摘 要：來自甜葉菊葉片的萊鮑迪苷D因其高甜度、低熱量被認(rèn)為是理想的天然甜味劑，又因其產(chǎn)量少、相關(guān)合成酶可溶性表達(dá)水平低而限制其應(yīng)用。糖基轉(zhuǎn)移酶SL2能將天然產(chǎn)量高但苦味重的萊鮑迪苷A轉(zhuǎn)化為天然產(chǎn)量低但苦味少的萊鮑迪苷D。本研究克隆番茄來源萊鮑迪苷D相關(guān)合成酶UGTSL2基因，在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行重組表達(dá)，并通過單因素試驗探究提高可溶性重組酶的表達(dá)水平。結(jié)果表明，重組酶在誘導(dǎo)溫度為16 ℃、IPTG濃度為0.05 mmol·L-1、誘導(dǎo)時間為28 h時，在大腸桿菌BL21（DE3）中可溶性表達(dá)量最大。利用高效液相色譜法對反應(yīng)體系進(jìn)行分析，表明重組酶能夠?qū)⑷R鮑迪苷A成功轉(zhuǎn)化為應(yīng)用價值更高的萊鮑迪苷D。研究結(jié)果為后續(xù)可溶性重組酶固定化應(yīng)用合成萊鮑迪苷D奠定良好基礎(chǔ)，也為合成價值更高的萊鮑迪苷M提供前提支持。

關(guān)鍵詞：糖基轉(zhuǎn)移酶；異源表達(dá)；生物轉(zhuǎn)化；萊鮑迪苷D；萊鮑迪苷A

Recombinant Expression of Tomato-Derived Glycosyltransferase UGTSL2 and Optimization of Its Induction Conditions

ZHAN Yiya， XIA Bo

（College of Food Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract： Rebaudioside D from stevia leaves is considered to be an ideal natural sweetener due to its high sweetness and low calorie， and its application is limited due to its low yield and low soluble expression level of related synthetase. Glycosyltransferase SL2 can convert rebaudioside A with high natural yield but heavy bitterness into rebaudioside D with low natural yield but less bitterness. In this study， the UGTSL2 gene related to rebaudioside D from tomato was cloned and expressed in E.coli BL21 （DE3）， and the expression level of soluble recombinase was improved by single factor experiment. The results showed that the soluble expression of the recombinant enzyme in E.coli BL21 （DE3） reached the maximum when the induction temperature was 16 ℃， the IPTG concentration was 0.05 mmol·L-1 and the induction time was 28 h. The analysis of the reaction system by high performance liquid chromatography showed that the recombinant enzyme could successfully convert rebaudioside A into rebaudioside D with higher application value. The research results lay a good foundation for the subsequent application of soluble recombinase immobilization to synthesize rebaudioside D， and also provide premise support for the synthesis of rebaudioside M with higher value.

Keywords： glycosyltransferase; heterologous expression; biotransformation; rebaudioside D; rebaudioside A

人體攝入過多的葡萄糖、果糖、蔗糖等高熱量糖類，易引起肥胖、糖尿病、心腦血管病以及高血壓等病癥[1]。因此，尋找具有低熱量和高甜度特性的天然甜味劑是當(dāng)前主要的研究方向。目前，三氯蔗糖、安賽蜜、阿斯巴甜等人工甜味劑被廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)，雖然這些甜味劑成本低、甜度高，但過量食用會給身體帶來潛在的健康風(fēng)險[2-5]，因此天然甜味劑越來越受到市場青睞。其中甜菊糖苷是天然甜味劑中最受歡迎的一種[6]。甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）是一種南美的灌木，也被稱為“巴拉圭草”[7]。目前，研究者已從甜葉菊中提取出了60余種甜菊糖苷，其中含量最高的是甜菊糖和萊鮑迪苷A（Rebaudioside A，Reb A）[8]，這兩種物質(zhì)也是市面上以“甜菊糖苷”命名的商品甜味劑的主要成分，此外還提取出了萊鮑迪苷D（Rebaudioside D，Reb D）、萊鮑迪苷M（Rebaudioside M，Reb M）以及甜菊雙糖苷等[9]。甜菊糖苷具有高安全性、高甜度和高穩(wěn)定性等優(yōu)點[10-12]，純度不低于95%的甜菊糖苷可以作為甜味劑使用[13]。在多種甜菊糖苷中，Reb D和Reb M相較于市面上已經(jīng)被商品化應(yīng)用的Reb A和甜菊糖而言，具有甜度更高、回苦味更少以及口感更近似于蔗糖的優(yōu)點，因此被認(rèn)為是高熱量糖的更理想替代品，具有更廣闊的應(yīng)用前景和更高的研究價值[14-15]。近年來，一些臨床應(yīng)用研究還證實了甜菊糖苷具有抗糖尿病、降血壓、抗菌等多種保健作用[16]。因其強大的保健價值和甜味劑利用價值，甜菊糖苷的提取方法受到廣泛研究，發(fā)現(xiàn)了多種新型提取及合成甜菊糖苷的方法，促進(jìn)了甜菊糖苷的高效生產(chǎn)[17-18]。

萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的主要合成方法是化學(xué)合成和生物合成[19]。QIAO等[20]通過多種糖基化反應(yīng)的協(xié)同作用，完成了對甜葉菊葉片粗提物中甜菊醇的高效糖基化，成功合成了Reb A、Reb D以及Reb M。然而，化學(xué)法的步驟復(fù)雜且條件要求嚴(yán)苛，在合成過程中難以控制[21]。目前，研究者們側(cè)重于研究用生物酶法催化合成萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M[22-27]。其中，利用糖基轉(zhuǎn)移酶將Reb E轉(zhuǎn)化為Reb D或利用糖基轉(zhuǎn)移酶將Reb A轉(zhuǎn)化為Reb D是合成萊鮑迪苷D的主要方法[28]。由于Reb E在甜葉菊中含量甚微，RebA是甜葉菊中的主要成分之一，因此研究RebA轉(zhuǎn)化Reb D這條路徑更為重要。WANG等[29]通過對甜葉菊基因組和轉(zhuǎn)錄組的分析，鑒定出甜葉菊來源糖基轉(zhuǎn)移酶UGT91D2能將Reb A轉(zhuǎn)化生成RebD。PRAKASH等[30]從番茄中鑒定出番茄來源糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2也能轉(zhuǎn)化Reb A生成Reb D。WANG等[31]在水稻中也鑒定出具有催化Reb A合成Reb D活性的糖基轉(zhuǎn)移酶EGUT11，并實現(xiàn)了酶基因在釀酒酵母系統(tǒng)中的異源重組表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，Reb D合成的相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶的重組表達(dá)都存在可溶性蛋白表達(dá)量低的問題，進(jìn)而影響重組酶在生物合成Reb D的活性，而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用最廣泛的蛋白異源表達(dá)系統(tǒng)，因此，提高Reb D合成相關(guān)酶在大腸桿菌表達(dá)載體中的可溶性蛋白表達(dá)水平對后續(xù)的生物合成研究有重要的作用。

本研究將番茄來源的糖基轉(zhuǎn)移酶SL2基因克隆導(dǎo)入至大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactopyranoside，IPTG）[32]濃度的優(yōu)化，提高重組蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)量。添加以二磷酸尿苷葡萄糖二鈉鹽（Uridine 5’-Diphosphoglucose Disodium Salt，UDP-G）為糖供體，利用重組蛋白將萊鮑迪苷A轉(zhuǎn)化為萊鮑迪苷D，并采用高效液相色譜法驗證重組酶的活性。研究結(jié)果為后續(xù)可溶性重組酶固定化應(yīng)用研究合成萊鮑迪苷D奠定良好基礎(chǔ)，也為合成價值更高的萊鮑迪苷M提供前提支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）；甜菊雙糖苷A標(biāo)準(zhǔn)品、甜菊糖苷D標(biāo)準(zhǔn)品，ChemFaces青島君道生物技術(shù)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（50 mg·mL-1）、氨芐青霉素（100 mg·mL-1）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×），北京天根生化科技有限公司；二磷酸尿苷葡萄糖二鈉鹽，上海麥克林生化科技股份有限公司；PBS磷酸鹽緩沖液（20×）、Tris-硼酸電泳緩沖液（10×），安徽雷根生物技術(shù)有限公司；PBS細(xì)菌蛋白制備裂解液，生工生物工程（上海）股份有限公司；30%Acr-Bic制膠液，北京索萊寶科技有限公司；四甲基乙二胺（TEMED）、磷酸（色譜級），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜級），湖北弗頓科學(xué)技術(shù)有限公司；JY96-IIN超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2生物信息學(xué)分析

采用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）對酶基因及基本信息進(jìn)行檢索，用ExPASy（https：//web.expasy.org/compute_pi/）對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析，SignalP 6.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0）進(jìn)行信號肽預(yù)測，用InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。

1.3 糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2的蛋白表達(dá)與純化

1.3.1 重組糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2的表達(dá)載體構(gòu)建

將檢索得到的糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2基因交由生物公司構(gòu)建克隆載體，該菌株內(nèi)含有插入了目的蛋白基因的質(zhì)粒pGBTNH2-SL2。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取出克隆載體中含有目的基因片段的質(zhì)粒，送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。將5 μL測序正確的質(zhì)粒加入50 μL感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）中，輕彈混勻，冰浴30 min；然后在42 ℃金屬浴中熱擊60～90 s，而后立即冰浴2～3 min，再向離心管中加入500 μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勻后放入37 ℃ 150 r·min-1的搖床中振蕩復(fù)蘇45 min。吸取100 μL菌液涂布于含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)1 d。挑取菌落搖瓶振蕩培養(yǎng)后，取部分菌液送往上海生工進(jìn)行測序。

