摘要：【目的】構(gòu)建特異性表達(dá)KillerRed（KR）的雞原始生殖細(xì)胞系（PGCs），為制備生殖細(xì)胞可消除的受體雞胚和提高外源PGCs在嵌合體中的基因傳遞效率提供理論參考?！痉椒ā坷胔yPBase轉(zhuǎn)座酶將KR整合到雞胚成纖維細(xì)胞系（DF-1）基因組中，建立穩(wěn)定表達(dá)CAG-KR-EGFP的DF-1細(xì)胞系（KR-DF-1）。利用綠光照射細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)DF-1的消除效率。采用CRISP/Cas9系統(tǒng)將KR定點(diǎn)敲入到雞生殖細(xì)胞水平的PGCs中DAZL基因的第11號(hào)外顯子中，建立生殖細(xì)胞特異表達(dá)DAZL-KR-EGFP的PGCs細(xì)胞系（KR-PGCs）。利用綠光照射細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)PGCs消除效率。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)生殖細(xì)胞特異性表達(dá)基因的相對(duì)表達(dá)量。顯微注射KR-PGCs到受體雞胚，孵化產(chǎn)生嵌合體后代，PCR檢測(cè)嵌合體后代精液中是否含有KR?！窘Y(jié)果】成功構(gòu)建KR-DF-1，與野生型DF-1相比，細(xì)胞增殖無(wú)顯著差異（Pgt;0.05，下同）；綠光照射后，KR-DF-1死亡率極顯著升高（Plt;0.01，下同）；成功構(gòu)建KR-PGCs，綠光照射后，KR-PGCs死亡率極顯著升高，細(xì)胞核呈破碎狀；綠光照射12 h，KR-PGCs中SOD2和CAS3基因相對(duì)表達(dá)量極顯著升高；細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，KR-PGCs在綠光照射后出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)；KR-PGCs的特異性基因DAZL、DDX4、Pou5f3、NANOG和DNA1正常表達(dá)，仍具有遷移定植到性腺的能力，且性成熟嵌合體公雞精液能產(chǎn)生含KR的精液?！窘Y(jié)論】成功構(gòu)建了在DAZL基因位點(diǎn)特異性表達(dá)KR的KR-GCs細(xì)胞系，且綠光照射后可特異性消除KR-PGCs。通過(guò)顯微注射成功獲得了含有KR-PGCs且能產(chǎn)生含KR精液的嵌合體后代。

關(guān)鍵詞：雞；原始生殖細(xì)胞；KillerRed；特異性消除；嵌合體

中圖分類號(hào)：S831.49文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）10-3136-11

Research on KillerRed-mediated elimination of chickenprimordial germ cells

ZHANG Jia-le，HUANG Zhen-wen，JIA Xiao-xuan，PENG Yu-lin，WEN Jing-er，JI Na，XU Hui-yan，LIU Xing-ting，RAN Ming-xia，LU Yang-qing*

（College of Animal Science and Technology，Guangxi University/Guangxi Key Laboratory of Livestock and PoultryBreeding and Disease Prevention and Control，Nanning，Guangxi 530004，China）

