摘要

孢囊線蟲為大豆根部重要病害之一，廣泛分布于我國大豆種植區(qū)，制約我國大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展。種植抗病品種為該病害最為經(jīng)濟(jì)有效且綠色環(huán)保的防治策略，然而目前商業(yè)化抗性資源較少。解析大豆抗孢囊線蟲的機(jī)制有利于大豆抗性基因資源挖掘和抗線蟲分子育種?；谏囼?yàn)和抗線蟲表型分析，本研究發(fā)現(xiàn)大豆R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB15在植物細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄水平受大豆孢囊線蟲侵染顯著誘導(dǎo)，GmMYB15與咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶CCoAOMT、肉桂酸羥化酶C4H和肉桂酰輔酶A還原酶CCR等蛋白互作，正調(diào)控大豆對大豆孢囊線蟲抗性。研究結(jié)果為后續(xù)深入研究GmMYB15調(diào)控大豆線蟲抗性機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

大豆;"孢囊線蟲;"抗病性;"GmMYB15

中圖分類號：

S"43245

文獻(xiàn)標(biāo)識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2024186

GmMYB15"positively"regulates"soybean"immunity"to"cyst"nematode

ZHU"Qun，"GUO"Xiaoli，"ZHANG"Lei*

（National"Key"Laboratory"of"Agricultural"Microbiology，"Huazhong"Agricultural"University，"Wuhan"430070，"China）

Abstract

The"soybean"cyst"nematode，"a"major"threat"to"soybean"roots，"is"widely"distributed"in"soybean"growing"areas"and"restricts"the"development"of"the"soybean"industry"in"China."Planting"diseaseresistant"varieties"is"the"most"economically"effective"and"environmentfriendly"control"strategy"for"this"disease."However，"there"are"currently"few"commercially"available"resistance"resources."Understanding"the"molecular"mechanism"of"soybean"resistant"to"cyst"nematode"is"essential"for"exploring"soybean"resistance"gene"resources"and"advancing"molecular"breeding"for"nematode"resistance."Based"on"biochemical"experiments"and"phenotypic"analysis，"we"found"that"the"R2R3MYB"transcription"factor"GmMYB15"is"expressed"in"both"the"cytoplasm"and"nucleus，"with"its"increased"transcription"level"under"cyst"nematode"infection."GmMYB15"interacts"with"various"proteins，"such"as"caffeoyl"coenzyme"A"Omethyltransferase"（CCoAOMT），"cinnamate4hydroxylase"（C4H），"and"cinnamoyl"coenzyme"A"reductase"（CCR），"and"plays"a"positive"role"in"soybean"nematode"resistance."Our"findings"lay"a"foundation"for"indepth"researches"on"the"function"of"GmMYB15"in"regulating"soybean"nematode"resistance.

Key"words

soybean;"cyst"nematode;"resistance;"GmMYB15

大豆Glycine"max"（L.）"Merr.是世界上重要的糧食和油料作物，其安全生產(chǎn)事關(guān)國家糧食安全。提高大豆單產(chǎn)水平和品質(zhì)是解決大豆危機(jī)的根本舉措。大豆孢囊線蟲Heterodera"glycines"Ichinohe（soybean"cyst"nematode，"SCN）廣泛存在于世界大豆主要生產(chǎn)國，例如美國、巴西、阿根廷、中國等，每年導(dǎo)致大豆產(chǎn)量損失5%～10%，嚴(yán)重時達(dá)30%。該線蟲在我國東北和黃淮海大豆主產(chǎn)區(qū)危害嚴(yán)重，是制約我國大豆產(chǎn)量和品質(zhì)提高的重要因素［12］。挖掘新的大豆抗線蟲基因資源，深入解析其抗病機(jī)制，對大豆抗性改良具有重要意義。