1.3.2 重組UGTSL2的誘導(dǎo)表達(dá)

將表達(dá)菌株種子液按照3%的接種量轉(zhuǎn)接到20 mL含有氨芐抗性的LB液體中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1.5～2.0 h至OD600達(dá)到0.5～0.6，取出100 μL作為誘導(dǎo)前對照，剩下的加入9.5 μL（0.1 mol·L-1）IPTG，28 ℃振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)16 h。

1.3.3 重組UGTSL2粗酶液的獲取

吸取10 mL含pGBTNH2-SL2的E.coli BL21（DE3）誘導(dǎo)后菌液，4 ℃ 10 000 r·min-1高速離心10 min，除去上清液，獲取菌體；加入10 mL PBS細(xì)胞裂解液重懸胞體，冰浴條件下超聲波破碎20 min（250 W、工作2 s、間隙6 s）；破碎后的液體在4 ℃ 條件下以12 000 r·min-1高速離心10 min，收集上清液，獲取粗酶液，用于后續(xù)可溶性蛋白表達(dá)量分析和活性檢測。

1.3.4 重組UGTSL2的可溶性蛋白表達(dá)量分析

將粗酶液樣品以及經(jīng)過煮沸的誘導(dǎo)前全菌液對照分別與上樣緩沖液（5×）按照4∶1的體積比混合，微速離心后采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl SulfatePolyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）的方法觀察洗脫蛋白的分子質(zhì)量大小和純度，其中分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%[33]。

1.4 重組UGTSL2的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

1.4.1 誘導(dǎo)溫度對重組UGTSL2可溶性表達(dá)量的影響

按照1.3.2的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，加入相同濃度誘導(dǎo)劑（0.10 mmol·L-1）后分別在16、28、37 ℃和42 ℃下100 r·min-1誘導(dǎo)16 h，按照1.3.4進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.4.2 誘導(dǎo)時間對重組UGTSL2可溶性表達(dá)量的影響

按照1.3.2的方法進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在誘導(dǎo)劑濃度為0.10 mmol·L-1、誘導(dǎo)溫度為16 ℃條件下，分別誘導(dǎo)8、12、16、20、24 h和28 h，按照1.3.4進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.4.3 IPTG濃度對重組UGTSL2可溶性表達(dá)量的影響

按照1.3.2的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，然后分別加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.05、0.10、0.50、0.75 mmol·L-1和1.00 mmol·L-1，在16 ℃ 100 r·min-1條件下誘導(dǎo)16 h，按照1.3.4進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.5 重組UGTSL2活性檢測及產(chǎn)物測定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別稱取萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷D適量，加入30%乙腈水溶液超聲溶解，制成2 mg·mL-1和1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液[34]。萊鮑迪苷A設(shè)置梯度0.4、0.8、1.2、1.6 mg·mL-1和2.0 mg·mL-1，萊鮑迪苷D設(shè)置梯度0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1和1.0 mg·mL-1，采用高效液相色譜法分別檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 色譜條件

色譜柱采用十八烷基鍵合硅膠填充柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水體積比（30∶70）；柱溫40 °C；流速1.0 mL·min-1；檢測波長為210 nm[35]。

1.5.3 重組UGTSL2活性檢測

在500 μL Reb A標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入200 μL UDPG溶液，然后加入800 μL重組蛋白粗酶液，最后用PBS磷酸緩沖液（1×）補齊體系至2 mL，對照組添加滅活酶液，置于37 ℃ 150 r·min-1下振蕩反應(yīng)24 h，煮沸10 min終止反應(yīng)后在4 ℃下10 000 r·min-1高速離心10 min，收集上清液過膜（0.22 μm），按照1.5.2的儀器條件進(jìn)行高效液相色譜法檢測。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)進(jìn)行3次。實驗數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 9.0軟件和Origin2021軟件進(jìn)行處理分析，并可視化數(shù)據(jù)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組UGTSL2的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

由生物信息學(xué)網(wǎng)站檢索查閱得知，重組UGTSL2基因編碼442個氨基酸，分子質(zhì)量約為51.7 kDa。重組酶在E.coli BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，誘導(dǎo)后的上清液、沉淀、全菌液均在57 kDa附近出現(xiàn)了特征條帶，這與預(yù)期的目的蛋白分子量大小一致，且在未誘導(dǎo)泳道對應(yīng)位置未出現(xiàn)UGTSL2對應(yīng)特征條帶，說明重組蛋白在表達(dá)菌株中成功實現(xiàn)了可溶性表達(dá)，且存在一定量的包涵體表達(dá)。