Abstract：【Objective】To construct a chicken primordial germ cell line（PGCs）that specifically expressed KillerRed（KR）in order to provide theoretical reference for preparing germ cell-eliminable recipient chicken embryos and impro-ving the gene transfer efficiency of exogenous PGCs in chimeras.【Method】KR was integrated into the genome of chicken embryo fibroblast cell line（DF-1）using hyPBase transposase，and a DF-1 cell line（KR-DF-1）stably expressing CAG-KR-EGFP was established.The cells were irradiated with green light，and the elimination efficiency of DF-1 was detected by Trypan blue staining.KR was site-specifically knocked into exon number 11 of the DAZL gene in PGCs at the chicken germ cell level using the CRISP/Cas9 system，and a PGCs cell line（KR-PGCs）specifically expressing DAZL-KR-EGFPin germ cells was established.After irradiating the cells with green light，the elimination efficiency of PGCs was detected by Trypan blue staining.Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the relative expression of genes spe-cifically expressed in germ cells.KR-PGCs were microinjected into recipient chicken embryos，and were hatched to pro-duce chimeric offspring.PCR was used to detect whether the semen of chimeric offspring contained KR.【Result】KR-DF-1was successfully constructed.Compared with wild-type DF-1，there was no significant difference in cell proliferation（Pgt;0.05，the same below）.After green light irradiation，the death rate of KR-DF-1 was extremely significantly increased（Plt;0.01，the same below）.KR-PGCs were successfully constructed.After green light irradiation，the mortality rate of KR-PGCs was extremely significantly higher than that of other groups.After green light irradiation，the nuclei were frag-mented.After green light irradiation for 12 h，the relative expression levels of SOD2 and CAS3 genes in KR-PGCs were extremely significantly increased；cell counting results showed that KR-PGCs showed negative growth after green light ir-radiation；the specific genes DAZL，DDX4，Pou5f3，NANOG and DNA1 of KR-PGCs were normally expressed，andthey still had the ability to migrate and colonize to the gonads，and the semen of sexually mature chimeric roosters could produce semen containing KR.【Conclusion】The KR-PGCs cell line which expresses specifically at the DAZL gene loci issuccessfully constructed，and KR-PGCs can be specifically eliminated after green light irradiation.Throughmicroinjec-tion，chimeric offspring with KR-PGCs in the gonads and capable of producing KR sperm are successfully obtained.

Key words：chicken；primordial germ cells；KillerRed；specific elimination；chimera

Foundation items：National Key Research and Development Program of China（2021YFD1300100）