MYB轉(zhuǎn)錄因子（MYB"transcription"factor）是含有MYB結(jié)構(gòu)域的一類反式作用因子，其N端具有一段高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通常由1～4個氨基酸重復(fù)序列（R）構(gòu)成。依據(jù)R的數(shù)目和種類，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族被分為4類：4RMYB（由4個R1/R2重復(fù)組成）、3RMYB/R1R2R3MYB（由R1、R2、R3組成）、1RMYB/MYBrelated（含有單個重復(fù)或不完整的R）、R2R3MYB（由R2和R3組成），其中R2R3MYB為植物MYB轉(zhuǎn)錄因子中最大的亞家族，分布于各類植物，參與植物生長發(fā)育、代謝和脅迫應(yīng)答調(diào)控［36］。

R2R3MYB在植物響應(yīng)脅迫中發(fā)揮重要作用［711］。擬南芥S1亞家族的R2R3MYB主要參與調(diào)控干旱、高溫、鹽和過強(qiáng)光照的脅迫，S2亞家族的R2R3MYB可提高植物對干旱、損傷和低溫的抗性，而S11亞家族的R2R3MYB主要參與滲透和鹽脅迫調(diào)控［1214］。GmMYB29A2參與大豆抗毒素的生物合成，增強(qiáng)大豆對大豆疫霉的抗性［15］。OsJAMyb和OsMYB30正調(diào)控水稻對稻瘟菌Pyricularia"oryzae與褐飛虱Nilaparvata"lugens的抗性［1617］。GhMYB33結(jié)合GhSPL9和GhDFR1啟動子，負(fù)調(diào)控陸地棉對棉花黃萎病菌Verticillium"dahliae抗性［18］。于擬南芥中過表達(dá)AtMYB59和AtHRS1會抑制甜菜孢囊線蟲Heterodera"schachtii的發(fā)育，擾亂合胞體形成，增強(qiáng)擬南芥對甜菜孢囊線蟲的抗性［1920］。此外，在調(diào)控植物初生和次生代謝方面，R2R3MYB主要參與苯丙烷代謝途徑的次生代謝物的合成，調(diào)控原花青素、花青素、黃酮類、黃酮醇、異黃酮類、苯酚及木質(zhì)素等苯丙烷類化合物合成［2125］。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，大豆R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB15的轉(zhuǎn)錄水平受大豆孢囊線蟲侵染誘導(dǎo)，本研究基于生化試驗(yàn)和表型分析探究GmMYB15生物學(xué)功能，為后續(xù)深入研究GmMYB15調(diào)控大豆線蟲抗性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1"材料與方法

1.1"植物材料與線蟲

本研究以感病大豆品種‘Williams"82’（‘W82’），抗病大豆品種‘PI88788’‘PI548402’和大豆孢囊線蟲HG"type"0為研究材料。

1.2"主要培養(yǎng)基與溶液配方

萌發(fā)培養(yǎng)基（GM）："Gamborg’s"B5"31"g、蔗糖20"g、瓊脂7"g、1"000×Gamborg’s"B5"vitamin"1"mL、pH"58，ddH2O定容至1"000"mL。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基（CCM）："Gamborg’s"B5"031"g、蔗糖30"g、MES"（05"mol/L，"pH"56）"40"mL、1"000×Gamborg’s"B5"vitamin"1"mL、半胱氨酸04"g、硫代硫酸鈉0245"g、二硫蘇糖醇0154"2"g、乙酰丁香酮（溶解于DMSO）"004"g、瓊脂5"g、pH"54，ddH2O定容至1"000"mL。

毛根培養(yǎng)基（HRM）：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基433"g、蔗糖25"g、MES"（05"mol/L，pH"56）"6"mL、1"000×Gamborg’s"B5"vitamin"1"mL、瓊脂8"g、pH"56，ddH2O定容至1"000"mL。

YPDA培養(yǎng)基：蛋白胨200"g、酵母提取物100"g、葡萄糖200"g、腺嘌呤003"g、pH"58，ddH2O定容至1"000"mL，固體培養(yǎng)基加入20"g瓊脂。