2.2 重組UGTSL2誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

2.2.1 誘導(dǎo)溫度對重組UGTSL2可溶性表達(dá)量的影響

如圖2所示，可以看出高溫和低溫都不利于外源基因在原核載體中的可溶性表達(dá)，溫度過高會導(dǎo)致表達(dá)速度過快而使肽鏈錯誤折疊，無法合成結(jié)構(gòu)正確的具有活性的目的蛋白，且溫度高細(xì)菌生長速度快，發(fā)酵過程中代謝物大量積累，從而抑制細(xì)菌的生長與目的蛋白表達(dá)[36]；溫度過低會導(dǎo)致表達(dá)速度過慢，使得肽鏈在細(xì)胞中的游離時間過長或被降解，也會使可溶性蛋白表達(dá)量不足；因此合適的溫度能使菌株在適宜的合成速度內(nèi)表達(dá)出正確折疊的具有活性的蛋白質(zhì)，圖中可以看出重組酶在16 ℃時具有最大可溶性表達(dá)量。

2.2.2 誘導(dǎo)時間對重組UGTSL2可溶性表達(dá)量的影響

誘導(dǎo)時間也是影響外源蛋白表達(dá)水平的因素之一，誘導(dǎo)時間太短會導(dǎo)致目的蛋白的表達(dá)量太少，而誘導(dǎo)時間太長又會導(dǎo)致蛋白的消解或包涵體的形成，同時時間太長會使菌株老化導(dǎo)致合成效率降低，因此需要選擇目的蛋白適合的誘導(dǎo)時間，使得蛋白表達(dá)水平達(dá)到最大化。由圖3可以看出，隨著誘導(dǎo)時間的延長，細(xì)胞破碎上清液中的目的蛋白濃度逐漸增大，在28 h達(dá)到最大表達(dá)水平。

2.2.3 IPTG濃度對重組UGTSL2可溶性表達(dá)量的影響

高濃度的IPTG會使得細(xì)胞表達(dá)速度過快，細(xì)胞內(nèi)蛋白含量太高，使得已經(jīng)折疊的和來不及折疊的蛋白分子聚集成團(tuán)，產(chǎn)生不具生物活性的包涵體，影響蛋白質(zhì)量。但I(xiàn)PTG的濃度太低會使得誘導(dǎo)劑不足以達(dá)到與lac阻遏蛋白結(jié)合的飽和濃度，從而無法啟動目的蛋白的轉(zhuǎn)錄[37]。由圖4可知，重組UGTSL2在E.coli BL21（DE3）中的可溶性表達(dá)不宜在高濃度誘導(dǎo)劑條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，在0.05 mmol·L-1的條件下達(dá)到最大表達(dá)量，而隨著IPTG濃度增大，蛋白可溶性表達(dá)量逐漸變少。

2.3 重組UGTSL2的活性檢測

由圖5、圖6、圖7可知，Reb A在1.5.2的反應(yīng)體系中與重組UGTSL2粗酶液作用24 h后，有新物質(zhì)生成，新物質(zhì)的出峰時間在4 min左右，這與Reb D標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間一致，因此可以判定重組UGTSL2成功將Reb A轉(zhuǎn)化成為Reb D，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線（Reb A：y=1 645 453x+53 524，R2=0.999 5；Reb D：y=1 430 880x+60 116，R2=0.999 2）計算得出，轉(zhuǎn)化率為21.8%。

3 結(jié)論

Reb D具有低熱量、高甜度、少苦味的優(yōu)點，且作為當(dāng)前研究熱點Reb M的合成前體，在天然甜味劑領(lǐng)域具有很高的研究價值，因其天然含量低、相關(guān)合成酶研究不夠充分，使其工業(yè)化生產(chǎn)受到限制。本文成功將含有糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)載體在大腸桿菌BL21（DE3）中實現(xiàn)可溶性表達(dá)，并通過單因素分析確定最佳誘導(dǎo)條件，即16 ℃、IPTG濃度為0.05 mmol·L-1時誘導(dǎo)28 h能獲得最大的可溶性重組酶表達(dá)量，并通過高效液相色譜法驗證該條件下表達(dá)的粗酶液能夠?qū)eb A轉(zhuǎn)化為Reb D，初步轉(zhuǎn)化率達(dá)到21.8%。后續(xù)的研究將致力于對轉(zhuǎn)化率的進(jìn)一步提升，以及對該酶的進(jìn)一步改造及應(yīng)用探究，為實現(xiàn)Reb D的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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