0引言

【研究意義】禽類具有特殊的生殖系統(tǒng)和胚胎發(fā)育方式，操作受精卵產(chǎn)生基因編輯雞具有一定挑戰(zhàn)性，常用于生產(chǎn)基因編輯雞的方法有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法（Bosselman et al.，1989）、原始生殖細(xì)胞（Primor-dial germ cells，PGCs）介導(dǎo)法（Vick et al.，1993）和DNA顯微注射法（Love et al.，1994）等。隨著PGCs體外培養(yǎng)體系的不斷優(yōu)化，越來(lái)越多有利于維持PGCs干性和種系傳遞能力的特定因子及有利于提高培養(yǎng)基支持性的物質(zhì)被添加到培養(yǎng)體系中（Naito et al.，2015；Whyte et al.，2015；Chen et al.，2018；Szc-zerbaetal.，2020；Dehdilani et al.，2023）。研究表明，富集培養(yǎng)基能增強(qiáng)PGCs特異性標(biāo)記物和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，提高PGCs的增殖效率，可用于體外長(zhǎng)期培養(yǎng)PGCs，且不影響PGCs遷移并定植到性腺的能力（Dehdilani et al.，2023）。高效的擴(kuò)增體系有利于縮短細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，維持PGCs原有的特性和遷移能力，進(jìn)而提高產(chǎn)生嵌合體的效率。外源PGCs注射到受體雞胚后會(huì)與內(nèi)源PGCs競(jìng)爭(zhēng)生存物質(zhì)和空間，導(dǎo)致外源PGCs定植到性腺的效率下降（Qin et al.，2024），限制了PGCs介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)在制備基因編輯雞領(lǐng)域中的應(yīng)用。減少內(nèi)源PGCs是提高外源PGCs在受體雞胚性腺中定植效率和嵌合體雞產(chǎn)生外源配子概率的途徑之一（Ballantyneetal.，2021）。因此，制備能特異性消除內(nèi)源PGCs的受體雞對(duì)提高PGCs介導(dǎo)的基因編輯雞的制備具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】常用的消除內(nèi)源PGCs的方法有伽馬射線照射法、白消安處理法和通過(guò)基因編輯在生殖細(xì)胞中引入自殺基因等。其中，伽馬射線照射法會(huì)顯著降低胚胎孵化率，白消安處理法存在致死、不育和胚胎畸形等副作用（Bishop and Wassom，1986）。因此，在生殖細(xì)胞中引入自殺基因是特異性最高、副作用最小的內(nèi)源生殖細(xì)胞消除方法。生殖細(xì)胞中DEAD-Box解旋酶4（DEAD-Box helicase 4，DDX4）基因?qū)儆陔uVasa同源物（CVH），對(duì)其譜系的形成至關(guān)重要，利用類轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）介導(dǎo)的DDX4基因大型缺失會(huì)導(dǎo)致雌性PGCs發(fā)育異常和卵巢不育（Taylor et al.，2017）；DAZL基因位點(diǎn)表達(dá)caspase-9蛋白與FK506結(jié)合蛋白（FKBP），并通過(guò)藥物誘導(dǎo)FKBP二聚化，隨后激活相鄰的caspase-9蛋白能特異性誘導(dǎo)內(nèi)源PGCs凋亡（Ballantyneetal.，2021）；利用CRISPR-Cas12a（Cpf1）家族核酸酶MAD7打靶DDX4基因能造成DNA雙鏈斷裂，在引入硝基還原酶（Nitroreductase，NTR）基因后能產(chǎn)生NTR基因編輯雞，在NTR基因編輯雞胚中同時(shí)注射外源PGCs和甲硝唑（Metronidazole，Mtz）能顯著促進(jìn)內(nèi)源PGCs凋亡，增加性腺中外源PGCs占比（Chen et al.，2023）。這些研究為特異性消除內(nèi)源PGCs和提高種系嵌合體效率提供了新策略，但均需添加外源藥物，可能會(huì)影響雞胚的正常發(fā)育（Berg etal.，1999；Carere and Balthazart，2007）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】Kill-erRed（KR）是一種由水螅色素蛋白anm2CP（與綠色熒光蛋白同源）進(jìn)一步開(kāi)發(fā)而成的熒光蛋白（Bulina et al.，2006）。KR具有光毒性，受到綠光照射后能通過(guò)I型光動(dòng)力反應(yīng)與氧分子相互作用而形成超氧陰離子O2-，進(jìn)而產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）并激活細(xì)胞凋亡相關(guān)通路（Carpentier et al.，2009；Pletnevetal.，2009）；但KR的光毒性效應(yīng)不會(huì)擴(kuò)散到鄰近細(xì)胞（Kobayashi et al.，2013；Williamset al.，2013）。因此，KR介導(dǎo)的內(nèi)源PGCs消除方法無(wú)需添加外源藥物，是一種較理想的消除內(nèi)源PGCs的手段，而利用KR的光毒性消除雞細(xì)胞系或特異性消除雞PGCs的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在雞胚成纖維細(xì)胞系（DF-1）水平上驗(yàn)證KR光毒性可普遍應(yīng)用于消除雞細(xì)胞系，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建生殖細(xì)胞水平上特異性表達(dá)KR的PGCs細(xì)胞系，探究KR光毒性能否用于特異性消除雞PGCs，進(jìn)而通過(guò)PGCs移植制備PGCs特異性表達(dá)KR的嵌合體后代，為制備綠光照射消除內(nèi)源PGCs的雞胚模型提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