SD培養(yǎng)基："YNB"（yeast"nitrogen"base"w/o"amino"acids"and"ammonium"sulfate）"17"g、硫酸銨50"g、葡萄糖200"g、pH"58，ddH2O定容至1"000"mL，固體培養(yǎng)基加入20"g瓊脂。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10"g、酵母提取物5"g、NaCl"10"g、pH"70，ddH2O定容至1"000"mL，固體培養(yǎng)基加入15"g瓊脂。

所用試劑包括：10×TE"Buffer、10"mmol/L"EDTA（pH"75）、10"mol/L"LiAc（10×，"pH"75）、50%"PEG4000、"GUS染色液（50"mmol/L磷酸氫鈉緩沖液pH"70、10"mmol/L"EDTA、01%"Triton"X100、2"mmol/L鐵氫化鉀、2"mmol/L亞鐵氫化鉀、20"mmol/L"XGluc，現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.3"載體構(gòu)建

利用特異性引物（表1）從大豆cDNA中擴(kuò)增獲得GmMYB15（Glyma10g165800）編碼區(qū)序列，通過T4"DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶Sal"I/Xbanbsp;I將其重組至過表達(dá)載體pSM1013HA，用于在大豆毛根中過表達(dá)GmMYB15（OEGmMYB15）;通過比對分析GmMYB15保守片段，利用AscⅠ/SwaⅠ和BamHⅠ/AvrⅡ酶切位點(diǎn)將GmMYB15"300"bp保守片段重組至RNAi載體pG2RNAi1，用于在大豆毛根中沉默GmMYB15（RNAiGmMYB15）;利用特異性引物（表1）擴(kuò)增GmMYB15啟動子序列（2"kb），通過Hind"Ⅲ與SalⅠ酶切位點(diǎn)將其重組至pSM101GUS載體;通過Gibson重組反應(yīng)與XhoⅠ及KpnⅠ酶切位點(diǎn)將GmMYB15編碼區(qū)序列克隆到pGWB5GFP載體，融合GFP標(biāo)簽，獲得pGWB5GmMYB15GFP重組載體;利用電激轉(zhuǎn)化將pSM101GmMYB153HA與pG2RNAi1GmMYB15重組載體轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium"rhizogenes"K599，將pGWB5GmMYB15GFP重組載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium"tumefaciens"EHA105，菌落PCR鑒定陽性克隆后，將菌株保存至－80℃?zhèn)溆?利用NdeⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)將GmMYB15編碼區(qū)序列構(gòu)建到pGBKT7載體，獲得pGBKT7GmMYB15重組載體;利用Nde"Ⅰ和EcoR"Ⅰ或BamH"Ⅰ和Xho"Ⅰ酶切位點(diǎn)將咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶CCoAOMT（Glyma11G054500）、肉桂酸羥化酶C4H（Glyma14G205200）、肉桂酰輔酶A還原酶CCR（Glyma11G164700）、WD40（Glyma09G063100）和活化的蛋白激酶C受體1"RACK（Glyma08G051600）克隆至pGADT7載體，獲得ADCCoAOMT、ADC4H、ADCCR、ADWD40及ADRACK重組載體;以ADT與BD53共轉(zhuǎn)作為陽性對照進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)。本研究所用引物的詳細(xì)信息見表1。

1.4"RTqPCR

取大豆根部組織經(jīng)液氮研磨后參照TRIpure"Reagent（艾德萊，RN0101）和HiScriptⅡ"QRT"SuperMix"（諾唯贊，R22201）操作說明進(jìn)行總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋10倍備用;將濃度為10"μmol/L上、下游引物（表1）等體積混合后稀釋20倍，以SKIP16（Glyma12g025500）為內(nèi)參基因進(jìn)行基因表達(dá)分析;RTqPCR反應(yīng)體系如下："2×SYBR"Green"Supper"Mix"5"μL，引物25"μL，"cDNA模板25"μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5"min;95℃變性10"s，60℃延伸30"s，40個循環(huán);最后95℃變性15"s，60℃延伸60"s，95℃變性15"s，獲得擴(kuò)增曲線和熔解曲線。

