL以及19"μL"ddH2O。PCR反應程序：95℃預變性2"min;95℃變性15"s，56℃退火15"s，72℃延伸15"s，30個循環(huán);72℃延伸5"min。取10"μL"PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察，剩余PCR產(chǎn)物進行雙向測序（北京擎科）。

將rDNAITS區(qū)序列的測序結(jié)果提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，根據(jù)比對結(jié)果下載相似性較高的序列，使用軟件MEGA"70，采用最大似然法（maximum"likelihood，"ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。各分支的置信度/自展支持率由1"000次自舉法（bootstrap）重復檢測。

1.2.5"致病性測定

在馬鈴薯上同樣采用薯塊打孔接種培養(yǎng)法進行致病性測定。馬鈴薯和線蟲的處理方法同上，每個馬鈴薯上接種1"000條培養(yǎng)好的線蟲，25℃培養(yǎng)。30"d后，觀察侵染情況，并重新分離和鑒定線蟲。

2"結(jié)果與分析

2.1"癥狀觀察

采集到的馬鈴薯病樣表皮龜裂，易剝落，裂口呈褐色;縱切薯塊，馬鈴薯皮下組織軟化，呈海綿狀，顏色呈褐色或黑色，空隙中有白色粉狀物（圖1a～c）。將線蟲接種至甘薯上30"d后，甘薯外表與健薯無異，但重量明顯減輕;切開后發(fā)現(xiàn)內(nèi)部出現(xiàn)空隙，組織發(fā)生褐白相間的干腐（圖1d～e）。馬鈴薯和甘薯

被興和縣線蟲群體侵染后均呈現(xiàn)出被腐爛莖線蟲危害的癥狀。

2.2"形態(tài)學鑒定

2.2.1"形態(tài)特征描述

線蟲熱殺死后，頭部或伸直或略向腹部彎曲，尾部略向腹部彎曲（圖2a～b）。唇區(qū)低平，略縊縮;口針明顯，口針基球可見;中食道球呈紡錘形;神經(jīng)環(huán)環(huán)繞在食道狹部，后部為膨大棒狀的食道腺;排泄孔在食道與腸交界處略前（圖2c、e）。雌蟲尾部陰門清晰，微突;后陰子宮囊向肛門延伸，長度是肛陰距的3/4;尾圓，呈錐形（圖2d）。雄蟲尾部交合刺基部膨大，向腹部彎曲;尾尖，呈錐形（圖2f）。卵呈橢圓形，長度約為寬度的2倍（圖2g）。

圖2"興和縣危害馬鈴薯的線蟲的形態(tài)特征

Fig.2"Morphological"characteristics"of"nematodes"affecting"potatoes"in"Xinghe"county

2.2.2"形態(tài)特征指標

測量雌、雄蟲各20條，根據(jù)de"Man公式進行測量計算，測量結(jié)果（表1）顯示，興和縣線蟲群體雌蟲和雄蟲的長度相當;雌蟲的最大體寬要大于雄蟲;雄蟲口針長度略長于雌蟲;雌蟲尾長略長于雄蟲。比對已報道的腐爛莖線蟲形態(tài)測量值［20］，興和縣線蟲群體雄蟲最大體寬和c值（體長/尾長）略大，其他各形態(tài)測量值與腐爛莖線蟲形態(tài)測量范圍值基本一致，故根據(jù)形態(tài)學特征初步將興和縣線蟲群體鑒定為腐爛莖線蟲。

2.3"分子生物學鑒定

2.3.1"PCR檢測結(jié)果

使用腐爛莖線蟲特異性引物D1/D2對興和縣原始線蟲群體和腐爛莖線蟲群體進行PCR檢測，結(jié)果（圖3）顯示，興和縣線蟲群體同腐爛莖線蟲群體一樣，都擴增出一條約346"bp大小的條帶。

使用線蟲ITS區(qū)通用引物TW81/AB28對興和縣原始線蟲群體和擴繁線蟲群體的rDNAITS進行PCR擴增，得到約800"bp的目的條帶（圖4）;PCR產(chǎn)物進行雙向測序后得到815"bp的具體序列，將其提交到GenBank，得到登錄號為PP860042;

使用DNAMAN軟件把興和縣原始線蟲群體和擴繁線蟲群體的rDNAITS序列進行比對，二者相似性為100%;同時將興和縣線蟲群體rDNAITS序列上傳到NCBI中比對，結(jié)果均與腐爛莖線蟲（登錄號為MH9923931、MG6739261、KY4356821）相似，相似性為100%（圖5）。

綜上，本研究分離到的興和縣線蟲群體為腐爛莖線蟲，且線蟲群體在甘薯上擴繁后并無變化。

2.3.2"rDNAITS區(qū)序列分析

基于興和縣線蟲群體rDNAITS序列，以起絨草莖線蟲Ditylenchus"dipsaci為外群，與21個寄生于馬鈴薯和甘薯的不同基因型腐爛莖線蟲群體構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）。結(jié)果顯示，興和縣線蟲群體和21個腐爛莖線蟲群體聚為一支，起絨草莖線蟲單獨一支;腐爛莖線蟲群體明顯分為A型和其他單倍型兩支;B型和G型親緣關系較近，C型和D型親緣關系較近，E型、F型、J型和L型親緣關系較近;其中，興和縣線蟲群體和C型群體聚為一支。