DF-1購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)，雞PGCs源自本課題組前期分離培養(yǎng)的PGCs細(xì)胞系（Xie et al.，2019）。主要試劑：DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BamH I和Mlu I、Xfect質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根（北京）生化科技有限公司；PCR預(yù)混試劑、RT-qPCR預(yù)混試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；總RNA提取試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；0.4%臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DMRIE-C轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；0.05%胰蛋白酶-EDTA購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；DMEM高糖液體培養(yǎng)基購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。主要儀器設(shè)備：血球計(jì)數(shù)板購(gòu)自上海求精生化試劑儀器有限公司；400 mW/cm2 531 nm綠色激光器購(gòu)自井岡山市龍市鎮(zhèn)宏都超耐電子。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1表達(dá)載體構(gòu)建本研究中，光照處理組記為L(zhǎng)ight，對(duì)照組記為Cont。帶有質(zhì)膜定位信號(hào)的KR基因委托深圳華大基因科技有限公司合成。CMV-hyPBase轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體由本課題組保存。DF-1細(xì)胞采用hyPBase轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)隨機(jī)整合插入KR載體，相關(guān)載體構(gòu)建：利用Mlu I和BamH I將XP61載體進(jìn)行雙酶切，并將KR片段與XP61骨架相連接，最終獲得CAG-KR-EGFP表達(dá)載體。PGCs使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)敲入KR供體，相關(guān)載體構(gòu)建：利用EcoR V將pMD18-T載體進(jìn)行單酶切，通過(guò)In-Fusion克隆方案在KR片段前后各設(shè)計(jì)與載體同源的15 bp，并將KR片段克隆到pMD18-T載體上，最終獲得DAZL-KR-EGFP表達(dá)載體。靶向定位雞原始生殖細(xì)胞標(biāo)志基因DAZL的sgRNA設(shè)計(jì)：參考NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中雞DAZL基因序列數(shù)據(jù)（Gene ID：374054），針對(duì)DAZL基因的11號(hào)外顯子設(shè)計(jì)用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲入的sgRNA表達(dá)載體。測(cè)序均委托深圳華大基因科技有限公司完成，利用SnapeGene進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.2細(xì)胞系建立與純化利用Xfect質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒將CAG-KR-EGFP和CMV-hyPBase表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞。利用DMRIE-C轉(zhuǎn)染試劑盒將DAZL-KR-EGFP和sgRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染雞PGCs。轉(zhuǎn)染后DF-1細(xì)胞和PGCs均同時(shí)呈現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光，利用顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。持續(xù)培養(yǎng)14 d后，利用流式細(xì)胞儀分選帶有熒光的陽(yáng)性細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)建系以獲得穩(wěn)定表達(dá)CAG-KR-EGFP的DF-1細(xì)胞系（KR-DF-1）和穩(wěn)定表達(dá)DAZL-KR-EGFP的PGCs細(xì)胞系（KR-PGCs）

1.2.3 RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)收集野生型PGCs（WT-PGCs）和KR-PGCs細(xì)胞懸液，利用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系20μL：RNA 500 ng，2×ES Reaction Mix 10μL，EasyScript?RT/RI Enzyme Mix 1μL，gDNA Remover 1μL，Ran-dom Primer 1μL，RNase-free H2O補(bǔ)足至20μL。反轉(zhuǎn)錄程序：25℃10 min；42℃30 min；85℃5 s。PCR反應(yīng)體系20μL：cDNA模板10 ng，2×Easy Taq?PCRSuperMix 10μL，上、下游引物各1μL，ddH2O補(bǔ)足至20μL。PCR擴(kuò)增程序參照2×Easy Taq?PCRSuperMix試劑盒說(shuō)明設(shè)定。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20μL：cDNA模板10 ng，上、下游引物各1μL，2×PerfectStart?Green qPCR SuperMix 10μL，ddH2O補(bǔ)足至20μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序參照PerfectStart?Green qPCR SuperMix試劑盒說(shuō)明設(shè)定。以ACTB為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增引物序列信息見(jiàn)表1。

1.2.4細(xì)胞照射利用20倍物鏡下汞燈綠光照射PGCs和DF-1細(xì)胞，分別照射10、20和40 min。照射前后采集圖像，統(tǒng)計(jì)紅色熒光細(xì)胞數(shù)量。采用400 mW/cm2 531 nm綠色激光器進(jìn)行細(xì)胞淬滅照射。PGCs照射程序：將PGCs重懸為密度為2×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，吸取100μL至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，照射6 h。DF-1細(xì)胞照射程序：將DF-1細(xì)胞重懸至密度為3×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液；吸取100μL細(xì)胞懸液至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中照射12 h。照射前后采集圖像，分析照射對(duì)PGCs和DF-1細(xì)胞活性的影響。