1.5"大豆抗性表型分析

1.5.1"大豆毛根轉(zhuǎn)化

利用K599介導(dǎo)的大豆毛根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行大豆抗大豆孢囊線蟲表型分析［26］。詳細(xì)步驟如下：選取均勻飽滿的‘W82’大豆放置于7"cm玻璃皿，于干燥器中利用NaClO和濃鹽酸制備氯氣，滅菌16～18"h;將滅菌大豆靜置在超凈臺中6"h，去除殘余氯氣，防止其影響種子萌發(fā);在無菌條件下將大豆種植于GM培養(yǎng)基，在28℃，光周期L∥D=16"h∥8"h下培養(yǎng)5～6"d;大豆在GM培養(yǎng)基培養(yǎng)3"d后活化含pSM101GmMYB153HA、pG2RNAi1GmMYB15、pSM1013HA及pG2RNAi1載體的農(nóng)桿菌K599，挑取單菌落于1"mL"LB液體培養(yǎng)基（含150"mg/L硫酸卡那霉素和50"mg/L硫酸鏈霉素）28℃過夜培養(yǎng)，次日以1∶100比例擴(kuò)大培養(yǎng)，待OD600為07時用于大豆毛根轉(zhuǎn)化。在超凈臺中將長勢良好的大豆去除種皮，切下子葉，用手術(shù)刀尖蘸取菌液劃傷子葉遠(yuǎn)軸面，將傷口向上保濕靜置30"min，隨后移至CCM培養(yǎng)基25℃黑暗共培養(yǎng)3"d，將子葉轉(zhuǎn)移至HRM培養(yǎng)基，子葉傷口向上，25℃黑暗培養(yǎng)14～16"d;利用Olympus體視顯微鏡SZX16篩選帶有綠色熒光的陽性毛根，將陽性根移至HRM培養(yǎng)基25℃黑暗培養(yǎng)5"d，取約6"cm長根尖部分于HRM培養(yǎng)基25℃黑暗培養(yǎng)3"d，截取約4"cm長根尖至HRM培養(yǎng)基25℃黑暗過夜培養(yǎng)，用于次日線蟲接種。

1.5.2"線蟲接種

收集培養(yǎng)30"d的大豆孢囊線蟲孢囊，緩慢研磨后通過500目篩子收集蟲卵，使用02%疊氮化鈉溶液消毒5"min，使用流水沖洗蟲卵，除去殘留疊氮化鈉，將蟲卵置于28℃孵化3"d，3"000"r/min離心1"min收集J2s，加1"mL線蟲消毒液（0004%氯化汞、0004%疊氮化鈉、0002%"Triton"X100）消毒8"min，3"000"r/min離心1"min收集線蟲，用無菌ddH2O洗滌4次后，加入01%瓊脂糖溶液至25"μL含300條J2s，取25"μL重懸液接種至根尖上方1"cm處，25℃黑暗培養(yǎng)30"d后使用體視顯微鏡統(tǒng)計(jì)孢囊數(shù)目;不同大豆品種接種大豆孢囊線蟲時以01%瓊脂糖溶液處理作為對照組;利用K599介導(dǎo)大豆毛根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行表型分析時以轉(zhuǎn)化pSM1013HA和pG2RNAi1空載體獲得的GFP熒光陽性毛根作為對照，每組轉(zhuǎn)基因毛根數(shù)量保證15條以上。

1.6"亞細(xì)胞定位分析

利用根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的煙草葉片瞬時表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行亞細(xì)胞定位試驗(yàn)［27］。詳細(xì)步驟如下：活化含p19的EHA105菌株（用于抑制外源DNA觸發(fā)的植物免疫反應(yīng)，提高轉(zhuǎn)化效率）、含pGWB5GmMYB5GFP重組質(zhì)粒的EHA105菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為05，4"000"r/min離心5"min收集菌體，使用重懸液（10"mmol/L"MES"pH"56、10"mmol/L"MgCl2、02"mmol/L"Acetosyringone）重懸菌體至OD600為10，與p19菌體按1∶1混合均勻，室溫靜置2"h后注射6～8周本氏煙葉片，在28℃，光周期L∥D=16"h∥8"h條件下培養(yǎng)2"d后利用Leica激光共聚焦顯微鏡TCS"SP8在激發(fā)光488"nm和吸收光500～550"nm條件下觀察熒光信號。