使用DNAMAN軟件把興和縣線蟲群體rDNAITS序列和親緣關系最近的腐爛莖線蟲群體KC923223、OK348887進行序列比對分析。興和縣線蟲群體的序列與KC923223的相似性達9987%，相比于KC923223，興和縣線蟲群體序列在606"bp處有1個堿基插入。興和縣線蟲群體的序列與OK348887的相似性達9926%，相比于OK348887，興和縣線蟲群體序列在81、124、163、229"bp和291"bp等處發(fā)生了單堿基突變以及在218"bp處有1個堿基的插入。此外，興和縣線蟲群體序列與D型群體EF208213的相似性為9669%，與E型群體HQ235695的相似性為8869%。據(jù)此，將興和縣線蟲群體鑒定為腐爛莖線蟲C型群體。

2.4"致病性測定

將培養(yǎng)獲得的線蟲接種到馬鈴薯上進行致病性分析。結(jié)果表明，接種30"d后，馬鈴薯與自然發(fā)病癥狀基本一致，表現(xiàn)為薯塊重量明顯減少;切開病薯后，內(nèi)部出現(xiàn)干腐，呈現(xiàn)褐色糠心狀;同時內(nèi)部也出現(xiàn)空隙，空隙中還存在白色粉狀物（圖7）。對接種的病薯進行線蟲分離，獲得了與接種線蟲一致的線蟲群體。

3"結(jié)論與討論

本研究從疑似受腐爛莖線蟲危害的馬鈴薯中分離出線蟲群體，通過形態(tài)學和分子生物學的方法，將其鑒定為腐爛莖線蟲C型群體。Li等［21］在內(nèi)蒙古43個地區(qū)分離到的腐爛莖線蟲中共檢測到A型、B型、C型和L型4種單倍型群體，其中C型是內(nèi)蒙古地區(qū)最常見的單倍型。2023年，在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)的《全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物分布行政區(qū)名錄》中，烏蘭察布市僅察哈爾右翼前旗有腐爛莖線蟲危害

報道［22］。本研究結(jié)果表明，腐爛莖線蟲已在興和縣定殖，研究結(jié)果為該地區(qū)制定馬鈴薯腐爛莖線蟲病的防治方案，降低腐爛莖線蟲對馬鈴薯產(chǎn)業(yè)造成的經(jīng)濟損失，提供一定的理論基礎。

形態(tài)學是最直觀、最常用的分類方法，但具體數(shù)據(jù)可能因其寄主或者齡期的不同存在差異。興和縣線蟲群體的形態(tài)特征與劉維志等［20］和徐鵬剛［23］的描述基本相符。經(jīng)de"Man公式對形態(tài)測量數(shù)據(jù)分析比較，發(fā)現(xiàn)該群體除體寬略大外，其他數(shù)據(jù)與陳品三等［24］的測量數(shù)據(jù)相似;體寬和尾長與劉維志等［20］的測量結(jié)果略有差異，其他各測量值基本一致，a值、c值和V值與張淑玲等［25］和郭全新等［26］的測量范圍值相似。

大量研究表明，腐爛莖線蟲存在明顯的種類分化現(xiàn)象：國內(nèi)學者［27］根據(jù)rDNAITS序列的片段大小，把腐爛莖線蟲群體分為A（S）型和B（L）型2個群體;Subbtin等［28］根據(jù)ITS1區(qū)在RNA二級結(jié)構(gòu)上的差異，將腐爛莖線蟲群體分為A～G"7個群體;Ni等［29］在當歸、黨參等中藥材寄主中分離出不同腐爛莖線蟲群體，發(fā)現(xiàn)其ITS1區(qū)的RNA二級結(jié)構(gòu)又存在7種新的類型。Li等［21］對采集自中國17個省份的腐爛莖線蟲ITS區(qū)進行序列分析，在已有的7個群體上新總結(jié)出H～P"9個新的群體，其中M～P"4個腐爛莖線蟲群體分離自當歸、黨參等中藥材。rDNAITS區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，興和縣線蟲群體為腐爛莖線蟲C型群體，但仍與已報道的基因序列存在個別堿基的差異，這可能也與寄主以及地理和生態(tài)因素有關。

馬鈴薯腐爛莖線蟲病是一種重要的土傳病害，種薯、種苗以及雜草均是其傳播的主要媒介，施肥、灌溉等農(nóng)事操作也能造成腐爛莖線蟲的傳播。烏蘭察布作為內(nèi)蒙古的重要馬鈴薯產(chǎn)區(qū)，種薯運輸和種苗調(diào)運頻繁，首先應當加強植物檢疫，切斷腐爛莖線蟲的遠距離傳播，嚴禁病薯、病苗進入無病區(qū)。清除雜草寄主，并輪作種植玉米、黑麥、水稻等非寄主植物，能夠有效降低土壤腐爛莖線蟲數(shù)量［3031］?；瘜W防治方面，45%三氟吡啶胺懸浮劑、5%噻唑膦水分散粒劑、417%氟吡菌酰胺懸浮劑等殺線蟲劑對腐爛莖線蟲均有較好的防治效果［3233］。王東等［34］根據(jù)馬鈴薯接種線蟲后的薯塊發(fā)病程度和線蟲繁殖量，在內(nèi)蒙古23個馬鈴薯主栽品種中篩選到‘隴薯3號’‘早大白’‘希森6號’對腐爛莖線蟲有著較高的抗性。馬鈴薯產(chǎn)業(yè)是烏蘭察布的重要產(chǎn)業(yè)，基于內(nèi)蒙古馬鈴薯腐爛莖線蟲病現(xiàn)狀，要堅持“預防為主，綜合防治”的原則，以植物檢疫為重點，將農(nóng)業(yè)防治、化學防治和生物防治有機地結(jié)合起來，在阻止腐爛莖線蟲傳播的同時科學有效地進行防治。

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（責任編輯：楊明麗）