1.2.5細(xì)胞計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，步驟如下：無(wú)水乙醇擦洗計(jì)數(shù)板，風(fēng)干后蓋上蓋玻片；吸取10μL 1.2.4中的PGCs和DF-1細(xì)胞懸液滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板中；10倍物鏡下統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)室邊緣四大象限內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量；4個(gè)象限內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的平均值記為1次重復(fù)，壓線細(xì)胞記錄左側(cè)和上側(cè)的細(xì)胞數(shù)量，重復(fù)3次。細(xì)胞密度按照以下公式計(jì)算：

細(xì)胞密度（個(gè)/mL）=4個(gè)象限方格細(xì)胞平均數(shù)×104。1.2.6細(xì)胞染色利用臺(tái)盼藍(lán)染色統(tǒng)計(jì)細(xì)胞死亡率，步驟如下：0.4%臺(tái)盼藍(lán)與細(xì)胞懸液按1∶9比例混勻（臺(tái)盼藍(lán)工作濃度為0.04%）；染色5min后吸取10μL懸液到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞死亡率按照以下公式計(jì)算：

細(xì)胞死亡率（%）=死亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100

采用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色，步驟如下：細(xì)胞照射后，1500 r/min離心3 min；收集細(xì)胞并加入Hoechst 33342重懸染色10 min；離心后棄上清液，100μL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；吸取10μL懸液滴加到載玻片上，顯微鏡下采集圖像；細(xì)胞核不圓潤(rùn)、松散、破碎的記為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞率按照以下公式計(jì)算：

陽(yáng)性細(xì)胞率（%）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100

1.2.7細(xì)胞顯微注射PGCs顯微注射步驟如下：收集細(xì)胞懸液，1500 r/min離心3 min，棄上清液；培養(yǎng)液重懸并計(jì)數(shù)；調(diào)整細(xì)胞密度，加入10%臺(tái)盼藍(lán)混勻；吸取100μL混液滴加到培養(yǎng)皿上形成細(xì)胞液滴；加入礦物油密封細(xì)胞液滴；細(xì)胞靜置沉淀10min；在消毒后孵化2.5 d的雞胚氣室上開(kāi)洞，鑷子撕掉蛋殼薄膜；顯微注射1×104個(gè)細(xì)胞至雞胚心臟中；滴加含青鏈霉素的PBS，石蠟?zāi)っ芊饫^續(xù)孵化；孵化10.5 d時(shí)解剖部分雞胚分離性腺，顯微鏡下觀察；其余雞胚繼續(xù)孵化。

1.2.8精液PCR檢測(cè)利用背部按摩法人工采集公雞精液于1.5 mL微量離心管中，混勻后吸取10μL提取DNA進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序同1.2.3，KR精液鑒定引物F：5'-AGGCACCTGTACTGT GAAACC-3'，R：5'-GAACTTCTGGCCGTTCACCT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度383bp。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 10.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并制圖，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1 KR-DF-1細(xì)胞系構(gòu)建結(jié)果

將KR片段插入含CAG啟動(dòng)子的XP61骨架中，構(gòu)建持續(xù)表達(dá)KR的表達(dá)載體CAG-KR-EGFP（圖1-A）。對(duì)構(gòu)建的CAG-KR-EGFP表達(dá)載體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，表達(dá)載體中包含KR序列，表明載體構(gòu)建成功（圖1-B）。隨后，將CAG-KR-EGFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染14 d后通過(guò)流式細(xì)胞分選儀分選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DF-1細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)以獲得純化的KR-DF-1（圖1-C）。繪制KR-DF-1細(xì)胞和野生型DF-1（WT-DF-1）細(xì)胞增殖曲線，結(jié)果（圖1-D）顯示，2種細(xì)胞增殖曲線基本一致，無(wú)顯著差異（Pgt;0.05，下同）。表明KR的整合不影響DF-1細(xì)胞的正常增殖。