1.7"轉(zhuǎn)基因毛根GUS染色

利用GUS報告基因和發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的大豆毛根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)分析GmMYB15轉(zhuǎn)錄模式［26］。使用GmMYB15"2"kb啟動子介導(dǎo)GUS報告基因在感病大豆‘W82’和抗病大豆‘PI548402’毛根中表達(dá)，接種孢囊線蟲至轉(zhuǎn)基因陽性毛根5"d和8"d后，將毛根置于六孔板中，加入GUS染色液浸沒根組織，置于真空泵中真空處理10"min后37℃靜置12"h，經(jīng)70%乙醇脫色后使用Olympus體視顯微鏡SZX16觀察并拍照。

1.8"酵母雙雜交篩選互作蛋白

1.8.1"轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞

挑取AH109菌株單克隆于5"mL"YPDA液體培養(yǎng)基，30℃，200"r/min培養(yǎng)12"h，加入45"mL"1×YPDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3"h至OD600為07～08，3"000"r/min離心5"min收集菌體，用50"mL"1×TE緩沖液清洗1次后，用1"mL"1×TE/LiAC"（ddH2O"800"μL、100"μL"10×TE、100"μL"10×LiAC）重懸備用;取500"ng重組質(zhì)粒pGBKT7GmMYB15、2"μL變性鮭魚精DNA、20"μL酵母感受態(tài)細(xì)胞于EP管中，加120"μL"PEGTELiAC"（50%"PEG4000"800"μL、10×TE"100"μL、10×LiAC"100"μL，現(xiàn)配現(xiàn)用），混勻后30℃，200"r/min孵育30"min，加入14"μL"DMSO，溫和混勻后42℃水浴15"min，期間顛倒混勻3次，冰上孵育2"min后3"000"r/min離心1"min收集菌體，用無菌ddH2O重懸菌體，涂布于SD/Trp平板，28℃培養(yǎng)4"d，挑取3個單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，保存菌株備用。

1.8.2"cDNA文庫篩選

活化保存的pGBKT7GmMYB15酵母菌株，挑取單克隆于5"mL"SD/Trp液體培養(yǎng)基，30℃，200"r/min培養(yǎng)16"h，加入45"mL"1×YPDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600為07～08，3"000"r/min室溫離心5"min收集菌體，用5"mL"SD/Trp液體培養(yǎng)基重懸菌體，加入1"mL本實(shí)驗(yàn)室保存的大豆孢囊線蟲侵染大豆根部后的cDNA文庫，輕輕混勻，加入45"mL"2×YPDA（含50"μg/L氯霉素），30℃"30"r/min培養(yǎng)18～24"h，1"000"r/min離心10"min收集菌體，使用1"mL"1×YPDA（含50"μg/L氯霉素）清洗2次后用10"mL"05×YPDA（含50"μg/L氯霉素）重懸菌體，取200～300"μL重懸液均勻涂布于40～50個SD/TrpLeuHis"（TDO）固體培養(yǎng)板。此外，取100"μL重懸液按1/100、1/1"000、1/10"000稀釋后分別涂布SD/Leu、SD/Trp和SD/TrpLeu（DDO）平板，30℃培養(yǎng)4"d統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算Mating效率;挑取SD/TrpLeuHis平板上的單克隆于SD/LeuTrpHisAde（QDO）和QDO/XGal固體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，挑選QDO/XGal上正常生長且變藍(lán)的單克隆進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，利用T7通用引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過Phytozome（https：∥phytozomenext.jgi.doe.gov/）進(jìn)行比對確定候選互作蛋白序列信息。