2.2綠光照射對(duì)消除KR-DF-1的影響

為驗(yàn)證綠光照射能否選擇性消除KR-DF-1，將WT-DF-1與KR-DF-1按1∶1比例混養(yǎng)，并在20倍物鏡下汞燈綠光照射。細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示，隨著照射時(shí)間的增加，KR-DF-1細(xì)胞形態(tài)收縮，一些原本貼壁的細(xì)胞逐漸懸浮并匯聚成細(xì)胞團(tuán)（圖2-A），且KR-DF-1的紅色熒光細(xì)胞占比極顯著降低（Plt;0.01，下同）（圖2-B）。20倍鏡下汞燈只能照射到少部分貼壁細(xì)胞，為更準(zhǔn)確獲得綠光照射下KR-DF-1的消除效率，采用具有更大照射面積（400 mW/cm2、531 nm）的綠色激光器照射，結(jié)果顯示，在531 nm綠光下照射12h后，KR-DF-1的紅色熒光幾乎完全淬滅（圖2-C）；臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，KR-DF-1 Light組死亡細(xì)胞占比極顯著高于Cont組（圖2-D），與紅色熒光淬滅結(jié)果相符。表明綠光照射能有效消除KR-DF-1。

2.3 KR-PGCs細(xì)胞系構(gòu)建結(jié)果

DAZL基因在遷移的PGCs和性腺生殖細(xì)胞中均高度表達(dá)（Kito etal.，2010；Lee et al.，2016），為獲得特異性表達(dá)KR的PGCs，通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)將DAZL-KR-EGFP表達(dá)載體敲入到DAZL基因的第11號(hào)外顯子中以構(gòu)建KR-PGCs（圖3-A）。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PGCs后采用流式細(xì)胞儀分選純化KR-PGCs并繼續(xù)培養(yǎng)，建立KR-PGCs細(xì)胞系，結(jié)果顯示，KR-PGCs細(xì)胞均帶有紅色熒光（圖3-B）。提取KR-PGCs細(xì)胞系總RNA，對(duì)插入位點(diǎn)含有KR供體的左右同源臂進(jìn)行PCR檢測(cè)和測(cè)序分析，結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得條帶大小約為250和150bp，與預(yù)期結(jié)果相符（左同源臂233 bp和右同源臂159bp）。測(cè)序結(jié)果也顯示插入位點(diǎn)含有預(yù)期的KR供體序列（圖3-C）。表明KR-PGCs細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.4綠光照射對(duì)消除KR-PGCs的影響

顯微鏡下觀察綠光照射對(duì)KR-PGCs紅色熒光淬滅的影響，結(jié)果（圖4-A）顯示，KR-PGCs經(jīng)400mW/cm2、531 nm的綠色激光器照射6h后，KR的紅色熒光幾乎完全淬滅。臺(tái)盼藍(lán)染色統(tǒng)計(jì)綠光照射后不同時(shí)間點(diǎn)KR-PGCs的死亡率，結(jié)果（圖4-B）顯示，隨著時(shí)間的增加，KR-PGCs死亡率逐漸增加，光照12和24 h的死亡率極顯著高于其他組。統(tǒng)計(jì)綠光照射后細(xì)胞的數(shù)量變化并分析綠光照射對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果（圖4-C）顯示，KR-PGCs Light組細(xì)胞數(shù)在第2 d顯著少于KR-PGCs Cont組（Plt;0.05，下同），第4和6d細(xì)胞數(shù)量均極顯著低于其他組，其他組間細(xì)胞增殖趨勢(shì)相近且無(wú)顯著差異，表明綠光照射對(duì)KR-PGCs增殖存在負(fù)面影響。此外，在0～6 d，WT-PGCs Cont組和KR-PGCs Cont組細(xì)胞數(shù)差異不顯著，表明KR的敲入不影響PGCs增殖。細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，綠光照射后，KR-PGCs Light組細(xì)胞凋亡率極顯著高于KR-PGCs Cont組、WT-PGCs Cont組和WT-PGCs Light組（圖4-D），且核碎片化程度加重（圖4-E）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖4-F和4-G）顯示，綠光照射12 h，KR-PGCs Light組抗氧化基因SOD2和促凋亡基因CAS3的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于其他組。表明綠光照射能有效消除KR-PGCs。

2.5 KR-PGCs定植到性腺與生精能力驗(yàn)證結(jié)果

PCR結(jié)果顯示，KR-PGCs和WT-PGCs中的PGCs特異性基因DAZL、DDX4、Pou5f3、NANOG、DND1在mRNA水平均有表達(dá)，而體細(xì)胞水平的WT-DF-1未見(jiàn)表達(dá)（圖5-A），表明KR-PGCs能表達(dá)生殖細(xì)胞特異性基因。將KR-PGCs移植到受體雞胚中，鑒定KR-PGCs的遷移能力。結(jié)果顯示，將帶紅色熒光和綠色熒光的KR-PGCs注射到受體雞胚的血液循環(huán)系統(tǒng)后，能在受體雞胚性腺中觀察到顆粒分明的細(xì)胞熒光（圖5-B），表明KR-PGCs仍具備遷移并定植到性腺的能力。此外，同一批注射的雞胚成功孵化獲得生殖細(xì)胞特異性表達(dá)KR的嵌合體后代（圖5-C）。精液PCR鑒定結(jié)果表明，性成熟的KR嵌合體公雞可產(chǎn)出含有KR的精液（圖5-D）。

3討論

隨著PGCs體外培養(yǎng)體系和移植技術(shù)的優(yōu)化（秦潔等，2006；陳美娟等，2016；Dehdilani et al.，2023），PGCs介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)逐漸成熟（Kim et al.，2023）。由于受體雞胚PGCs的內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)，移植的外源PGCs存在種系遺傳效率低等問(wèn)題，限制了PGCs介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)在制備基因編輯雞領(lǐng)域中的應(yīng)用。因此，制備內(nèi)源PGCs消除的基因編輯雞模型有利于提高外源移植PGCs的嵌合體效率。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)基因編輯技術(shù)引入自殺基因是目前較理想的內(nèi)源PGCs消除方法，包括通過(guò)二聚化配體激活的iCaspase9介導(dǎo)法（Ballantyne et al.，2021；孫玲玲，2023）和通過(guò)甲硝唑激活的NTR介導(dǎo)法（Chen et al.，2023）等，這些方法均是通過(guò)藥物傳遞系統(tǒng)選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡壞死，進(jìn)而達(dá)到消除內(nèi)源PGCs的目的。但外源藥物的添加會(huì)影響胚胎的正常生長(zhǎng)發(fā)育（Berg etal.，1999；Carere and Balthazart，2007）。KR可通過(guò)照射綠光產(chǎn)生有限空間范圍的ROS（Kobayashi et al.，2013；Williamset al.，2013），利用該特點(diǎn)能特異性消除內(nèi)源PGCs，且不損傷鄰近細(xì)胞。

雞體細(xì)胞水平的永生化雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1具有更低的培養(yǎng)成本和更高的轉(zhuǎn)染效率，能快速在體細(xì)胞水平驗(yàn)證KR光毒性效應(yīng)是否能用于雞細(xì)胞系的消除。研究表明，長(zhǎng)時(shí)間低強(qiáng)度光照能使表達(dá)KR的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡特征，而短時(shí)間高強(qiáng)度的光照則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞直接壞死（Serebrovskaya et al.，2014）。本研究中，通過(guò)hyPBase轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)完成了KR在雞體細(xì)胞DF-1基因組上的整合，使KR在DF-1的基因組中出現(xiàn)多個(gè)拷貝數(shù)，CAG持續(xù)表達(dá)的啟動(dòng)子也加強(qiáng)了KR的表達(dá)水平。此外，定點(diǎn)在雞生殖細(xì)胞PGCs的DAZL基因敲入KR，KR在PGCs的基因組中表達(dá)量最多為2個(gè)拷貝。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)充分的綠光照射淬滅KR的熒光，可充分發(fā)揮KR的ROS毒性（Bulina et al.，2006）。本研究中，KR-DF-1在紅色熒光淬滅后0 h直接死亡，而KR-PGCs則是在紅色熒光淬滅后0、12和24 h細(xì)胞死亡率逐漸增加。在綠光照射時(shí)，KR-PGCs細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)第2 d先增長(zhǎng)，第4 d后負(fù)增長(zhǎng)和第6d再增長(zhǎng)趨勢(shì)，可能是由于綠光照射細(xì)胞數(shù)量過(guò)多，所使用的培養(yǎng)基能促進(jìn)體外培養(yǎng)4～6 d的PGCs快速增殖（Xie et al.，2019），導(dǎo)致部分未凋亡壞死的細(xì)胞仍能恢復(fù)增殖所致。光照后的KR-PGCs細(xì)胞核呈現(xiàn)破碎狀態(tài)，出現(xiàn)凋亡的特征（Cummings and Schnelmann，2021），提示部分細(xì)胞可能通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑被消除。