2"結(jié)果與分析

2.1"孢囊線蟲侵染誘導(dǎo)GmMYB15轉(zhuǎn)錄

分析本實(shí)驗(yàn)室前期大豆孢囊線蟲侵染大豆根部的RNAseq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)GmMYB15在抗病大豆品種‘PI88788’和感病大豆品種‘W82’中均受大豆孢囊線蟲侵染誘導(dǎo)（圖1a）。接種大豆孢囊線蟲至感病大豆品種‘W82’、抗病大豆品種‘PI88788’和‘PI548402’根部，3"d和5"d后取根部組織分析GmMYB15轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示GmMYB15在大豆孢囊線蟲侵染3"d和5"d轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)（圖1b）。利用大豆毛根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將含GmMYB15"2"kb啟動子與GUS報告基因的重組載體轉(zhuǎn)化到大豆毛根中，然后接種大豆孢囊線蟲分析GmMYB15表達(dá)

模式，發(fā)現(xiàn)GUS報告基因在線蟲取食位點(diǎn)特異性表達(dá)（圖1c）。上述結(jié)果表明GmMYB15在轉(zhuǎn)錄水平受大豆孢囊線蟲侵染誘導(dǎo)，參與大豆與大豆孢囊線蟲互作。

2.2"GmMYB15定位細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核

利用在線工具SeqNLS（http：∥mleg.cse.sc.edu/seqNLS/）和NLStradamus"（http：∥www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/）對GmMYB15進(jìn)行定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有經(jīng)典的核定位信號。為進(jìn)一步明確GmMYB15在植物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，將含有融合表達(dá)載體pGWB5GmMYB15GFP的EHA105菌株注射本氏煙幼嫩葉片，表達(dá)48"h后利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號在葉表皮細(xì)胞中的分布，發(fā)現(xiàn)GmMYB15GFP在煙草葉片細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均表達(dá)（圖2）。

2.3"GmMYB15正調(diào)控大豆對大豆孢囊線蟲的抗性

為評價GmMYB15在大豆抗大豆孢囊線蟲中的作用，利用大豆毛根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)過表達(dá)GmMYB15，接種大豆孢囊線蟲進(jìn)行抗線蟲表型分析。RTqPCR結(jié)果顯示，大豆毛根中GmMYB15轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（圖3a）;表型分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，OEGmMYB15根部孢囊數(shù)量顯著減少（圖3b）。

選取300"bp"GmMYB15保守區(qū)域，構(gòu)建RNAi載體分析其表達(dá)水平，并進(jìn)行抗線蟲表型分析，發(fā)現(xiàn)RNAiGmMYB15毛根中GmMYB15轉(zhuǎn)錄水平與對照相比顯著降低，根部孢囊數(shù)量顯著增加（圖3c，d）;上述結(jié)果表明，GmMYB15正調(diào)控大豆對孢囊線蟲的抗性。

2.4"GmMYB15互作蛋白篩選

為進(jìn)一步探究GmMYB15調(diào)控大豆線蟲抗性的作用機(jī)制，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選GmMYB15互作蛋白，將BDGmMYB15和pGADT7空載體（AD載體）共同轉(zhuǎn)化AH109菌株，發(fā)現(xiàn)其在DDO平板上正常生長，在TDO、QDO和LacZ平板上生長受到抑制，表明GmMYB15不具有細(xì)胞毒性且無自激活活性（圖4）。以BDGmMYB15為誘餌蛋白篩選孢囊線蟲侵染的大豆根部cDNA文庫，該試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，且每次篩選效率均大于2%;共篩選到95個候選互作蛋白，進(jìn)一步利用酵母雙雜交試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)GmMYB15與咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）、肉桂酸羥化酶（C4H）、肉桂酰輔酶A還原酶（CCR）、WD40和活化的蛋白激酶C受體1"（RACK）互作。

3"結(jié)論與討論

大豆孢囊線蟲作為專性定居型內(nèi)寄生線蟲，在維管束附近誘導(dǎo)形成合胞體。合胞體細(xì)胞質(zhì)稠密，代謝高度活躍以便線蟲吸取營養(yǎng)。合胞體的建立和維持對于線蟲的成功寄生至關(guān)重要，線蟲取食細(xì)胞或鄰近細(xì)胞的壞死反應(yīng)可導(dǎo)致取食細(xì)胞的瓦解，從而賦予植物線蟲抗性［2829］。在與植物寄生線蟲長期互作中，植物演化出一套復(fù)雜精密的先天免疫系統(tǒng)識別線蟲，抵御線蟲侵染與寄生。通過生物化學(xué)與遺傳學(xué)手段探索植物抗線蟲免疫反應(yīng)調(diào)控，可為作物抗線蟲分子育種提供理論基礎(chǔ)。本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB15受大豆孢囊線蟲侵染誘導(dǎo)，表型分析發(fā)現(xiàn)該基因正調(diào)控大豆線蟲抗性，通過互作蛋白篩選初步發(fā)現(xiàn)其與多種蛋白互作，為后續(xù)深入開展GmMYB15調(diào)控大豆線蟲抗性機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子作為植物最大的MYB轉(zhuǎn)錄因子亞家族，其N端為保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端為轉(zhuǎn)錄調(diào)控域，二者共同決定R2R3MYB功能多樣性。諸多R2R3MYB的R3重復(fù)序列中具有與bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用的基序（D/E）Lx2（R/K）x3Lx6Lx3R，因此該類轉(zhuǎn)錄因子可與bHLH轉(zhuǎn)錄因子及WD結(jié)構(gòu)域蛋白互作形成MYBbHLHWDR蛋白復(fù)合體（MBW復(fù)合體）［30］。如擬南芥AtMYB4及其同源蛋白（AtMYB7、AtMYB32）與bHLH蛋白TT8"（TRANSPARENT"TESTA"8）、GL3"（GLABRA"3）和EGL3"（ENHANCER"OF"GLABRA"3）相互作用抑制花青素合成，且AtMYB4通過抑制ADT6轉(zhuǎn)錄，抑制類黃酮的生物合成［31］。轉(zhuǎn)錄因子GL3、EGL3、MYB75及GLABRA1與JAZ"（JASMONATE"ZIMdomain"proteins）互作，抑制JA介導(dǎo)的花青素積累和毛狀體形成［32］。GmMYB15互作蛋白的篩選發(fā)現(xiàn)，其與WD40蛋白互作，暗示GmMYB15可能參與MBW復(fù)合體形成，然而本研究未篩選到與GmMYB15互作的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，后續(xù)仍需開展試驗(yàn)挖掘與GmMYB15互作的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，探究其形成MBW復(fù)合體調(diào)控大豆線蟲抗性機(jī)制。

R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)。如AtMYB59調(diào)節(jié)擬南芥根生長發(fā)育［4］;野草莓FveMYB117a和擬南芥AtMYB109分別調(diào)控腋芽和花粉管生長［3，6］;水稻MYB蛋白MOF1影響小穗分生組織和護(hù)穎發(fā)育［5］。煙草NtMYB184結(jié)合GGTAGGTA和GTTAGGTA基序，抑制黃酮合成基因表達(dá)，降低煙草黃酮含量［21］。過表達(dá)大豆GmMYBJ1和小麥TaMYBsm1使植物高度抗干旱［3334］;玉米ZmMYB31轉(zhuǎn)錄激活CBF基因，提高植株低溫抗性［13］;擬南芥AtMYB4及其在水稻中的同源基因OsMYB102和OsMYB108分別抑制水稻和擬南芥木質(zhì)素合成，負(fù)調(diào)控白葉枯病病原菌Xanthomonas"oryzae"pv.oryzae侵染［35］。雖然目前該類轉(zhuǎn)錄因子已被廣泛報道參與調(diào)控植物多種生命過程，但是其在植物與線蟲互作中的功能研究仍然較少。本研究雖然明確GmMYB15轉(zhuǎn)錄水平受孢囊線蟲侵染誘導(dǎo)，過表達(dá)GmMYB15增強(qiáng)大豆線蟲抗性，但是其調(diào)控大豆線蟲抗性的分子機(jī)制和生物學(xué)意義仍需深入探究。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）