本研究發(fā)現(xiàn)，綠光照射后極顯著提高了KR-PGCs的死亡率、抑制了其增殖活性并增加了CAS3和SOD2基因的相對(duì)表達(dá)量。CAS3是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，參與多個(gè)細(xì)胞凋亡途徑的調(diào)節(jié)。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，caspase-9作為高度特異性蛋白酶只切割有限的蛋白，而caspase-3和caspase-7參與大部分蛋白的切割（Slee et al.，1999）；KR在綠光照射后能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞色素C/caspase-3信號(hào)通路激活細(xì)胞凋亡（Li et al.，2019）。本研究與Li等（2019）的研究結(jié)果相符，表明KR介導(dǎo)的細(xì)胞自殺體系也能應(yīng)用于內(nèi)源PGCs的消除。超氧化物歧化酶（SOD）是細(xì)胞中主要的抗氧化酶，在清除超氧化物過(guò)程中起重要作用（Miao and Clair，2009），SOD2是SOD家族成員，主要存在于線粒體基質(zhì)中（Slot et al.，1986）。本研究結(jié)果表明，綠光照射12h后，KR-PGCs中SOD2基因相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)，提示KR-PGCs可能產(chǎn)生了氧化損傷，部分細(xì)胞可能通過(guò)抗氧化機(jī)制保護(hù)自身免受KR光毒性效應(yīng)帶來(lái)的損傷。研究表明，caspase-3是有效殺死細(xì)胞的caspase效應(yīng)器，可抑制ROS的產(chǎn)生（Brentnall et al.，2013），在綠光照射12 h后，KR-PGCs中促凋亡的CAS3基因相對(duì)表達(dá)量極顯著升高，可能是綠光照射增強(qiáng)了KR-PGCs的氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡。

利用KR的光毒性效應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已應(yīng)用在光動(dòng)力療法領(lǐng)域（Liu et al.，2021），但利用KR誘導(dǎo)消除受體雞胚內(nèi)源PGCs的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)在生殖細(xì)胞特異性基因DAZL的第11號(hào)外顯子末端插入KR成功構(gòu)建了特異性表達(dá)KR的PGCs細(xì)胞系，且KR的敲入不影響PGCs的正常增殖活性和生殖細(xì)胞特性基因的表達(dá)。證明了充分照射綠光后能有效減少KR-PGCs的數(shù)量，最后對(duì)KR-PGCs進(jìn)行移植獲得PGCs特異性表達(dá)KR的嵌合體公雞，且KR嵌合體公雞能正常產(chǎn)生含KR的精液，為制備PGCs特異性表達(dá)KR的純合子基因編輯雞奠定了基礎(chǔ)。

4結(jié)論

成功構(gòu)建了在DAZL基因位點(diǎn)特異性表達(dá)KR的KR-GCs細(xì)胞系，且綠光照射后可特異性消除KR-PGCs。通過(guò)顯微注射成功獲得了含有KR-PGCs且能產(chǎn)生含KR精液的嵌合體后代。

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（責(zé)任編輯蘭宗寶）